氢氧混合气制备用于创伤治疗的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于创伤治疗的药物组合物以及氢氧混合气在制备上述用于创伤修复的药物组合物中的应用。

背景技术

创伤发生率高，涉及人群广泛，给社会和个人带来极大的经济和精神负担。创伤多为开放性损伤，通常累及受伤部位的内部组织(如肌肉、骨头等)，包含擦伤、撕裂伤、切伤、刺伤等。开放性损伤不论平时或战时都较多见，因伤口多有污染，如处理不及时或不当，易发生感染，影响愈合和功能恢复，严重者可造成残疾，甚至危及伤员的生命。创伤按照伤口类型，可分为急性伤口和慢性伤口以及复杂创面如战创伤、烧伤等。

数据显示，全球约有1％到2％的人在他们的一生中会经历慢性创伤，随着老年人口的迅速增长，这个数字还会增加。健康完整的皮肤对于维持人体的生理稳态起着至关重要的作用，尤其是它对环境的保护屏障，防止微生物的进入。皮肤组织在遭受外力作用下，出现离断或缺损后的愈复过程，包括伤口的早期组织坏死和血管的断裂出血、肉芽组织增生和瘢痕形成以及表皮及其它组织的再生。

创伤的治疗，关键在于改善修复条件，促使伤口及早愈合，国内外通常在临床中创伤护理主要有以下步骤：止血，促进血液凝结；伤口清洁及外科清创术去除异物和坏死组织；抗炎，伤口表面的抗生素处理，防止感染；包扎/缝合伤口，促进更快的愈合；例行消毒与更换敷料。目前创伤治疗方法主要包括干细胞技术、生长因子治疗和高压氧治疗等，均在临床和基础研究中体现出一定的疗效，但仍存在较多缺陷。

其中，干细胞治疗中，由于开放性创面通常存在复杂的局部微环境，并不完全适合干细胞生长，以及干细胞潜在的致瘤风险，使得该类治疗方式应用仍有待探讨；不同种类的生长因子可以刺激不同类型细胞增殖、分化，促进新生血管重建和基质生成，然而各类常用生长因子如血小板衍生生长因子、血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等，其明确的治疗效果仍缺乏证据；利用高压氧气疗法(HBOT)治疗急性创面和难愈合创面已有较长历史，通常认为HBOT可维持创面局部稳态和抑制创面厌氧菌繁殖，然而，高压氧同时存在大量禁忌，如未经处理的气胸、未经处理的多发性骨折、视网膜剥离、内出血、严重伤风感冒及鼻炎、高烧、血压过高等，使整体创伤治疗呈现很大的局限性。

基于愈合的理论知识，国内外针对创面愈合提出了各种新方法，但由于创伤病因复杂，加上一系列并发症，所以临床疗效并不尽人意，因此寻找安全、有效、低廉、便捷的治疗方法，并对愈合不同阶段的发生机制做出系统性的阐述，对研究和治疗伤口显得至关重要。

氢分子是一种新型、简单、易获取、价格低廉的抗氧化剂，而作为一种清洁、无毒无害、分子量小的气体分子，氢气能够迅速渗透于组织器官中，并能通过血脑屏障。

目前在减少炎症反应中，通过JNK、NF-B、TNF、Bax/Bcl-2、ASK-1等信号通路，在新生儿脑、背部大面积皮瓣、心脏骤停保护、腹部皮瓣等缺血再灌注动物模型中均显示出了良好的治疗效果；在减少氧化应激方面，富氢的生理盐水可预防β-淀粉样蛋白诱导的神经炎症和氧化应激反应；在创面愈合方面，裸鼠皮肤愈合模型中，氢分子对紫外线诱导的皮肤损伤有良好的治疗作用；在保护人体皮肤防止紫外线诱导产生的红斑和DNA损伤方面，已有研究证实了局部给与含氢的水分子通过抑制紫外线诱导的人体皮肤中的MMP-1、IL-6、IL-1b等mRNA的表达预防皮肤炎症，调节皮肤的功能。此外，吸入氢气对辐射诱导的皮肤炎症和损伤也有良好的保护作用。同时，通过富氢生理盐水的给氢方式，研究表明了可抑制烧伤早期的炎症反应和细胞凋亡，阻止损伤的进一步加重。2016年，有论文发表在大鼠模型中，通过激活NRF/2抗氧化防御通路，摄入富氢水可加速口腔伤口愈合，同时另一项研究表明引用富氢水能够促进人体成纤维细胞在氧化应激损伤的细胞凋亡，加快伤口愈合，清除活性氧，减少谷胱甘肽的释放。综上所述，在创面治疗过程中，氢分子可通过减少炎症反应，抑制细胞凋亡等作用促进创面的愈合。因此，氢气被认为具有选择性抗氧化应激作用，用不同动物模型验证在包括皮瓣模型等多种病理模型中发挥其抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用。

现有技术CN110013487A公开了一种氢气在制备医用防治制品中的用途，经动物实验证实，氢气干预有利于促进缺血再关注损伤性皮肤溃疡的愈合，具有显著的抗氧化、抗炎以及促修复活性；氢气干预降低压疮组织的氧化损伤与细胞凋亡水平，能通过激活Nrf2通路提升压疮小鼠的抗氧化水平，并逆转缺血再灌注损伤皮肤的促炎微环境，以及促进缺血再灌注损伤皮肤中创伤修复蛋白的表达以及促进创口肉芽组织的形成；所述的氢气干预效果与氢气浓度呈正相关。在该技术方案的动物实验中，主要是对缺血再灌注损伤所致的小鼠压疮，提前氢气干预一周可显著缩小早期皮损处的溃疡面积，75％氢气能缩短创面愈合时间；在溃疡形成中期(造模后5-7d)后，氢气干预组小鼠皮损组织的DNA损伤(8-OXOdG)与细胞凋亡率显著降低，其干预效果与氢气浓度密切相关，以75％氢气效果最佳。但一方面，该技术需要提前一周对皮损处进行氢气干预，而常见创伤多属于突发性伤病意外，不可能提供事前干预的时间，另一方面，由于病人可能发生的突发伤病导致出血、休克情况或者老年病患者的体质虚弱情况，在创伤发生后进行75％浓度氢气的吸入，反而易造成病人缺氧导致病情的进一步恶化，甚至组织、机体不可逆转的损害。

