抗体药物偶联物及其组合物和用途

技术领域

本发明涉及抗体药物偶联物，其包含相连接的抗体部分、中间接头部分和细胞毒药物部分。本发明还涉及所述抗体药物偶联物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

背景技术

抗体药物偶联物(Antibody-Drug Conjugate，ADC)是结合了治疗性抗体的高特异性和细胞毒药物的高杀伤活性的一类药物，其中治疗性抗体部分与细胞毒药物部分通过中间的接头部分连接。目前全球范围内已有至少十款ADC药物上市，其中brentuximabvedotin、polatuzumab vedotin与enfortumab vedotin的抗体部分分别针对靶点CD30，CD79b与Nectin-4，trastuzumab emtansine与trastuzumab deruxtecan的抗体部分针对HER2靶点，gemtuzumab ozogamicin与inotuzumab ozogamicin的抗体部分分别针对CD33和CD22靶点，sacituzumab govitecan的抗体部分针对TROP2靶点，最新获批的belantamabmafodotin和loncastuximab tesirine分别针对BCMA和CD19靶点。细胞毒药物部分：brentuximab vedotin、polatuzumab vedotin、enfortumab vedotin和belantamabmafodotin均采用作用于微管的奥利斯他汀类(auristatins)，trastuzumab emtansine采用作用于微管的美登素类(maytansinoid)毒素分子，gemtuzumab ozogamicin与inotuzumab ozogamicin采用作用于DNA的卡奇霉素类(calicheamicins)毒素分子，trastuzumab deruxtecan和sacituzumab govitecan均采用喜树碱类毒素分子，loncastuximab tesirine则采用作用于DNA的PBD二聚体。中间接头部分：trastuzumabemtansine、belantamab mafodotin采用不可断裂接头，其余八个分子都采用可断裂的接头。

艾日布林(Eribulin，下式I)为天然海洋产物halichondrin B的一种合成类似物，其可抑制微管生长期，其通过基于微管蛋白的抗有丝分裂机制发挥作用，导致G2/M细胞周期的停滞、有丝分裂纺锤体的破坏，并最终在长期的有丝分裂阻滞后导致细胞凋亡。艾日布林目前已获批用于转移性乳腺癌和软组织肉瘤的治疗。

ADC类药物结合了细胞毒小分子的高效能和抗体对特定肿瘤细胞的高选择性的双重优点，当前仍然存在开发可以针对更多适应症的高效低毒的ADC药物的需求。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种具有通式Ab-(L-U)

在一个方面，本发明提供了一种具有通式Ab-(L-U)

在一些实施方案中，本发明提供了一种具有通式Ab-(L-U)

在一些实施方案中，本发明提供的通式为Ab-(L-U)

表S1 曲妥珠单抗序列

在一些实施方案中，本发明提供的通式为Ab-(L-U)

表S2 帕曲妥单抗(Patritumab)序列

在一个方面，本发明提供了通式为Ab-(L-U)

在一个方面，本发明提供通式为Ab-(L-U)

在一个方面，本发明提供了一种通式为Ab-(L-U)

在一些具体实施方案中，本发明提供的通式为Ab-(L-U)

在一些具体实施方案中，本发明提供的通式为Ab-(L-U)

在一个方面，本发明提供了一种具有通式Ab-(L-U)

其中，

R

R

或者R

在一些实施方案中，本发明提供的通式为Ab-(L-U)

其中，

R

R

或者R

在一些实施方案中，本发明提供的通式为Ab-(L-U)

其中，Ab表示抗体部分；

n为选自1-10的整数或小数；

R

R

或者R

在一些实施方案中，所述抗体药物偶联物包含以上式IIa或式IIIa所示的结构或者所述抗体药物偶联物为以上式IV所示的结构，其中，R

在一个具体实施方案中，本发明提供下式IV-1所示的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中，

Ab为抗体部分，

n为选自1至10的整数或小数。

在上述任意实施方案中，在一些具体的实施方案中，所述Ab为抗HER2抗体或其抗原结合片段，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链CDR(HCDR)1，包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链CDR(LCDR)1，包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。在一些实施方案中，所述抗HER2抗体为曲妥珠单抗。

