一种促进心梗心肌修复的细胞分泌因子及应用

技术领域

本发明属于生物技术和药物学领域，更具体地，本发明涉及一种促进心梗心肌修复的细胞分泌因子及应用。

背景技术

心血管疾病是当今威胁人类健康最严重的疾病之一。在心血管疾病当中，缺血性心脏病(Ischemic Heart Disease，IHD)毫无疑问是最严峻的问题。缺血性心脏病以心肌对氧和能量物质的需求与冠状动脉血流供应不平衡而导致的心肌缺血性损伤为主要特征。急性心肌梗死(心梗)通常是由于冠状动脉的突然堵塞，导致血流断供，造成心肌层的缺血。持续的缺血导致大量心肌细胞死亡，由于成体心肌细胞缺乏再生能力，死亡的心肌细胞无法得到有效的补充，从而导致成纤维细胞的增殖则导致过度的纤维化和疤痕形成，发生心室重塑，心功能下降。

如何为缺血的心肌重建血供，是解决心肌梗死的关键问题，在临床上通过药物溶栓、搭桥等手段，能够重新实现缺血部位的血液供应，有效地缩小心梗面积，提高长期的心功能，降低死亡率。然而研究表明缺血心脏恢复血供的过程中，会对心脏造成新的损伤，它与缺血所造成的损伤一起统称缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)损伤。

心肌梗死是在冠状动脉病变的基础上，发生冠脉供血急剧减少或者中断，进而导致冠脉供应部位的心肌发生急性和持久性的心肌缺血，导致严重的细胞能量代谢障碍，引起大量心肌细胞受损和死亡。由于心肌细胞为终末分化的细胞，再生能力十分有限，丢失的心肌细胞由纤维疤痕替代，导致不可逆心肌损伤，严重者出现心律失常、室壁瘤形成、心脏破裂等。心力衰竭是各种心脏疾病导致心功能不全的一种复杂的临床症状群；绝大多数情况下是指心肌收缩力下降，使心排血量不能满足机体代谢需要，器官组织血液灌注不足。

心肌缺血损伤后心肌细胞的死亡方式，主要包括细胞自噬、凋亡、焦亡、铁死亡以及坏死等。其中坏死被认为是心梗导致心肌细胞死亡的主要类型。缺血损伤导致死亡的心肌细胞约30％死于细胞凋亡，70％死于坏死。进一步研究发现细胞中存在一种不同于凋亡及传统坏死细胞的死亡方式，这个过程具备典型的坏死样形态学特征，如膜完整性缺损和引发炎症，但其过程受到一系列分子严格调控，称之为程序性坏死。心梗后发生程序性坏死的细胞约占坏死细胞比例的50％。死亡受体被激活是程序性坏死发生的主要机制。肿瘤坏死因子受体(Tumor Necrosis Factor Receptor，TNFR)介导的受体相互作用蛋白激酶1(Receptor Interacting Protein kinase 1，RIP1)和RIP3激活的调控是死亡受体依赖细胞程序性坏死的主要特征。TNFR激活促进RIP1的二聚化激活，激活的RIP1被PELI1泛素化后与RIP3形成复合物，招募混合谱系激酶域样蛋白(mixed lineage kinase domain-likeprotein，MLKL)，并执行程序性坏死过程。

鉴于发生心肌梗死的广泛性以及多发性，本领域亟待寻找更多的缓解心肌梗死及其发生后的症状的新方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进心梗心肌修复的细胞分泌因子及应用。

在本发明的第一方面，提供一种胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)或其上调剂在制备药物或组合物中的应用，所述药物或组合物具有以下功能：促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、减轻心肌缺血损伤。

在一种或多种实施方式中，所述促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后心功能、保护心肌缺血损伤包括：减少心肌梗死后的心梗区面积；缩小心肌梗死后的纤维疤痕面积；增加心肌梗死后的心梗区与心梗边缘区血管数量；促进心肌细胞抵抗损伤；抑制心肌梗死后的程序性坏死，较佳地通过抑制细胞程序性坏死RIP1/RIP3信号通路的激活、进而抑制损伤心肌细胞程序性坏死。

在一种或多种实施方式中，所述胰岛素样生长因子结合蛋白7的上调剂包括选自下组：(a)增强胰岛素样生长因子结合蛋白7活性的物质；(b)增强胰岛素样生长因子结合蛋白7的表达、稳定性或有效作用时间的物质。

在一种或多种实施方式中，所述胰岛素样生长因子结合蛋白7的上调剂包括选自：重组表达胰岛素样生长因子结合蛋白7的表达构建物(包括表达载体)，增强胰岛素样生长因子结合蛋白7对细胞程序性坏死RIP1(Receptor Interacting Protein Kinase 1)/RIP3信号通路抑制作用的多肽或化合物，胰岛素样生长因子结合蛋白7的化学上调剂，促进胰岛素样生长因子结合蛋白7基因启动子驱动能力的上调剂，胰岛素样生长因子结合蛋白7基因特异性microRNA的下调剂，或其组合。