而本发明申请人的研究表明，氢氧混合分子可引发天然创伤表面的湿性愈合方式，减少结痂生成，淡化疤痕以及增加ECM堆积的影响更大；因此，本发明申请人建立并优化了鼠全层皮肤缺损模型，针对氢分子对创面愈合的影响、血流血氧水平、炎症风暴程度、ECM堆积水平及不同阶段的愈合效果评价进行了探究，就如何克服目前氢气治疗创伤的局限性，提供了一种新型创伤治疗的治疗方案、相应的医疗防治制品及其用途。

发明内容

现有技术中认为氢气具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的生物学特性，而本发明的目的是提供一种用于创伤治疗的药物组合物、其用途、使用其的治疗方法以及用于制备的方法，所述的药物组合物以氢氧混合气为活性成分，在创伤发生后进行氢气和氧气的混合气体按照2:1比例制成气体制剂的吸入治疗，除了能够抑制炎症之外，还能够引发一种新型的愈合方式：激活自身伤口附近干细胞，促进上皮细胞迁移，促进自身胶原等细胞外基质堆积，产生天然的湿性愈合，从而促进组织重塑。

第一方面，本发明公开了氢氧混合气在制备创伤治疗用医疗防治制品方面的用途，其特征在于：所述氢氧混合气中氢气含量为2-79％，氧气含量为21-98％。

进一步地，所述的医疗防治制品是用于开放性或非开放性的急性或慢性创伤修复的药物或制剂；

进一步地，所述的医疗防治制品是用于皮肤组织再生与修复的制剂或设备。

进一步地，氢气的来源为纯氢、电解水产生的氢气、化学反应产生的氢气。

进一步地，所述氢气包括一种或多种氢的同位素氕、氘或氚。

进一步地，氧气的来源为纯氧、电解水产生的氧气、化学反应产生的氧气。

第二方面，本发明公开了一种用于创伤治疗的药物组合物，以氢氧混合气作为活性成分。

进一步地，所述氢氧混合气中氢气浓度为2％-79％，氧气浓度21％-98％。

进一步地，所述氢氧混合气中氢气:氧气的气体配比为2:1。

进一步地，所述药物组合物由氢气和氧气组成；或者，所述药物组合物包括氢气和氢气。

优选所述氢气为浓度超过体积百分比30％的高浓度氢气。

进一步地，所述氧气浓度控制在不会对健康细胞造成毒性的浓度。

进一步地，在所述氢氧混合气中，氢气的体积百分比浓度为52-66％，氧气的体积百分比浓度为26-34％；优选所述氢氧混合气包括66％的氢气和33％的氧气。

第三方面，本发明公开了所述药物组合物在呼吸或输送过程中，气体流量为100mL-6L/min。

第四方面，本发明公开了所述药物组合物在诱发皮肤组织生长方式，包括天然的湿性愈合、自身干细胞激活、胶原等细胞外基质堆积增加、炎症反应减轻、血流血氧增加组织、重塑良好疤痕形成减少的应用。

第五方面，本发明公开了氢氧混合气制备用于创伤治疗的药物组合物的方法，使用氢气和氧气的混合气体作为活性成分，所述氢气和氧气的气体配比为2:1。

进一步地，所述的药物组合物中还包括选自以下各项组成的组中的至少一种：抗生素、创伤治疗促进剂、消毒剂或杀菌剂以及局部麻醉或消炎剂；或者短杆菌素、夫西地酸或其盐、硫酸新霉素或其盐、氢化可的松、雷公根的滴定提取物以及它们的组合。

进一步地，所述药物组合物是组合物或气体混合物；所述药物组合物为吸入气体或气溶胶形式。

在安全性方面，一方面，氢气和氧气即使是混合状态，也不会直接发生反应，而只要在封闭的条件下避免静电的产生，则两者都能稳定共存；另一方面，与传统的创面愈合治疗方式，如高压氧(Hyperbaric Oxygen，HBO)、生物工程皮肤、干细胞移植等治疗方法相比，氢氧混合气的设备更为简单，对人体安全性高，制取成本低廉。一方面，由于氢气本身的分子结果非常简单，与身体中的自由基结合的产物也简单，比如和常规的羟自由基反应可以生成水分子，而多余的氢气则可以通过呼吸系统排出体外，在生命体内不会有任何残留，所以氢氧混合气的吸入对人体是非常安全的，没有副作用；另一方面，氢气和氧气可以通过不同的制取方式发挥其治疗作用，同时比起植皮、干细胞移植等高昂的医疗费用，氢气和氧气制取的成本是非常低廉的。因此，氢氧混合气是创面愈合良好的治疗手段。

与现有技术相比，本发明所述的氢氧混合气在制备创伤治疗用医疗防治制品方面的应用，能够加快创面的愈合速度，且呈现剂量依赖性，能够增加血流灌注量和容氧量，对抗机体所遭受的病菌感染、修复受损的皮肤组织和促进血管的生成，帮助启动伤口康复过程，改变伤口床的微环境，为下一步伤口愈合的成熟修复期胶原的形成建立了条件。同时，还能促进了细胞外基质的沉积，特别是以一型胶原的形式，促进了ECM，特别是愈合过程重大胶原沉积。