在上述任意实施方案中，在另一些具体的实施方案中，所述Ab为抗HER3抗体或其抗原结合片段，所述抗HER3抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的HCDR1，包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的HCDR2，包含SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的HCDR3，包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的LCDR1，包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的LCDR3。在一些实施方案中，所述抗HER3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，轻链可变区包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗HER3抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。在一些实施方案中，所述抗HER3抗体为帕曲妥单抗。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及可药用载体。

在一个方面，本发明提供了本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在一个方面，本发明提供了包含本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物及可药用载体的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或上述的药物组合物。

在一个方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或者包含本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物与可药用载体的药物组合物。

在一些实施方案中，本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于治疗HER2阳性癌症、HER2阴性癌症(包括三阴性乳腺癌)以及按照免疫组织化学检测法检测显示HER2表达为IHC2+的癌症。

在一些实施方案中，本发明的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以用于治疗表达HER3蛋白的癌症。

在一些实施方案中，所述癌症为胆道癌、癌肉瘤、食管癌、胃食管结合部癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、头颈癌、结直肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、黑色素瘤、咽癌、口腔癌、皮肤癌、肺癌、多形胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤、尿路上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道间质瘤、鳞状细胞癌、腹膜癌、肝癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、肛门癌、阴茎癌、尿道癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤或骨髓瘤。

在一些方面，本发明提供以下式III所示结构的接头-药物中间体化合物：

其中，

R

R

或者R

在一些实施方案中，所述式III所示结构的接头-药物中间体化合物，其中，R

在一个具体实施方案中，本发明提供以下式III-1所示结构的接头-药物中间体化合物，

在一些方面，本发明提供了本发明的接头-药物中间体化合物在制备抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物中的用途。

本发明采用的接头结构将接抗肿瘤化合物艾日布林或其衍生物与抗体连接，所提供的抗体药物偶联物实现了优异的抗肿瘤效果或/及安全性。本发明提供的抗体药物偶联物不易聚集。在一些实验中发现，采用本发明的接头结构将抗肿瘤化合物艾日布林或其衍生物与抗体或其抗原结合片段连接可以提高抗体药物偶联物的抗聚集性。

解释和定义

除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

术语“被取代”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧代(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，氧代不会发生在芳香基上。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。术语“任选被取代的”表示被取代或未被取代的，例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH

本文中的C

当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被2个R所取代，则每个R都有独立的选项。

当一个连接基团的数量为0时，比如-(CH

当其中一个变量选自共价键时，表示其连接的两个基团直接相连，比如A-L-Z中L代表共价键时表示该结构实际上是A-Z。

术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

术语“羟基”指-OH基团。

术语“氰基”指-CN基团。

术语“巯基”指-SH基团。

术语“氨基”指-NH

术语“硝基”指-NO

术语“烷基”是指通式为C

术语“烷氧基”指-O-烷基。

术语“烷基氨基”指-NH-烷基。

术语“二烷基氨基”指-N(烷基)

术语“烷基磺酰基”指-SO

术语“烷硫基”指-S-烷基。

术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基。烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基等。

术语“炔基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个三键的不饱和脂肪族烃基。炔基的非限制性实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、1-丙炔基(-C≡C-CH

术语“环烷基”指完全饱和的并且可以以单环、桥环或螺环存在的碳环。除非另有指示，该碳环通常为3至10元环。环烷基非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基(双环[2.2.1]庚基)、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基等。

术语“环烯基”是指不完全饱和的并且可以以单环、桥环或螺环存在的非芳族碳环。除非另有指示，该碳环通常为5至8元环。环烯基的非限制性实例包括但不限于环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚烯基、环庚二烯基等。