在一种或多种实施方式中，所述的胰岛素样生长因子结合蛋白7选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；(b)将(a)所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1～20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有(a)或(b)多肽功能的胰岛素样生长因子结合蛋白7衍生物，或其活性片段；(c)序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥80％(如同源性≥85％，≥90％，≥95％，≥98％或≥99％)的胰岛素样生长因子结合蛋白7衍生物，或其活性片段。

在一种或多种实施方式中，所述的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。

在一种或多种实施方式中，所述的抑制细胞程序性坏死RIP1/RIP3信号通路包括抑制RIP3。

在一种或多种实施方式中，所述的抑制RIP3包括：以IGF非依赖的方式降低RIP3mRNA稳定性，进而抑制心梗后心肌细胞程序性坏死。

在本发明的另一方面，提供胰岛素样生长因子结合蛋白7的应用，用于筛选药物或化合物(即作为筛药靶点)，所述药物或化合物具有以下功能：促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤。

在本发明的另一方面，提供一种筛选促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤的药物或化合物(或潜在的药物或化合物)的方法，包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达胰岛素样生长因子结合蛋白7；和，(2)检测所述体系中胰岛素样生长因子结合蛋白7的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高胰岛素样生长因子结合蛋白7的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。

在一种或多种实施方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；和/或，步骤(2)包括：检测所述体系中胰岛素样生长因子结合蛋白7的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)胰岛素样生长因子结合蛋白7的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。

在一种或多种实施方式中，步骤(1)所述的体系中，还包括细胞程序性坏死RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3；以及，步骤(2)还包括：检测所述体系中胰岛素样生长因子结合蛋白7与所述细胞程序性坏死RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3的相互作用情况，若胰岛素样生长因子结合蛋白7抑制(如抑制20％以上，较佳的抑制50％以上；更佳的抑制80％以上)所述细胞程序性坏死RIP1/RIP3(尤其抑制RIP3)信号通路或通路蛋白RIP3，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。

在一种或多种实施方式中，所述的包括细胞程序性坏死RIP1/RIP3信号通路的体系中，所述IGFBP7作用于RIP3。

在一种或多种实施方式中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对胰岛素样生长因子结合蛋白7、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的过表达分子如构建体，活性促进分子，化学小分子，相互作用分子等。

在一种或多种实施方式中，所述方法还包括：对获得的药物或化合物(潜在药物或化合物)进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护(减缓)心肌缺血损伤有用的组合物。

在本发明的另一方面，提供特异性识别或扩增胰岛素样生长因子结合蛋白7的试剂的用途，用于制备评估或预后心肌梗死后疾病进展的试剂或试剂盒。

在一种或多种实施方式中，若所述胰岛素样生长因子结合蛋白7低表达(即：表达低于该物种群体的平均值或常规值)，表明受试者心肌梗死后预后不佳(相对差)。

在一种或多种实施方式中，所述胰岛素样生长因子结合蛋白7正常表达或高表达(即：表达等于、相当于或高于该物种群体的平均值或常规值；其中所述高于例如高5％、10％、15％、20％、30％、50％、60％、80％、90％以上或更高)，表明受试者心肌梗死后预后正常或好(相对较好)。

在一种或多种实施方式中，所述的试剂包括(但不限于)：特异性结合胰岛素样生长因子结合蛋白7的结合分子；特异性扩增胰岛素样生长因子结合蛋白7基因的引物；特异性识别胰岛素样生长因子结合蛋白7基因的探针；或特异性识别胰岛素样生长因子结合蛋白7基因的芯片。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、人IGFBP7结构域。

图2、IGFBP7在人类各器官中的分布及在小鼠心肌和成纤维中的表达及定位。

(A)人体不同组织中IGFBP7的表达情况，其中心脏是唯一表达IGFBP7的肌肉组织(数据源于ProteomicsDB数据库)；(B)成年小鼠心肌细胞的免疫荧光染色显示心肌细胞中IGFBP7分布广泛，无明显定位偏好；成纤维细胞中，IGFBP7呈点状分布，部分与vimentin阳性的点状共定位(白色箭头)；(C)WB结果显示，IGFBP7的表达在成年小鼠心肌细胞中显著高于成年小鼠成纤维细胞。比例尺＝50μm。