吸入氢氧混合气体后，小鼠伤口愈合速度显著加快，显著高于纯氢吸入组，表明了在吸入高剂量氢氧混合气的情况下愈合评价更好。同时氢氧气的吸入增加了创面血流灌注量和容氧量，提高了CD31、CD34、VEGF的表达量，氢氧混合气可作为一种促进创面愈合的手段应用于临床中，对创面愈合过程中血管的生成有重要意义。血细胞分析表明72h单核细胞比例明显下降，可能是由于其转化形成了巨噬细胞，对抗机体所遭受的病菌感染、修复受损的皮肤组织和促进血管的生成，帮助启动伤口康复过程。激活了干细胞的增值和分化，加快伤口的上皮化进程；染色结果表明，高氢氧组的LGR5和K15被提前激活，在高浓度氢氧组中呈现高表达，表皮干细胞提前进入了增值和分化期。增值相关指标Ki67染色结果显示高氢氧组的阳性率更高，说明了氢氧混合气对于伤口细胞的增值和修复起到很好的促进作用。IHC检测第2天、第3天和第12天1型胶原的表达量，结果表明高氢氧组的阳性率比其他两组明显更高，COL-1的表达量最高，高剂量的氢气吸入对创面愈合后期胶原蛋白的合成作用更大。以上结果表明吸入H

氢氧混合气可应用于急性伤口治疗，采用本发明所使用的氢氧混合气呼吸进行辅助治疗，显著促进皮肤缺损及割伤伤口的愈合，愈合过程呈现天然的湿性愈合效果，外周血血细胞计数及血生化显示，整体炎症反应减弱，细胞外基质堆积加速，表皮及毛囊干细胞激活增强，愈合后疤痕淡化，效果优于常规治疗方法。采用本发明所使用的氢氧混合气呼吸进行辅助治疗，对于医美外科手术中造成的皮肤微创伤口、注射填充等造成的表皮创面有很好的促进愈合作用，主要表现在伤口的闭合加快，伤口周围渗出物减少，疤痕淡化。

氢氧混合气可应用于慢性伤口治疗，采用本发明所使用的氢氧混合气呼吸进行辅助治疗，能够促进糖尿病难愈伤口的愈合。持续30天呼吸结果显示，氢氧混合呼吸组整体血糖及血脂水平下降，糖尿病足伤口处渗出液减少，感染程度降低，肉芽新生组织开始增生，上皮化速度加快。多普勒血流检测显示，坏死组织明显减少，血流量和血氧含量增加，溃疡组织存活率增加。

采用本发明所使用的氢氧混合气配比，制备药物组合物通过呼吸进行辅助治疗，可以促进褥疮、压疮等难愈合伤口的恢复。持续30天呼吸后，结果显示，使用前述配比的氢氧混合气呼吸组病灶组织溃疡面积显著减小，外周血血生化、血常规结果提示，整体炎症水平下降；伤口边缘肉芽新生组织明显增厚增多，上皮化过程加快。

综上所述，使用本发明的氢氧混合气制备用于创伤治疗的药物组合物，能够形成了一种新的愈合模式，该模式改变了伤口组织代谢微环境，并具有愈合快、血供和血氧丰富、上皮化提前、干细胞激活和胶原堆积加快的特点，因此形成了更好的组织重塑效果。氢氧混合气这种清洁、高效、便利的治疗方式，很有可能在未来应用于民口和军口的各类创伤救治，具有广泛的使用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中的小鼠全层皮肤缺损创面皮损图片比较。

图2为本发明实施例1中的小鼠皮肤缺损创面面积分析(*表示p＜0.05；**表示p＜0.01；***表示p＜0.001；****表示p＜0.0001)。

图3为本发明实施例2中的CD31、CD34和VEGF荧光免疫组化染色照片(原图为20×物镜拍照，放大方框内为40×物镜放大)。

图4为本发明实施例3中的三组样品HE染色照片(4×)，A2、B2、C2是局部放大图(20×)，A3、B3、C3为Masson染色结果(20×)。

图5为本发明实施例4中的三组样品免疫组化检测α-SMA和Col-1在组织切片中的照片。

图6为本发明实施例4中的三组样品创伤后第3天皮肤组织中胶原纤维和肌成纤维蛋白的表达量。

图7为本发明对照例1中的三组样品创面愈合图和创面愈合速率图。

图8为本发明对照例1中的三组样品第11天皮肤组织的HE染色和masson染色结果。

图9为本发明实施例5中的三组样品在第三天对创伤组织表皮层增厚的影响，造模后第3天对三组的皮肤组织进行HE染色(n＝2)，从左至右分别是物镜放大4×、10×、20×。

图10为本发明实施例5中的三组样品通过ELISA的方法检测皮肤组织研磨液和血清中各类生长因子的含量，左边表示高氢氧组，中间表示NAC纯氢组，右边表示Control对照组，(a、b、c、d)分别表示皮肤组织研磨液中EGF、PDGF、bFGF和TGF-β1在24h、48h、72h的含量，(e)表示在24h、48h、72h时的血清中TGF-β1的含量。

图11为本发明实施例6中的三组样品IHC检测干细胞来源的k15和P63在皮肤组织中的表达情况，黑线表示表皮层的边界，箭头表示表皮细胞，黑色方框表示创面的截断处，白色方框表示伤口临近的毛囊富集区。

图12为本发明实施例6中的三组样品IHC检测皮肤组织切片中LGR5、LGR6表达的影响，黑线表示表皮层的边界，箭头表示表皮细胞，黑色方框表示创面的截断处，白色方框表示伤口临近的毛囊富集区。

图13为本发明实施例6中的三组样品IHC检测皮肤组织切片中LGR5、K15表达的影响。

图14为本发明实施例6中的三组样品IHC检测皮肤组织切片中KI67表达的影响，左边是自损伤后第2天的染色结果，右边是自损伤后第3天的染色结果。

图15为本发明实施例7中的高氢氧组和对照组主成分分析，左图表示主成分分析(PCA)模型参数表，R2Y表示模型方差分数，Q2表示模型的预测能力；右图表示HILIC检测后的PCA分析。