术语“杂环基”是指完全饱和的或部分不饱和的(但不是完全不饱和的杂芳族)并且可以以单环、桥环或螺环存在的非芳族环。除非另有指示，该杂环通常为含有1至3个独立地选自硫、氧和/或氮的杂原子(优选1或2个杂原子)的3至7元环。杂环基的非限制性实例包括但不限于环氧乙烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、吡咯烷基、N-甲基吡咯烷基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、4H-吡喃基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢噻吩基等。

术语“杂环烷基”是指完全饱和的并且可以以单环、桥环或螺环存在的环状基团。除非另有指示，该杂环通常为含有1至3个独立地选自硫、氧和/或氮的杂原子(优选1或2个杂原子)的3至7元环。3元杂环烷基的实例包括但不限于环氧乙烷基、环硫乙烷基、环氮乙烷基，4元杂环烷基的非限制性实例包括但不限于吖丁啶基、噁丁环基、噻丁环基，5元杂环烷基的实例包括但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、异噁唑烷基、噁唑烷基、异噻唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基、四氢吡唑基，6元杂环烷基的实例包括但不限于哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吗啉基、哌嗪基、1,4-噻噁烷基、1,4-二氧六环基、硫代吗啉基、1,3-二噻烷基、1,4-二噻烷基，7元杂环烷基的实例包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基。优选为具有5或6个环原子的单环杂环烷基。

术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。例如，芳基可以具有6-20个碳原子、6-14个碳原子或6-12个碳原子。芳基的非限制性实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和1,2,3,4-四氢化萘等。

术语“杂芳基”是指单环或稠合多环体系，其中含有至少一个选自N、O或S的环原子，其余环原子为C，并且具有至少一个芳香环。优选的杂芳基具有单个4至8元环，尤其是5至8元环，或包含6至14个，尤其是6至10个环原子的多个稠合环。杂芳基的非限制性实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、三唑基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基等。

“衍生物”：母体化合物分子中的原子或原子团被其它原子或原子团取代形成的化合物称为母体化合物的衍生物。

本申请的化合物和中间体还可以以不同的互变异构体形式存在，并且所有这样的形式包含于本申请的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指可经由低能垒互变的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子转移互变异构体)包括经由质子迁移的互变，如酮-烯醇及亚胺-烯胺异构化。质子互变异构体的具体实例是咪唑部分，其中质子可在两个环氮间迁移。价互变异构体包括通过一些成键电子的重组的互变。

本申请化合物可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本申请的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来。光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。

本发明中所标记合成的化合物的任何原子若没有特别指定，可代表该原子的任何一种稳定的同位素。除非特别说明，当结构中某一位置被定义为H即氢(H-1)时，该位置仅含天然存在的同位素。同样，除非特别说明，当结构中某一位置被定义为D即氘(H-2)时，该位置含同位素量至少比天然存在的同位素量(0.015％)大3340倍(即至少含50.1％氘同位素)，当所标记合成的化合物的结构中某一个或多个位置被定义为D即氘(H-2)时，该结构所示的化合物的含量可至少为52.5％、至少为60％、至少为67.5％、至少为75％、至少为82.5％、至少为90％、至少为95％、至少为97％、至少为98.5％、至少为99％、至少为99.5％。本发明中所标记合成的化合物的氘代率是指标记合成的同位素含量与天然存在的同位素量的比值。本发明中所标记合成的化合物的每个指定氘原子的氘代率可至少为3500倍(52.5％)、至少为4000倍(60％)、至少为4500倍(67.5％)、至少为5000倍(75％)、至少为5500倍(82.5％)、至少为6000倍(90％)、至少为6333.3倍(95％)、至少为6466.7倍(97％)、至少为6566.7倍(98.5％)、至少为6600倍(99％)、至少为6633.3倍(99.5％)。本发明中的同位素体(isotopologues)是指在化学结构方面仅有同位素组成上不同的化合物。本发明中所标记合成的化合物具有相同的化学结构、仅在其分子的原子组成中同位素的变化。因此，本发明中所标记合成的在特定位置含氘化合物也同样会含非常少的该位置的氢同位素体，本发明中所标记合成的化合物中的某位置的氢同位素体的量取决许多因素，其中包括氘代试剂(D