图3、IGFBP7在hCVPCs上清及心梗小鼠心脏组织中的表达。

(A)抗体芯片结果CVPC-CdM中IGFBP7的含量远高于对照的DMEM；(B)Elisa验检测hCVPC-CdM中IGFBP7的含量；(C)WB结果显示心梗小鼠心脏组织中IGFBP7蛋白水平逐渐上升，n＝3；(D)QPCR结果显示心梗小鼠心脏组织中IGFBP7 mRNA水平持续上升，n＝6；(E)Elisa检测心梗小鼠血清中的IGFBP7水平，心梗后同样呈上升趋势，n＝5。***p<0.001vs.正常组。

图4、IGFBP7心肌特异性敲除加剧心梗后心肌损伤。

(A)IGFBP7

图5.心肌注射IGFBP7显著改善心梗小鼠心功能，缩小纤维疤痕面积。

(A)心梗手术小鼠生存曲线；(B)小鼠心功能指标，IGFBP7心梗后1周即可明显改善心功能，左室射血分数(LVEF)；(C-D)疤痕区Masson染色图及统计图，n＝10；(E)IGFBP7心肌注射显著减少小鼠心梗区Tunel阳性细胞的数量，n＝5；(F)IGFBP7心肌注射显著增加小鼠心梗区心梗边缘区血管数量，n＝5*p<0.05，**p<0.01。

图6、心肌注射IGFBP7显著改善心梗小鼠心功能，缩小纤维疤痕面积。

(A)模式图；(B)小鼠心功能指标，IGFBP7心梗后7、14、28均可检测到明显心功能改善，左室射血分数(LVEF)；(C)疤痕区Masson染色图及统计图，n＝10。*p<0.05。

图7、IGFBP7保护成年小鼠心肌细胞抵抗损伤。

(A)成年小鼠心肌细胞OGD损伤前后形态学，IGFBP7处理的组，杆状细胞比例显著高于OGD对照组，加入NBI31772的组同样显著高于OGD对照组，但与IGFBP7组无差异；(B)各组杆状细胞比例统计结果，n＝6；(C)LDH释放情况检测，n＝5；(D)野生型与IGFBP7敲除小鼠心肌细胞OGD损伤前后形态学；(E)WT、KO杆状细胞比例统计，n＝5。*p<0.05。比例尺：200μm。

图8、IGFBP7抑制心脏组织中RIP3蛋白水平。

心梗后3天的心脏组织样本中，RIP3蛋白表达情况，n＝3。***p<0.001。

图9、IGFBP7显著抑制RIP3 mRNA水平。

心梗后3天的心脏组织样本中，RIP3 mRNA水平检测，n＝8-10。**p<0.01，***p<0.001。

图10、IGFBP7降低RIP3 mRNA稳定性。

利用放线菌素D(10ug/mL)处理成年小鼠心肌细胞，0h、1h、3h、6h、8h检测RIP3mRNA水平，n＝5。*p<0.05。

具体实施方式

本发明人在深入研究的基础上，首次揭示一种胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤的组合物或药物中的应用。也可基于IGFBP7的上述功能，抑制为筛药靶点，筛选促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤的物质。

IGFBP7

IGFBPs家族是一类分泌蛋白，其N端存在保守的IGFBP基序，通过与胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I，IGF-I)和IGF-II形成复合物对IGFs代谢和生物活性起关键作用。目前已知IGFBPs家族有7个成员，其功能和参与的生物学过程存在差异，其中IGFBP1-3、6多参与肥胖相关疾病代谢和肿瘤的调控。IGFBP7是最新发现的IGFBPs家族成员，结构上除具有与IGFBP1-6相似的保守N端结构域外，还有特异的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制结构域和免疫球蛋白样C2结构域，其与IGFs的结合能力远低于其他IGFBPs，提示IGFBP7存在不同于其他IGFBPs的作用和作用方式。目前研究发现IGFBP7除调控IGFs和胰岛素的生物利用度外，还参与调控乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞增殖、分化、细胞衰老和凋亡等生物学过程，但其确切作用尚存在争议，在特定的组织、细胞类型和环境可能发挥不同的作用。如在调控衰老研究中，Wajapeyee等发现人黑色素瘤细胞和成纤维细胞中原癌基因BRAF(B-Raf Proto-Oncogene)激活通过上调IGFBP7合成和分泌抑制BRAF-MEK-ERK信号通路，诱发细胞衰老和凋亡。Scurr等则证明BRAF信号既不能诱导IGFBP7表达，也不影响BRAF靶基因表达；在血管新生调控方面，IGFBP7在恶性胶质瘤血管内皮细胞中高表达，促进内皮细胞增殖和血管新生。有研究发现IGFBP7通过抑制血管内皮生长因子表达抑制正常血管内皮细胞增殖和血管生成。IGFBP7在心梗心肌、心肌缺血/再灌注过程中的作用及对损伤心肌细胞的作用均未报道。