图16为本发明实施例7中的高氢氧组和对照组差异代谢物的分布，左图表示差异代谢物的通路富集，X轴表示通路影响，Y轴表示含量logP值；右图表示两组之间的代谢差异映射，热图显示了z转化后的各个代谢产物。

图17为本发明实施例7中的高氢氧组和对照组样本通过非靶向代谢检测的代谢差异表达。

图18为本发明实施例8的小鼠创伤后前4天的血流灌注情况，左图中心灰色面积越大，表示血流灌注量越高；右图折线图中三角图例表示66％H

图19为本发明实施例8的小鼠创伤后第4天至第12天的的血流灌注情况，左图中心灰色面积越大，表示血流灌注量越高；右图折线图中三角图例表示66％H

图20为本发明实施例8的愈合前期和后期血液中的血氧水平变化，折线图中三角图例表示66％H

图21为本发明实施例9的6种不同的处理方法对人脐静脉血管内皮细胞(Huvec)血管管腔形成的影响。

图22为本发明实施例9的66％H

图23为本发明实施例11的66％H

具体实施方式

本文中术语“治疗有效量”是足以影响期望生物效应的量，所述生物效应例如有益结果，包括临床结果。

本发明研究氢氧混合气在小鼠皮肤缺损等病理模型中发挥其抗氧化和抗炎症的作用，创伤形成后的初期，主要是一些白细胞以及相关的生长炎症生长因子发挥清除病菌、招募相关细胞等发挥作用，这提示了氢氧混合气可能会在创面愈合中有积极的治疗效果，设定多种氢氧配比浓度(氢含量79％和氧含量21％、氢含量66％和氧含量33％、氢含量52％和氧含量26％、氢含量30％和氧含量21％、氢含量5％和氧含量95％、氢含量2％和氧含量98％)来比较不同剂量的疗效，探究吸入不同浓度的氢氧混合气对创面的愈合速率的作用，并深入探究不同组之间出现差异性愈合率的原因。

本发明选择了C57BL/6N鼠，建立小鼠背部全层皮肤缺损创面模型，通过让模型小鼠吸入氢氧混合气的方式，在动物水平研究氢氧混合气对创面愈合速率的作用，通过血流灌注量、HE染色、Masson染色、血常规、免疫组化、细胞流式等生物学手段，进一步分析细胞和分子层面的内部差异。

通过对伤口的全面评估，可以局部判断该伤口是否能够如期愈合。伤口床的准备是为了加速自体愈合或增强其他治疗手段疗效而进行的伤口管理，这一概念是2000年由一位美国学者提出，它为难愈伤口提供了一种系统、有步骤的治疗方法，作为一个完整的伤口处的准备过程TIMERS-表示组织(Tissue)、炎症(inflammation)、水分平衡(moisturebalance)和伤口处的状态(edge of wound describes a favorable wound-bedmicroenvironment)，它通常被用于评估伤口愈合的有效性。

创面愈合率是评价创面愈合的直接指标之一。采用图像分析软件来测定并计算出创面愈合过程中未愈合的面积，按下列公式计算伤后不同时间点的创面愈合率：愈合率＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积；创面愈合时间是评价创面愈合的传统指标之一，一直沿用至今，即定义为创面完全上皮化所需时间，上皮化依靠肉眼观察；组织病理学分析是用组织学方法观察创面愈合情况也是传统的方法之一，证据可靠。将组织切片通过一定的染色方法，按照组织学标准定量分析，在光镜下观察分析表皮结构、表皮的生长、真皮-表皮连接处的生长情况以及炎症细胞的浸润数量。此外细胞的增值情况、胶原的堆积以及伤口处的代谢也是反映创面愈合能力高低的重要指标，任何伤口愈合的评价都并非一成不变的，往往通过各种角度的观察来综合反映创面愈合的能力。

创面的愈合和修复涉及到三个明显但时间上会有重叠的时期，炎性期、组织重建期和组织修复期。小鼠是研究中最常用的实验室动物之一，然而，老鼠的伤口愈合是完全不同于人类的，它主要通过收缩发生，因此本发明的实施例中通过在伤口周围固定透明硅胶片来克服这个问题，消除了伤口收缩，更加接近人类的愈合过程。而且伤口的修复过程依赖上皮化、细胞增殖和血管生成等，这些都与生物过程密切相关。

本发明制备氢氧混合气的装置及方法：

第一方面，本发明制备氢氧混合气的装置通过独特的电解水方法制备氢气和氧气的混合气体，包括氢氧气混合气发生器、去杂盒以及吸入导出口。

所述氢氧混合气发生器以100mL-6L/min的速率实时释放66.6％氢气和33.3％氧气的混合气体，优选气体的输送流量为2-3L/min；

所述去杂盒用于去除电解过程中产生的水和二氧化碳；

所述吸入导出口可连接到透明容器中，供治疗动物或患者吸入使用。

第二方面，本发明制备氢氧混合气的装置通过独特的电解水方法分别制备氢气、氧气，包括电解发生器、氢气输出电极及导管、氢气去杂盒、氢气吸入导出口和氧气输出电极及导管、氧气去杂盒、氧气吸入导出口。