本发明中，任何未指定为氘的各原子以其天然同位素丰度存在。

术语“治疗”意为将本申请所述化合物或制剂进行给药以预防、改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括但不限于：

(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时；

(ii)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；

(iii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。

(iv)降低疾病或疾病状态的任何直接或间接病理学后果。

术语“治疗有效量“意指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本申请化合物的用量。构成“治疗有效量”的本申请化合物的量取决于该化合物，疾病状态及其严重性，给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。

术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

作为药学上可接受的盐，例如，可以提及金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。

术语“溶剂化物”是指化合物与溶剂分子缔合形成的物质。

术语“抗体”以其最广义使用，特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、至少由两种完整抗体所形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、多功能抗体以及抗体片段，只要它们具有所需的生物学活性。

术语“人源化抗体”是指一种抗体，包含来源于非人源抗体的CDR区，并且该抗体分子的其它部分来源于一种或多种人抗体。

术语“突变体”用于指包含如下从肽的氨基酸序列衍生出的氨基酸序列的肽：用不同于原始肽的氨基酸置换一个或两个或更多个氨基酸，缺失一个或两个或更多个野生型氨基酸，插入在野生型中不存在的一个或两个或更多个氨基酸，和/或将在野生型中不存在的氨基酸添加至野生型的氨基端(N端)和/或羧基端(C端)(被统称为“突变”)。在本发明中，“插入”也可以被包括在“添加”中。

术语“CDR”(互补决定区)，也称为“高变区”，是指在序列上高度可变和/或形成结构限定的环的抗体可变结构域的每个区域。天然四链抗体通常包含六个CDR，三个在重链可变区中，三个在轻链可变区中。

术语“可变区”是指抗体的轻链或重链的N端结构域限定的约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的结构域。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链结构域。

术语“Fab”是指含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)连同分别在轻链和重链上的可变结构域VL(轻链可变区)和VH(重链可变区)。可变结构域包含参与抗原结合的互补决定区(CDR)。

术语“scFv”包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施方案中，scFv还包含介于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。

术语“ECD”为胞外结构域。HER2的胞外结构域包括四个结构域，分别为ECD1、ECD2、ECD3和ECD4。

术语“抗体部分”是指抗体药物偶联物中的抗体部分。在某些特定的方案中，其与中间接头部分通过特定官能团连接，该抗体部分可以与抗原特异性结合。

术语“接头部分”是指抗体药物偶联物中将抗体部分与细胞毒药物部分相连接的部分，可以是可切割的或者不可切割的，可切割接头可以在靶细胞内断裂，从而释放细胞毒药物。

术语“细胞毒药物部分”是指抗体药物偶联物中的细胞毒药物部分。在某些特定的方案中，其与中间接头部分通过官能团连接，在肿瘤细胞内，会游离出细胞毒药物分子，从而发挥抗肿瘤效果。

术语“曲妥珠单抗”：通用名Trastuzumab，是一种重组的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的ECD4，可以用于治疗HER2阳性的癌症，其一个实例是以商品名

术语“帕妥珠单抗”：通用名Pertuzumab，是一种重组的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的ECD2，可以用于治疗HER2阳性的癌症。

术语“Patritumab”是一种全人源抗HER3的单克隆抗体，可以用于治疗表达HER3蛋白的癌症。

术语“HER2”是EGFR家族的第二个成员，具有酪氨酸激酶活性，其中HER2表达水平可以按照免疫组织化学检测法进行检测，HER2阳性指IHC3+，HER2阴性指IHC1+/0，对于IHC2+的情况应该再进行ISH检测以进一步明确。