本发明所述IGFBP7可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的IGFBP7也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组IGFBP7，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的IGFBP7。所述的IGFBP7包括全长的IGFBP7或其生物活性片段。优选的，所述的IGFBP7的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。根据IGFBP7的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列，例如其可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。来自其它物种的与该IGFBP7具有同源性的蛋白也可被包含在本发明中。

经过一个或多个(如1-30个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的IGFBP7的氨基酸序列也包括在本发明中。IGFBP7或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。

分离自IGFBP7的生物活性片段也可以应用到本发明中。在这里，IGFBP7的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的IGFBP7的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长IGFBP7的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长IGFBP7的60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的IGFBP7，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的IGFBP7。所述经过修饰或改良的IGFBP7可以是一种IGFBP7的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的IGFBP7可以是与天然存在的IGFBP7具有较小的共同点，但也能促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能，更具体包括：缩小心肌梗死后的纤维疤痕面积、减少心肌梗死后的心梗区面积、增加心肌梗死后的心梗边缘区血管数量、促进心肌细胞抵抗损伤、抑制心肌梗死后的程序性坏死。

如本发明所用，所述的“心肌梗死”或“心梗”可互换使用。

IGFBP7、其参与的信号通路及其调节剂的应用

在本发明人的研究工作中，发现心血管前体细胞(cardiovascular progenitorcells，hCVPCs)分泌高丰度的IGFB7因子，并证明了IGFBP7促进心梗后心肌修复的作用。具体地，IGFBP7能够保护心梗动物的心功能、缩小心肌梗死后纤维疤痕，促进缺血损伤心肌修复。对其进行机理研究发现，其作用机制至少部分通过以IGF非依赖的方式降低RIP3 mRNA稳定性，进而抑制心梗后心肌细胞程序性坏死。

基于本发明人的新发现，本发明提供了IGFBP7或其上调剂的应用，用于制备促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤的组合物或药物；具体地包括：缩小心肌梗死后的纤维疤痕面积、减少心肌梗死后的心梗区面积、增加心肌梗死后的心梗边缘区血管数量、促进心肌细胞抵抗损伤、抑制心肌梗死后的程序性坏死。本发明也提供了IGFBP7作为靶点的应用，用于筛选抑制上述疾病或症状的物质。

如本文所用，所述的IGFBP7的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高IGFBP7的活性、维持IGFBP7的稳定性、促进IGFBP7的表达、促进IGFBP7的分泌、延长IGFBP7有效作用时间、或促进IGFBP7的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为具有上调功能的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的IGFBP7的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)IGFBP7的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码IGFBP7的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，IGFBP7多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生IGFBP7。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括(但不限于)：腺相关病毒，慢病毒载体，腺病毒载体等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含IGFBP7的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-20wt％；较佳的0.00001-10wt％)的所述的IGFBP7、或其上调剂(如过表达该IGFBP7的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的IGFBP7、或其上调剂(如过表达该IGFBP7的表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的IGFBP7或其上调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的IGFBP7或其上调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的IGFBP7或其上调剂每天以约0.00001mg-10mg/kg动物体重的剂量给予，能得到令人满意的效果

本发明的IGFBP7或其上调剂、或其类似物的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的IGFBP7或其上调剂可通过局部组织注射的方式给予，优选地为心肌注射。此外，其它方式的注射也是可以的，例如包括但不限于腹腔注射、静脉注射、口服、皮下注射、脊髓鞘内注射、皮内注射等的方式给予动物。

在得知了所述的IGFBP7的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的IGFBP7或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将IGFBP7通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带IGFBP7基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的IGFBP7。

作为本发明的一种实施方式，可将所述的IGFBP7直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码IGFBP7的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述IGFBP7的细胞中，使所述的细胞表达IGFBP7。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现IGFBP7的表达。

IGFBP7的上调剂或类似物的给药方式主要取决于所述上调剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。

IGFBP7作为药物筛选靶点

在得知了所述的IGFBP7的功能和作用机制后，可以基于该特征来筛选促进IGFBP7的表达或活性的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达IGFBP7的体系接触；和检测候选物质对IGFBP7的影响；若所述候选物质可提高IGFBP7的表达或活性或分泌，则表明该候选物质是可用于促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤。

本发明中的机理机制研究中，也发现IGFBP7处理后程序性坏死的关键蛋白执行蛋白RIP3的表达显著降低，IGFBP7对RIP3的抑制包括转录水平的调控。基于这一新发现，在本发明的优选方式中，所述的体系中还包括：细胞程序性坏死RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3。并且所述方法还包括：检测所述体系中胰岛素样生长因子结合蛋白7与所述细胞程序性坏死RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3的相互作用情况，若胰岛素样生长因子结合蛋白7抑制所述细胞程序性坏死RIP1/RIP3(尤其抑制RIP3)信号通路或通路蛋白RIP3，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到IGFBP7及其所参与的信号通路蛋白或其上下游蛋白的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达IGFBP7、RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3的体系。