所述电解发生器以100mL-6L/min的速率实时释放66.6％氢气和33.3％氧气的混合气体，优选气体的输送流量为2-3L/min；

氢气经氢气输出电极及导管进入氢气去杂盒；

所述氢气去杂盒用于去除氢气中在电解过程中产生的水和二氧化碳；

所述氢气吸入导出口可连接到氢气储存装置中，供治疗动物或患者吸入使用。

氧气经氧气输出电极及导管进入氧气去杂盒；

所述氧气去杂盒用于去除氧气中在电解过程中产生的水和二氧化碳；

所述氧气吸入导出口可连接到氧气储存装置中，供治疗动物或患者吸入使用；

所述氢气吸入导出口和氧气吸入导出口连接到氢氧混合气储存装置，供动物或患者吸入使用；

本发明患者可以先吸入氢气/氧气，再吸入氢氧混合气；或先吸入氢氧混合气，再吸入氢气/氧气；或先后吸入氢氧气，再吸入氢氧混合气；或先吸入氢氧混合气，再吸入氢气/氧气。

本发明吸入给药的氢氧混合气体中的氧气浓度为1％-98％的范围内，优选为21％-33％的范围内。

所述吸入导出口/氢气吸入导出口/氧气吸入导出口可连接至密封式呼吸面罩；

进一步地，所述面罩可包括衬垫以及框架和头带，所述衬垫可以在使用时保持在脸部适当的部分以实现密封；

进一步地，所述衬垫由柔性材料制成，优选所述柔性材料为硅树脂、凝胶或泡沫；

进一步地，所述框架和头带为刚性或半刚性结构；优选所述框架和头带可以与衬垫一起限定内部空腔；

进一步地，所述内部空腔连通吸入导出口并输送氢氧混合气；

进一步地，所述头带与框架一起可以提供具有合适的大小和方向的力从而将衬垫或鼻导管元件保持在合适的位置上。

进一步地，患者使用的密封式呼吸面罩在框架的内部空腔输送氢氧混合气时，氧气浓度不可低于21％；

如果氧气浓度过低，低于10％则会产生低氧血症等，如果氧气浓度低于21％，一般只能维持正常的新陈代谢需要，不具备明显的治疗价值。另一方面，如果氧气浓度太高，则会有产生肺损伤的风险。

所述吸入导出口/氢气吸入导出口/氧气吸入导出口可连接至密封式呼吸系统；

进一步地，所述密封式呼吸系统可包括鼻导管元件以及框架和头带，所述鼻导管元件可以在使用时保持在适当的部分以实现密封；

进一步的，所述鼻导管元件包括鼻枕、鼻喷、鼻叉和鼻管等元件，可以在鼻孔内表面形成密封；

进一步地，所述鼻导管元件连通吸入导出口并向患者鼻腔内输送氢氧混合气；

进一步地，向患者鼻腔内输送氢氧混合气过程中，气体流量为100mL-6L/min。

进一步地，所述头带与框架一起可以提供具有合适的大小和方向的力从而将鼻导管元件保持在合适的位置上。

进一步地，患者使用的密封式呼吸系统在框架的内部空腔输送氢氧混合气时，氧气浓度不可低于21％。

此外，所述吸入导出口/氢气吸入导出口/氧气吸入导出口可连接至非密封式呼吸系统；

进一步地，所述非密封式呼吸系统可包括鼻导管元件，所述鼻导管元件可以在使用时保持在适当的部分以向患者鼻腔内输送氢气、氧氢或氢氧混合气；

进一步地，向患者鼻腔内输送氢氧混合气过程中，气体流量为100mL-6L/min。

进一步地，所述鼻导管元件可以保持在合适的位置上以供患者进行呼吸，使用非密封式呼吸系统输送时，氧气浓度可低于21％。

在动物实验期间，给所有试验小鼠口服0.17mg/ml x ml/kg(体重)的恩诺沙星，整个实验过程中均未观察到有小鼠感染，因此本研究中的伤口可以认为是无菌的。

实施例

为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图和具体的实施例对上述技术方案做详细的说明，但本发明不仅限于这些具体的实施例。

试验及检测方法

1.建立小鼠全层皮肤缺损创伤模型的方法：

在实验中使用的是6周龄雄性C57BL/6N小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重在18-22g之间，在22℃至25℃的标准条件下维持12小时的明暗循环，并以正常饮食喂养。所有实验方案均经中国人民解放军总医院动物实验委员会批准，并按照《实验动物管理条例》(中国)执行。实验前，动物们在实验室条件下适应了一周。

(1)硅胶片和抗感染敷料贴的制作

在0.2mm厚的白色透明硅胶片上画出直径为15mm的圆圈，剪刀裁剪成一个硅胶圆盘，将直径为13mm的圆形活检打孔器放在15mm的圆中间，用力压出一个圈，形成一个“甜甜圈”状的圆环，在透明的抗感染敷料贴上贴上画出18mm的圆形，用剪刀裁剪出一个圆形敷料贴，手术前三天用于抗感染的维护，因为造模初期创面有液体溢出，伤口容易粘垫料。

(2)小鼠背部全层皮肤缺损模型的制作

麻醉：2.5％三溴乙醇预麻醉，2.5％三溴乙醇持续麻醉。

固定与备皮：待小鼠完全麻醉后，用透明胶带将其四肢固定在手术台上，剃毛刀进行剃毛，剃除毛发的范围前至颈部，后至距离尾巴1厘米左右。

定位：使用无菌的直径6毫米的活检打孔器在小鼠背部出小鼠背部中间按压一个圆形图案，用马克笔沿着按压痕迹画出一个圆，然后使用无菌手术镊子沿着轮廓中部的皮肤抬起，用剪刀将整个厚度的伤口深延伸至肌肉层，沿着轮廓用剪刀去切除皮肤组织，形成全层皮肤缺损创面模型。

缝合：用6-0黑色尼龙线将圆形硅胶四角固定于伤口上，缝合硅胶片与皮肤，以确保定位，一只小鼠大约缝18～20针，最后用剪好的透明抗感染敷料贴覆盖伤口，以避免感染。

2.创面伤口的评估方法

本发明从创面愈合率、创面愈合时间、组织病理学分析、巨噬细胞定量分析、细胞增殖情况、转化因子-α水平、成纤维细胞生长因子水平、单核细胞水平以及胶原的堆积和代谢等方面，其中创面愈合率、创面愈合时间及组织病理学分析是最直接而有效的创面愈合评价指标。