术语“HER3”(人表皮生长因子受体3，也称为ErbB3)是受体蛋白酪氨酸激酶，并且属于受体蛋白酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)亚家族，其还包括HER1(也称为EGFR)、HER2和HER4。HER3是跨膜受体，并且由细胞外配体结合结构域(ECD)、ECD内的二聚结构域、跨膜结构域和胞内蛋白酪氨酸激酶结构域(TKD)及C末端磷酸化结构域构成。已发现HER3在若干类型的癌(例如乳腺癌、肠胃癌和胰腺癌)中过表达。已示出HER2/HER3的表达与从非侵袭进展至侵袭阶段之间的关联。

术语“三阴性乳腺癌”是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2表达都为阴性的乳腺癌。

术语“EC

具体实施方式

本发明还提供了以下一些具体的实施方案，但本发明的保护范围不限于此：

实施方案1.具有通式Ab-(L-U)

其中，

R

R

或者R

实施方案2.根据实施方案1所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述抗体药物偶联物包含以下式IIIa所示的结构：

实施方案3.根据实施方案1或2所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述抗体药物偶联物为以下式IV所示结构：

其中，Ab表示抗体部分，

n为选自1-10的整数或小数。

实施方案4.根据实施方案1-3任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，R

实施方案5.一种药物组合物，其包含实施方案1-4任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

实施方案6.实施方案1-4任一项所述的抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物、或实施方案5所述的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

实施方案7.根据实施方案6所述的用途，其中，所述癌症为胆道癌、癌肉瘤、食管癌、胃食管结合部癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、头颈癌、结直肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、黑色素瘤、咽癌、口腔癌、皮肤癌、肺癌、多形胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤、尿路上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道间质瘤、鳞状细胞癌、腹膜癌、肝癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、肛门癌、阴茎癌、尿道癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤或骨髓瘤。

实施方案8.一种具有式III所示结构的接头-药物中间体化合物：

其中，

R

R

或者R

实施方案9.根据实施方案8所述的接头-药物中间体化合物，其中，R

实施方案10.实施方案8或9所述的接头-药物中间体化合物在制备抗体药物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物中的用途。

为清楚起见，进一步用实施例来阐述本发明，但是实施例并非限制本申请的范围。本申请所使用的试剂通常是市售的，无需进一步纯化即可使用。

本申请实施例中涉及的细胞及其来源如下表所示：

。

实施例1化合物III-1的制备

称取100mg化合物A(0.12mmol)和75mg化合物B(0.145mmol)加入到20mL反应管中(化合物A的CAS号为2413428-36-9，化合物B的CAS号为441045-17-6)，加入2mL N,N-二甲基甲酰胺，降温到0℃，加入70mg 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(0.18mmol)与49mg N,N-二异丙基乙胺(0.36mmol)，0℃下反应1h，经制备液相纯化得到化合物III-1约70mg。经ESI-MS分析，化合物II-1的m/z＝1241.72[M+H]

1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.22(t,J＝5.3Hz,1H),8.12(d,J＝8.0Hz,1H),8.06(t,J＝5.4Hz,1H),7.99(t,J＝5.3Hz,1H),7.65(d,J＝5.2Hz,1H),7.30-7.21(m,4H),7.18(d,J＝6.4Hz,1H),6.99(s,2H),5.02(d,J＝26.0Hz,2H),4.79(d,J＝38.9Hz,2H),4.65-4.60(m,2H),4.56(d,J＝3.7Hz,1H),4.50-4.42(m,1H),4.26(d,J＝10.1Hz,1H),4.21-4.14(m,1H),4.10(s,3H),4.05-3.98(m,1H),3.86-3.64(m,8H),3.60-3.45(m,4H),3.37-3.30(m,2H),3.26(s,4H),3.17-3.09(m,1H),3.08-2.99(m,2H),2.84(d,J＝10.4Hz,1H),2.86-2.66(m,3H),2.56-2.50m,1H),2.37-2.18(m,5H),2.15-2.05(m,3H),2.05-1.96(m,2H),1.95-1.84(m,4H),1.75-1.57(m,6H),1.55-1.38(m,6H),1.35-1.25(m,3H),1.23-1.12(m,3H),1.03(d,J＝6.0Hz,3H),1.00-0.92(m,1H).