所述的表达体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达IGFBP7、RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3的细胞；或可以是重组表达IGFBP7、RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3的细胞。所述的表达IGFBP7、RIP1/RIP3信号通路或通路蛋白RIP3的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于发挥本发明所主张的功能等真正有用的物质。

本发明对于IGFBP7的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤等真正有用的物质，从而用于临床。

IGFBP7作为诊断靶点

基于本发明人的上述新发现，可以将IGFBP7作为评估/预后心肌梗死后疾病进展的标志物：(i)进行心肌梗死后疾病的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的心肌梗死后的治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群的疾病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由IGFBP7基因表达异常而高危的人群，从而可进行更有针对性地预防或治疗。

因此，本发明提供了IGFBP7的用途，用于制备评估或预后心肌梗死后疾病进展的试剂或试剂盒。

可采用各种本领域已知的技术来检测IGFBP7基因的存在与否、表达情况、表达水平或活性，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了用于在分析物中检测IGFBP7基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增IGFBP7的引物；或特异性识别IGFBP7的探针来确定IGFBP7基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合IGFBP7编码的蛋白的抗体或配体来确定IGFBP7蛋白的表达情况。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出IGFBP7基因或基因片段。针对IGFBP7基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与IGFBP7基因上特定位点发生特异性结合，而不与IGFBP7基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。此外，利用特异性结合IGFBP7蛋白的抗体来检测分析物中IGFBP7蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。

本发明还提供了用于在分析物中检测IGFBP7基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增IGFBP7基因的引物；特异性识别IGFBP7基因的探针；或特异性结合IGFBP7蛋白的抗体或配体。

所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

序列信息

人IGFBP7 CDS序列(SEQ ID NO:2)：

atggagcggccgtcgctgcgcgccctgctcctcggcgccgctgggctgctgctcctgctcctgcccctctcctcttcctcctcttcggacacctgcggcccctgcgagccggcctcctgcccgcccctgcccccgctgggctgcctgctgggcgagacccgcgacgcgtgcggctgctgccctatgtgcgcccgcggcgagggcgagccgtgcgggggtggcggcgccggcagggggtactgcgcgccgggcatggagtgcgtgaagagccgcaagaggcggaagggtaaagccggggcagcagccggcggtccgggtgtaagcggcgtgtgcgtgtgcaagagccgctacccggtgtgcggcagcgacggcaccacctacccgagcggctgccagctgcgcgccgccagccagagggccgagagccgcggggagaaggccatcacccaggtcagcaagggcacctgcgagcaaggtccttccatagtgacgccccccaaggacatctggaatgtcactggtgcccaggtgtacttgagctgtgaggtcatcggaatcccgacacctgtcctcatctggaacaaggtaaaaaggggtcactatggagttcaaaggacagaactcctgcctggtgaccgggacaacctggccattcagacccggggtggcccagaaaagcatgaagtaactggctgggtgctggtatctcctctaagtaaggaagatgctggagaatatgagtgccatgcatccaattcccaaggacaggcttcagcatcagcaaaaattacagtggttgatgccttacatgaaataccagtgaaaaaaggtacacaataa

人IGFBP7氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MERPSLRALLLGAAGLLLLLLPLSSSSSSDTCGPCEPASCPPLPPLGCLLGETRDACGCCPMCARGEGEPCGGGGAGRGYCAPGMECVKSRKRRKGKAGAAAGGPGVSGVCVCKSRYPVCGSDGTTYPSGCQLRAASQRAESRGEKAITQVSKGTCEQGPSIVTPPKDIWNVTGAQVYLSCEVIGIPTPVLIWNKVKRGHYGVQRTELLPGDRDNLAIQTRGGPEKHEVTGWVLVSPLSKEDAGEYECHASNSQGQASASAKITVVDALHEIPVKKGTQ

人IGFBP7结构域如图1。

实施例1、IGFBP7的获得

本发明人利用细胞因子芯片分析心血管前体细胞(cardiovascular progenitorcells，hCVPCs)分泌谱，发现hCVPCs至少分泌500多种因子，包括细胞生长因子、趋化因子、炎症反应因子等。

经过大规模的研究分析，本发明人发现hCVPCs所分泌的因子中，胰岛素样生长因子结合蛋白7(Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7，IGFBP7)在hCVPCs条件培养液中的存在情况较对照组的升高幅度超过500倍，初步研究提示其可能是hCVPCs发挥心肌修复作用的重要效应因子。