3.取样和检测方法

(1)拍照和伤口面积计算

使用手机固定架，固定焦距，并在小鼠旁放置一次性卡尺，每天同一时间进行拍照，之后利用I-mage软件处理数据，计算出伤口的面积的值。

(2)取组织

用断颈法处死小鼠后，去除硅胶片，以创面中心为圆心，使用医科剪刀取下半径为0.8点圆环(愈合好的是个实心圆，愈合不好是个圆环)，标注近端(靠近圆心端)远端(正常组织端)，深至真皮层以下，立即放入4％多聚甲醛中浸泡。

(3)骨髓组织的获取

采用断颈法将小鼠处死，2-3分钟后用用生理盐水冲洗干净，将其固定在手术板上，用剪刀将腿部的皮肤组织剥离，暴露出呈长条状的骨组织，小心将其取出，放入一次性培养皿中，记录骨组织的重量，然后装入含有固定液的4ml离心管中固定，为石蜡包埋切片做准备。

(4)小鼠采血

采用摘除眼球采血的方法。左手抓住小鼠的颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将小鼠倒立，用离心管接住流出的血液，采血完毕立即用纱布压迫止血。每次的采血量为0.6～0.1ml。

(5)皮肤组织研磨

从-80℃冰箱取出冷冻的小鼠皮肤组织放入冰盒中，将研钵从烘箱中取出，用泡沫盒盛一些液氮备用；将液氮小心加入并浸满研钵，缓慢加入防止液氮飞溅，浸泡预冷研杵与研钵；当第一次加入的液氮挥发完全后，立即向研钵中缓慢加入约1/2研钵体积的液氮，将冰上存芳备用的皮肤组织迅速转移至液氮内，确保组织全部浸没在液氮中；

使用研杵在液氮中轻轻敲打组织，将组织打碎成小块，在液氮即将挥发完时，使用研杵对组织样本进行碾压研磨，根据组织状态的变化程度，在确保组织始终处于冰冻状态下，及时补充液氮进行研磨，一般30秒～1分钟补充一次，至少补充3次，直至组织被研磨成粉末状；立即用小勺子将粉末状的组织转移至2ml的离心管中，加入合适体积的灭菌的PBS使其与组织充分混合，上下颠倒摇匀至组织已经融化成液体状态，4℃冰箱保存。

(6)石蜡包埋切片制作

脱水透明：石蜡不溶于水而溶于二甲苯等有机溶剂，因此固定好的组织须先用乙醇、丙酮、正丁醇等脱水剂脱去组织中的水。一般用由低到高浓度的乙醇作为脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份，即70％、80％、90％、95％和100％乙醇进行脱水；再将组织块置于透明剂二甲苯中透明，用二甲苯替换出组织块的中乙醇后，进行浸蜡包埋。

浸蜡包埋：将组织块置于溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：将已溶化的石蜡倒入事先制备好的容器中，迅速放入组织块，冷却凝固成块即成。

切片与贴片：将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8μm薄片。将切下的薄片放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。制好后的片子可以在常温保存。

(7)HE染色

将切片置于70℃烤片机中，烤片30min。将烤过后的切片迅速放入二甲苯中，二甲苯I，II各放置5min。100％、90％、80％、70％的乙醇中各放置5min，蒸馏水放5min。把水吸干，滴加苏木素，染色5min，流水冲洗掉苏木素染液。1％盐酸酒精分化1-3s，水洗，置于自来水中浸泡返蓝5-10min。滴加0.5％伊红染液1滴，染色10-15s，蒸馏水清洗。80％、90％、95％和100％乙醇进行脱水。二甲苯I，II各5min。滴加一滴中性树胶于组织上，盖玻片封片。24h后置于显微镜下观察拍照。

(8)Masson染色

用于显示组织中纤维的染色方法之一，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。主要适用于胶原蛋白和平滑肌的鉴别分析，广泛用于结缔组织、肌肉组织和胶原蛋白的研究等，操作见解，性能稳定，显色清晰。经过染色，胶原纤维呈现蓝色，胞浆、纤维素等呈红色，细胞核呈蓝紫色。

染色前先用蒸馏水润湿拨片30～60秒；核染液染色60秒左右，倒丢，冲洗液冲洗30秒左右；浆染液染色30～60秒，倒丢，冲洗液冲洗30秒左右；黄色分色液分色6～8分钟弃去分色液；直接用蓝色复染液染色5分钟左右，倒丢，用无水乙醇冲洗干净；用吹风机吹干后，直接用无毒环保封片剂封片，然后进行镜检。

(9)免疫组化

免疫组化技术在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。免疫组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法(一步法)、间接法(二步法)、桥联法(多步法)等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。本申请使用的免疫组化间接染色法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。

将切片置于70℃烤片机中，烤片30min；将烤过后的切片迅速放入二甲苯中，二甲苯I，II各放置10min。切片迅速放入100％、90％、80％、70％的乙醇中各放置5min，之后蒸馏水中放1min；组织上滴加新鲜配制的3％H

滴加1:20稀释的DAB工作液于组织上，显色10s，在显微镜下观察显色程度。显色结束后用蒸馏水冲洗约3min。把水吸干，滴加苏木素，染色3-5min，流水冲洗掉苏木素染液。1％盐酸酒精分化1-3s，水洗，置于自来水中浸泡返蓝5-10min。