实施例2抗体药物偶联物的制备

试剂：

溶液A：pH7.4 PBS缓冲液

溶液B：10mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)水溶液

溶液C：DMSO

溶液D：组氨酸缓冲液(含0.89mg/mL L-组氨酸和4.04mg/mL盐酸L-组氨酸一水合物)

溶液E：700mg/mL蔗糖溶液(用溶液D配制)

溶液F：20mg/mL吐温80(用溶液D配制)

实验流程：

1、抗体置换

a、将30KD的超滤离心管用溶液A充分润湿

b、将抗体置换到溶液A中

c、加入适量溶液A调节抗体浓度

2、抗体还原

a、计算抗体摩尔量，记为N1

b、向抗体溶液中加入适量溶液B，使反应体系TCEP摩尔量为N2

c、铝箔包扎，置于旋转培养仪上低速(20rpm)震摇，37℃避光反应1h

3、偶联

a、取适量linker-payload，用DMSO溶解，终浓度为10mg/mL

b、向抗体溶液中加入DMSO，使浓度为5％，再加入适量linker-payload溶液，使摩尔浓度为N3

c、铝箔包扎，置于旋转培养仪上低速(20rpm)震摇，22℃避光反应1.5h

4、偶联终止

a、用溶液D将超滤离心管润湿

b、将抗体置换至溶液D中，加入适量溶液E、F，-80℃冻存

抗体药物偶联物的DAR值(每一分子抗体的药物平均连接数)测定

采用LC-MS方法测定DAR值。取50μg ADC样品，加入1μL糖苷酶PNGase F(瑞安生物，中国)，在37℃孵育20小时。实验中的质谱仪为高分辨的Xevo G2-XS(Waters，美国)。将样品浓度调至5μM，采用直接进样法，采集正离子模式下的质谱数据。采集的非变性质谱数据采用软件UNIFI 1.8.2.169(Waters，美国)进行分析处理。

抗体药物偶联物的蛋白浓度测定

采用lowry法检测蛋白浓度。用酶标仪测定样品在OD

通过以上方法制备式IV-1的抗体药物偶联物(包括IV-1(trastuzumab)、IV-1(patritumab))以及式IV系列的其他抗体药物偶联物：

/>

分别制备得到样品1：DAR＝3.3、蛋白浓度＝3.94mg/mL和样品2：DAR＝7.0、蛋白浓度＝3.91mg/mL。

分别制备得到样品1：DAR＝4.8、蛋白浓度＝1.71mg/mL和样品2：DAR＝7.1、蛋白浓度＝1.65mg/mL。

实施例3小分子细胞毒化合物以及抗体药物偶联物的细胞活性

将小分子细胞毒化合物使用培养基稀释至35000ng/mL～0.0896ng/mL，共9个浓度。取对数生长期肿瘤细胞，调整密度至1×10

将抗体药物偶联物使用培养基稀释至5000ng/mL～0.0128ng/mL，共9个浓度。取对数生长期肿瘤细胞，调整密度至2×10

IV-1(trastuzumab)细胞活性：

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IV-1(patritumab)细胞活性：

实施例4抗体药物偶联物对裸小鼠异种移植瘤的抑制作用

将人肿瘤细胞接种于裸小鼠右侧腋窝下，待肿瘤体积至100-300mm

·相对体重(relative weight，RWt)，计算公式为：

其中Wt

·抑瘤率(tumor growth inhibition，TGI)，计算公式为：

其中TW为给药组瘤重，TW

本发明的抗体药物偶联物都表现出了优异的肿瘤增殖抑制活性，并且，安全性好。

实施例5抗体药物偶联物的制备

试剂：

溶液A：pH7.4 PBS缓冲液

溶液B：10mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)水溶液

溶液C：DMSO

溶液D：组氨酸/盐酸组氨酸缓冲液(含0.89mg/mL L-组氨酸和4.04mg/mL盐酸L-组氨酸一水合物)