实施例2、IGFBP7抑制缺血损伤心肌细胞程序性坏死研究

(一)动物模型

IGFBP7心肌特异敲除(IGFBP7

利用Cas9/RNA system gene targeting技术，构建针对小鼠Igfbp7基因的gRNA，指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切DNA双链；同时，制作携带靶位点同源臂及条件性敲除元件的Donor vector，与Cas9system共同注射，在Cas9 system切开DNA链后通过同源重组将loxp元件重组到靶位点3号外显子两侧，得到igfbp7 flox小鼠。该小鼠与myh6-Cre小鼠交配后，通过他莫昔芬诱导可诱导igfbp7敲除。

小鼠心肌梗死模型：雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液麻醉(45mg/kg)，小鼠固定后左前胸脱毛，呼吸机插管。剑突上1cm处胸部左侧开胸，打开2-3肋间，横向放入扩胸器，充分撑开肋间，暴露心脏。使用活结结扎冠状动脉左前降支，成功结扎血管后可见心脏左心室部位变白，心电图ST段抬升。

氧糖剥夺(OGD)损伤模型：利用低氧/厌氧工作站在新生大鼠心肌细胞上建立氧糖剥夺模(oxygen sugar deprivation，OGD)损伤模型。工作站参数设置：低氧模式氧气浓度小于0.1％，二氧化碳5％。低氧处理过程中细胞培液为缺血液常氧对照组始终处于正常培养液并于培养箱中培养。对于细胞损伤测定，细胞无氧处理1小时。

(二)细胞实验设计

细胞制备

分离成年野生型、IGFBP7心肌特异敲除(IGFBP7

IGFBP7过表达腺病毒(Ad-IGFBP7)的制备：采用Lipofectamine 2000作为转染试剂，在293A细胞中共表达pAd-igfbp7质粒和腺病毒骨架质粒质。培养5-7天后观察细胞，确认病毒克隆的形成，约12天后，克隆中心细胞被裂解形成病斑，吸取病斑中的病毒液，再加到500μL DMEM中，此病毒为初级的病毒。将293A细胞以铺于100mm培养皿中，加入100μL初级病毒感染细胞。在感染后的2-3天通常就可以看到明显的细胞裂解现象。在三分之一到一半左右细胞漂浮时(通常是感染后3-5天)收集病毒。轻轻将细胞刮下，转移到15mL离心管中，在液氮中冻细胞，然后37℃水浴中融化，剧烈振荡。此步骤反复进行3次。6000转4℃离心5分钟后，取上清液保存。注意保存时不要反复冻融，可保存于-20℃；为进一步扩增腺病毒，将上一步获得的病毒上清再次感染100mm培养皿的细胞，同样操作，收集病毒，并可以进一步感染150mm细胞培养皿中的293A细胞，以此来获得足够量的病毒。

上述重组的腺病毒感染心肌细胞，获得过表达IGFBP7的重组心肌细胞。

检测指标

对于细胞损伤测定，细胞低氧处理1小时，检测细胞形态学、乳酸脱氢酶(LDH)释放、ATP合成、线粒体膜电位，评价细胞损伤。

(二)动物实验设计

1、实验动物

8-12周的C57BL6 WT小鼠；

8-12周的IGFBP7

实验分组：

a：假手术+溶剂组；

b：手术组+溶剂组；

c：手术组+IGFBP7(1ng/kg)；

d：手术组+IGFBP7(30ng/kg)。

2、检测指标：

(1)存活率：检测a、b、c、d组小鼠的存活率；

(2)心功能超声：分别在手术后2、7、14和28天进行心功能超声检测左室射血分数(LVEF)；

(3)疤痕面积：心肌组织采用OCT包埋后切片用Masson染色评价纤维疤痕面积；

(4)心肌细胞凋亡：心肌组织采用OCT包埋后切片用TUNEL染色评价损伤心肌细胞凋亡情况；

(5)血管形成：心肌组织采用OCT包埋后切片用a-SMA染色评价心梗区及边缘区血管形成情况；

(6)收取心肌组织样本抽提RNA以及蛋白质、基因表达情况检测以及后续实验。

实施例3、IGFBP7在心肌细胞中的表达

为揭示IGFBP7的心脏保护作用，首先要明确IGFBP7在心脏中的表达情况，数据库(ProteomicsDB)高通量分析显示，正常人体许多组织IGFBP7均有较稳定的表达(图2A，黄色为心脏)，肌肉组织只有心脏中有表达。成年小鼠心肌细胞和成纤维细胞免疫荧光染色发现，心肌细胞中IGFBP7呈泛分布(图2B)，而在成纤维细胞中，呈点状分布，且部分与波形蛋白(vimentin)存在共定位(图2B)。