80％、90％、95％和100％乙醇进行脱水；二甲苯I，II各5min；滴加一滴中性树胶于组织上，盖玻片封片。24h后置于显微镜下观察拍照。

(10)体外血管生成实验

实验前一天将Matrigel置于冰盒中，放入4℃冰箱过夜，使胶缓慢融化，同时准备一些4℃预冷的枪头用于吸入Matrigel；取出血管生成载玻片，每孔中加入10μl的Matrigel，盖上盖子；将血管生成载玻片放入一个10cm的培养皿中，将整个培养皿放入培养箱中，静置30分钟，等待胶凝结；制备密度为每ml含2*105个细胞悬液，充分混匀；将胶已经凝固的血管生产载玻片取出，每孔加入50μL的细胞悬液，盖上盖子，静置一段时间后，所有细胞会沉下去落在Matrigeld的表面；按照细胞的生长速度定时采集图像，并且对其成管长度，覆盖面积，成环数等进行测量和记录，进行统计分析。

(11)ELISA酶联免疫吸附方法

样品的预处理：所选取的皮肤组织样品应先用样品稀释液1:500000稀释，方法应为：10μL样品加入990μL稀释液，配成样品液A(1:100)；取10μL样品液A加入990μL稀释液，配成样品液B(1:10000)；取10μL样品液B加入490μL稀释液，配成样品液C(1:500000)，即为最终应加入孔板的最终样品液。

加样：加一定稀释的待检样品0.1mL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1mL。37℃孵育0.5-1h，洗涤。

加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃10-30分钟。

终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05mL。

结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

(12)脾脏外周血单个核细胞(PBMC)的分离及计数

将分离得到的脾脏组织浸泡在灭菌的PBS缓冲液中；无菌培养皿中加入10mlPBS溶液，放入75μm的细胞筛，将脾脏取出放于细胞筛中，用无菌注射器的按压处的末端对组织进行轻轻碾压，使得膜内细胞慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；

吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲洗培养皿后移入离心管中，1500rpm离心15min；去除上清，轻轻弹散细胞沉淀，加红细胞裂解液至3ml，轻轻吹打混匀并室温静置4min，以破坏红细胞，然后加PBS至10ml，1500rpm离心5min；去上清，加PBS重悬10ml，过滤网二次过滤，以除去不可溶的组织纤维，1500rpm离心5min；去上清，加细胞培养基或PBS至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液；

细胞计数：将上述细胞悬液进行10×稀释，混匀后取出15u加至盖玻片的边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间，计算计数板中4大方格的细胞总数。

(13)流式细胞术(以检测细胞膜分子为例)

细胞重悬：对组织匀浆液进行计数后，用细胞洗液(含2％BSA的PBS)重悬细胞，使细胞浓度为1×107/ml；

对照设置：空白对照、同型对照、待测样本每管取100ul上述重悬的细胞，使每管细胞数达到1×106/管；

一抗孵育：空白对照管不加抗体，同型对照管和待测样本管分别加入5-20ul同型抗体和靶标抗体充分混匀，至4℃孵育30分钟，孵育期间每隔10分钟晃动一下反应管，使细胞和抗体充分反应；

细胞清洗：加入适量细胞洗液，1000rpm离心5分钟，弃上清，反复洗涤2次；

细胞重悬：使用100ul细胞洗液重悬细胞；

二抗孵育：同型对照管和待测管分别加入适量的荧光标记的二抗，充分混匀，至4℃避光孵育30分钟，期间每10分钟晃动一下反应管；

洗吧清洗：加入适量细胞洗液，1000rpm离心5分钟，弃上清，反复洗涤2次；

上机检测：使用100-200ul细胞洗液重悬细胞，先测空白管和同型对照管，再测待测管。

(14)数据分析

本实验所有数据资料均采用统计软件GraphPad Prism 5.01版本进行数据分析。在符合正态性和方差齐性的前提下，以均数±标准差(m±s)进行统计学描述；统计推断则采用t检验(t-test)。

实施例1.氢氧混合气体吸入对创面愈合速度的影响。

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

从图1的小鼠皮损对比照片可以看到三组愈合情况的不同，痂是伤口表面上由血小板和纤维蛋白凝结而成的块状物，在造模后的初期，如果发生过多的炎症反应，渗出液过多，就会出现这种干燥、深色的痂；三组伤口均有逐渐愈合的现象，高氢氧组在整个11天的愈合过程中，没有出现明显的坚硬的痂，以及伤口表面渗出液的现象，而低氢氧组和对照组分别从第3天和第2天开始有痂的出现。

通过比较图2中三组之间的I-mage伤口面积量化结果，采用双向方差分析检验(P＜0.05用一颗星表示，P＜0.01用两颗星表示，P＜0.001用三颗星表示，P＞0.05无星)，差异出现在吸入氢气的第一天，并在第5天出现显著性差异(P＜0.05)，第9天高氢氧组较Control对照组出现差异最大(P＜0.0001)，第11天低氢氧组也达到差异最大(P＜0.0001)，造模11天后，高氢氧组的创面愈合速度明显快于低氢氧组和Control对照组，第11天伤口愈合百分比约为90％(高氢氧组)、70％(低氢氧组)、30％(Control对照组)。

三组数据的结果说明，在氢氧混合气的作用下，小鼠背部全层缺损模型的伤口愈合速度显著加快，并呈现剂量依赖性，即高氢氧组愈合率显著高于低氢氧组，均高于Control对照组，表明了在吸入高剂量氢氧气的情况下愈合效果能够做到更好，提示了氢氧混合气对于治疗伤口愈合具备可做进一步研究的可行性。