溶液E：700mg/mL蔗糖溶液(用溶液D配制)

溶液F：20mg/mL吐温80(用溶液D配制)

抗体：曲妥珠单抗、IgG1(购自义翘神州)

linker-payload：实施例1中的化合物III-1、MAL-PEG2-Val-Cit-PAB-艾日布林(CAS号：2130869-18-8，其结构和合成参见专利公开CN108883198A中实施例3的ER-001159569)

实验流程：

1、抗体置换：

将30KD的超滤离心管用溶液A充分润湿，将抗体置换到溶液A中，加入适量溶液A调节抗体浓度为8mg/mL；

2、抗体还原：

计算抗体摩尔量，记为N1；向抗体溶液中加入适量溶液B，使反应体系TCEP摩尔量为N2；铝箔包扎，置于旋转培养仪上低速(20rpm)震摇，34℃避光反应1h，获得反应溶液1。

3、抗体与linker-payload的偶联：

取适量linker-payload，用DMSO溶解，终浓度为10mg/mL；向反应溶液1中加入DMSO，使DMSO的浓度为5％(v/v)，再加入适量的上述用DMSO溶解的linker-payload溶液，使linker-payload的摩尔量为N3；铝箔包扎，置于旋转培养仪上低速(80rpm)震摇，室温避光反应t小时，获得反应溶液2。

4、偶联反应的终止：

用溶液D将超滤离心管润湿；用溶液D来超滤反应溶液2，加入适量溶液E、F，-80℃冻存。

其中，实验条件及组别如下表1所示。

表1 实验条件及组别

抗体药物偶联物的DAR值(每一分子抗体的药物平均连接数)测定

采用LC-MS方法测定DAR值。取50μg ADC样品，加入1μL糖苷酶PNGase F(瑞安生物，中国)，在37℃过夜反应。实验中的质谱仪为高分辨的Xevo G2-XS(Waters，美国)。将样品浓度调至5μM，采用直接进样法，使用Native、正离子模式采集质谱数据。采集的非变性质谱数据采用软件UNIFI1.8.2.169(Waters，美国)和Masslynx4.1(Waters，美国)进行数据处理。

通过以上方法制备式IV-1(IgG1)(包括IV-1(IgG1)-D4和IV-1(IgG1)-D8)的抗体药物偶联物：

其中IV-1(IgG1)-D4的DAR＝4.0、IV-1(IgG1)-D8的DAR＝6.7。

通过以上方法制备式V(曲妥珠单抗)(包括V(曲妥珠单抗)-D4和V(曲妥珠单抗)-D8)和式V(IgG1)(包括V(IgG1)-D4和V(IgG1)-D8)的抗体药物偶联物：

其中，V(曲妥珠单抗)-D4的DAR＝3.8，V(曲妥珠单抗)-D8的DAR＝7.1；

其中，V(IgG1)-D4的DAR＝4.9，V(IgG1)-D8的DAR＝7.0。

实施例6抗体药物偶联物的聚集体验证

采用凝胶色谱柱对上述实施例2和4制备的抗体药物偶联物各组分进行分离。利用添加10％异丙醇的中性pH缓冲液作为流动相进行洗脱，各组分按照分子量由大到小的顺序依次被洗出。色谱柱为ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column

数据处理，采用面积归一化法对结果进行定量分析。分别计算聚集体、免疫球蛋白单体和低分子量杂质的峰面积百分比，其中主峰前为聚集体，主峰为免疫球蛋白单体，主峰后为低分子量杂质。抗体药物偶联物的单体、聚集体及低分子量杂质含量比例见表2。结果表明，化合物III-1作为linker-payload制备的ADC具有抗聚集性。

表2 抗体药物偶联物的单体、聚集体及低分子量杂质含量

根据本发明所公开的内容，虽然根据优选实施方案对本发明的方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。

本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的，程序上和其他的细节补充本文所述内容。