Western blot结果显示，IGFBP7的表达在心肌细胞中显著高于成纤维细胞(图2C)。

实施例4、IGFBP7在心梗中表达上调

抗体芯片结果显示，IGFBP7是hCVPCs高分泌的因子(图3A)，Elisa检测hCVPCs条件培养液(CdM)中IGFBP7的含量(图3B)。

利用小鼠心肌梗死模型，收取心梗小鼠心脏组织和血清的时程样本，检测心梗发生后IGFBP7表达的变化。结果发现，心梗后一周内，IGFBP7的表达呈持续上升趋势(图3C-图3E)，提示它在心梗发生及后续发展过程中发挥重要作用。

实施例5、IGFBP7心肌特异性敲除加剧心梗后心肌损伤

诱导敲除的IGFBP7

但是，心梗手术后，IGFBP7

实施例6、人重组蛋白IGFBP7因子心肌注射改善心梗小鼠心功能、缩小疤痕面积

利用小鼠心梗模型(MI)，开展人重组蛋白IGFBP7心肌注射实验，评价其对心功能的影响。采用1ng/kg、30ng/kg两种剂量的因子，心梗手术的同时心肌注射IGFBP7，并在之后的一周内按照2.4ug/kg/天持续皮下注射IGFBP7，2、7、14和28天检测小鼠心功能，4周评价心梗面积(图5A、B)。

结果显示，心肌注射IGFBP7，不影响手术小鼠的存活率(图5B)，注射1周后可显著改善小鼠心功能(图5C)，并且显著缩小纤维疤痕面积(图5D)。

通过TUNEL染色评价心肌细胞凋亡情况发现，IGFBP7心肌注射显著减少小鼠心梗区Tunel阳性细胞的数量(图5E)。

a-SMA染色结果显示，IGFBP7心肌注射组小鼠心梗区心梗边缘区血管数量增加(图5F)。

实施例7、IGFBP7抗体中和削弱hCVPCs的心肌修复作用

利用小鼠心梗模型，开展IGFBP7抗体中和实验(图6A)，术后2、14和28天检测小鼠心功能，28天评价心梗面积。

结果显示，IGFBP7抗体可削弱hCVPCs保护心功能、局限纤维疤痕的作用(图6B、图6C)。

实施例8、IGFBP7保护成年小鼠心肌细胞抵抗OGD损伤

为进一步明确IGFBP7的心肌保护与对心肌细胞的保护作用密切相关，分离了成年小鼠心肌细胞，并且建立了体外OGD损伤模型，比较了IGFBP7处理组与对照组抵抗损伤的能力。结果显示，IGFBP7处理组杆状细胞的比例显著高于OGD对照组(图7A-B)。

同时，发现加入IGFBP7与IGF结合的阻断剂NBI31772之后，并没有影响IGFBP7对心肌细胞的保护作用，提示IGFBP7保护心肌是通过IGF受体非依赖的途径发挥作用的。

进一步评价WT、KO小鼠心肌细胞抵抗OGD损伤的能力，发现损伤后KO小鼠心肌细胞LDH释放明显上升，杆状细胞的比例较野生型明显下降(图7C-E)。

上述结果说明，IGFBP7有保护心肌细胞抵抗损伤的作用。

实施例9、IGFBP7对心梗后心肌组织RIP3蛋白水平有抑制作用

基于上述研究结果，明确了IGFBP7保护心肌细胞的作用，并进一步揭示了其保护作用是通过IGF受体非依赖的途径实现的。坏死是心肌梗死后心肌细胞死亡的主要方式，其中程序性坏死占据重要的比重，在心梗后3天的心脏组织样本中，检测程序性坏死经典的RIP1/RIP3通路。

结果显示，IGFBP7处理组程序性坏死的关键蛋白执行蛋白RIP3的表达显著降低(图8)，提示IGFBP7对心梗之后程序性坏死的发生具有抑制作用。

实施例10、IGFBP7抑制RIP3 mRNA水平

进一步地，进行QPCR检测，以分析心肌注射IGFBP7后RIP3 mRNA的表达情况。

结果显示，心肌注射IGFBP7显著抑制RIP3 mRNA水平。该结果提示，IGFBP7对RIP3的抑制包括转录水平的调控(图9)。

实施例11、过表达IGFBP7降低RIP3 mRNA稳定性

为进一步明确IGFBP7是如何调控RIP3 mRNA水平的，是减少了其转录还是促进了其降解，利用放线菌素D(ActD，10ug/mL)抑制成年小鼠心肌细胞的转录，评价IGFBP7对RIP3mRNA降解的调控。

结果显示，腺病毒(Ad)表达IGFBP7后，其通过降低RIP3 mRNA稳定性，促进其降解(图10)，说明IGFBP7通过降低RIP3 mRNA稳定性抑制RIP3的表达，进而抑制损伤心肌细胞程序性坏死。

实施例12、筛选方法

(1)基于IGFBP7表达或活性的筛选

细胞：过表达IGFBP7的心肌细胞。

测试组：培养所述过表达IGFBP7的心肌细胞，给予候选物质；

对照组：培养所述过表达IGFBP7的心肌细胞，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中IGFBP7的表达或活性情况，并进行比较。如果测试组中IGFBP7的表达或活性在统计学上高于(如高30％或更低)对照组，就表明该候选物是促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤的潜在物质。

进一步地，细胞中共表达RIP1/RIP3信号通路，所述的活性情况可通过观测以下情况来判断：观测测试组中IGFBP7降低RIP3 mRNA稳定性的情况。若测试组在添加候选物质后更显著地促进RIP3 mRNA稳定性的降低，那么就表明该候选物是促进心肌梗死后的心肌修复、改善心肌梗死后的心功能、保护心肌缺血损伤的潜在物质。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

序列表

<110> 中国科学院上海营养与健康研究所

<120> 一种促进心梗心肌修复的细胞分泌因子及应用

<130> 216701

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Arg Pro Ser Leu Arg Ala Leu Leu Leu Gly Ala Ala Gly Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Thr Cys

            20                  25                  30

Gly Pro Cys Glu Pro Ala Ser Cys Pro Pro Leu Pro Pro Leu Gly Cys

        35                  40                  45

Leu Leu Gly Glu Thr Arg Asp Ala Cys Gly Cys Cys Pro Met Cys Ala

    50                  55                  60

Arg Gly Glu Gly Glu Pro Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly Tyr

65                  70                  75                  80

Cys Ala Pro Gly Met Glu Cys Val Lys Ser Arg Lys Arg Arg Lys Gly

                85                  90                  95

Lys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Val Ser Gly Val Cys Val

            100                 105                 110

Cys Lys Ser Arg Tyr Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Pro

        115                 120                 125

Ser Gly Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Gln Arg Ala Glu Ser Arg Gly

    130                 135                 140

Glu Lys Ala Ile Thr Gln Val Ser Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro

145                 150                 155                 160

Ser Ile Val Thr Pro Pro Lys Asp Ile Trp Asn Val Thr Gly Ala Gln

                165                 170                 175

Val Tyr Leu Ser Cys Glu Val Ile Gly Ile Pro Thr Pro Val Leu Ile

            180                 185                 190

Trp Asn Lys Val Lys Arg Gly His Tyr Gly Val Gln Arg Thr Glu Leu

        195                 200                 205

Leu Pro Gly Asp Arg Asp Asn Leu Ala Ile Gln Thr Arg Gly Gly Pro

    210                 215                 220

Glu Lys His Glu Val Thr Gly Trp Val Leu Val Ser Pro Leu Ser Lys

225                 230                 235                 240

Glu Asp Ala Gly Glu Tyr Glu Cys His Ala Ser Asn Ser Gln Gly Gln

                245                 250                 255

Ala Ser Ala Ser Ala Lys Ile Thr Val Val Asp Ala Leu His Glu Ile

            260                 265                 270

Pro Val Lys Lys Gly Thr Gln

        275

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atggagcggc cgtcgctgcg cgccctgctc ctcggcgccg ctgggctgct gctcctgctc 60

ctgcccctct cctcttcctc ctcttcggac acctgcggcc cctgcgagcc ggcctcctgc 120

ccgcccctgc ccccgctggg ctgcctgctg ggcgagaccc gcgacgcgtg cggctgctgc 180

cctatgtgcg cccgcggcga gggcgagccg tgcgggggtg gcggcgccgg cagggggtac 240

tgcgcgccgg gcatggagtg cgtgaagagc cgcaagaggc ggaagggtaa agccggggca 300

gcagccggcg gtccgggtgt aagcggcgtg tgcgtgtgca agagccgcta cccggtgtgc 360

ggcagcgacg gcaccaccta cccgagcggc tgccagctgc gcgccgccag ccagagggcc 420

gagagccgcg gggagaaggc catcacccag gtcagcaagg gcacctgcga gcaaggtcct 480

tccatagtga cgccccccaa ggacatctgg aatgtcactg gtgcccaggt gtacttgagc 540

tgtgaggtca tcggaatccc gacacctgtc ctcatctgga acaaggtaaa aaggggtcac 600

tatggagttc aaaggacaga actcctgcct ggtgaccggg acaacctggc cattcagacc 660

cggggtggcc cagaaaagca tgaagtaact ggctgggtgc tggtatctcc tctaagtaag 720

gaagatgctg gagaatatga gtgccatgca tccaattccc aaggacaggc ttcagcatca 780

gcaaaaatta cagtggttga tgccttacat gaaataccag tgaaaaaagg tacacaataa 840