实施例2.氢氧混合气体吸入对血管生成的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

采用荧光免疫组化染色的方法，检测高氢氧组、低氢氧组和Control对照组对中皮肤组织CD31、CD34、VEGF的表达，观察氢氧混合气对创面皮肤组织中血管生成的影响。CD31是血小板-内皮细胞粘附分子，主要存在于粒细胞、单核细胞和某些类型的T细胞表面，以及血管内皮细胞间紧密连接处，往往和血管生成的激活相关；CD34是高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞表面，目前有研究表面CD34分子在介导细胞间粘附作用发挥着重要重要，并与血管生成相关，CD34通常标记未成熟的微血管或单一的内皮细胞；VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，在体内诱导血管的新生。三种典型的血管生成标志物染色结果如图3所示。

三种血管相关因子的荧光免疫组化检测结果中，白色边框圈出部分能更明显的看出高氢氧组的CD31和CD34在伤口组织中的强阳性，低氢氧组存在少量的阳性，说明现有的氢气浓度不足以使其发生显著性变化。Control对照组几乎看不出阳性结果的出现。VEGF在三组的表达均不是特别高，但仍能看出，高氢氧组要比另外两组的阳性率更高一些。综上提示了高氢氧组的血管生成可能更好。

实施例3.氢氧混合气体吸入对组织重塑的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

Masson染色是对组织中胶原纤维的定位定量的染色方法之一，胶原纤维呈蓝色，胞浆、纤维素等呈现红色。造模后的第11天，即创面愈合的晚期阶段，提取创面组织(包括新生组织和正常皮肤)，采用HE和masson染色方法，观察氢氧混合气对创面愈合的影响，其中Masson染色实验选取的部位和HE保持一致，结果如图3所示。

高氢氧组上皮细胞堆积的更多，细胞排列紧密，细胞形状规则，细胞核、细胞质分别染色均匀，说明新生组织的上皮化更好，而低氢氧组和对照组的细胞形态相对不规则，上皮化程度较低，并且对照组可明显看出，组织周围大量炎症细胞浸润，皮肤组织出现断层；Masson染色可见胶原纤维排布规整，细胞更紧密；低氢氧组真皮层的厚度较薄，未见大量的胶原排布；而Control对照组的上皮化并不明显，而且新形成的上皮层与真皮层分离。

实施例4.氢氧混合气体吸入对胶原堆积的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

α-SMA(alpha-smooth muscle actin)是α平滑肌肌动蛋白，是肌成纤维细胞骨架中的主要标志蛋白，目前普遍认为α-SMA是肌成纤维细胞的主要标志；col-1(collagenmarker type I)是i型胶原蛋白，主要分布于皮肤、肌腱等组织，占全部胶原蛋白含量的80％～90％左右。伤口收缩是组织修复正常和必需的过程，当伤口成纤维细胞的分泌活动结束后，在细胞因子和生长因子的作用下，转变成表达可收缩的肌动蛋白α-SMA的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是细胞外基质合成的主要细胞，不仅能够拉紧伤口边缘使之帮助皮肤组织的收缩和上皮形成，还对基质的重构有着重要作用。胶原是动物皮肤内广泛存在，含量丰富的纤维蛋白质，在愈合的后期阶段，不同类型的胶原蛋白比例开始变化，如三型胶原向I型胶原蛋白的转化，I型胶原蛋白ECM的主要成分之一，在不同的细胞之间存在很强的亲和力和粘附力，还能刺激组织的再生与修复，合成新的、更稳定的ECM。CK14伤口愈合的关键在于周围组织的角化细胞移动至伤口处，帮助恢复表皮的屏障功能，角蛋白是存在于皮肤上皮细胞质中的结构蛋白，是表皮的主要分化产物，细胞角蛋白14(CK14)是组成细胞骨架的蛋白质之一，对伤口的新上皮化起着关键作用，可以通过检测CK14的表达水平反应角化细胞的分化和成熟情况。

因此，为了进一步证实吸入氢氧混合气后对ECM(尤其是胶原)的沉积有影响，采用荧光免疫组化和普通免疫组化，选用α-SMA和col-1两种胶原蛋白标志物，检测小鼠皮肤组织α-SMA、col-1、K14、ki67分子的表达量，观察氢氧混合气对皮肤组织切片胶原堆积的作用。

图5为IHC检测石蜡切片中α-SMA和col-1的表达，可见，在高氢氧和低氢氧组中，α-SMA含量接近，α-SMA显示强阳性的表达，表明了肌成纤维细胞的增值，而Control对照组中仅见微弱的阳性。

而66％H

由上述的创面愈合速率结果可知，从第三天开始，三组之间的伤口闭合率的差异变得显著，因此，检测了第3天伤口床皮肤组织中的胶原沉积水平，如图6所示。Masson染色中66％H

为了证实吸入氢氧混合气后对创面愈合后期组织重塑带来的影响，对第12天的伤口床角蛋白14(K14)和Ki-67进行了免疫组织化学染色，与5％H

对照例1.高氧、纯氢吸入对创面愈合速度的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：高氧组(吸入33％氧气)、NAC纯氢组以及Control对照组。

多次的重复试验表明，66％氢氧吸入对创面的愈合效果确实比较好，考虑到氢分子一直被报道具有抗炎的作用，目前大多数的研究推测氢分子发挥生物学效应是通过特异性抑制活性氧(ROS)的爆发，因此又增加了设计了活性氧抑制剂(NAC纯氢组)组。而现有研究证实高浓度氧气吸入可以增加血氧含量，提高血氧分压，向组织细胞提供所需氧气，同时增加血氧弥散，提高组织氧储备量来达到治疗的效果，对于创伤愈合均有一定的疗效。因此增加了高氧组和纯氢组进行实验，以便与前述实施例1的实验结果进行对照。

高氧组使用氧气源连接吸入导出口输送到透明容器中，供治疗小鼠吸入，每次呼吸1小时，一天一次。NAC纯氢组为使用氢气源供治疗小鼠吸入，每次呼吸1小时，一天一次。

实验结果表明，尽管高氧组和NAC纯氢组的愈合效果稍微优于对照组，但未见显著性差异，且三组的愈合率在第11天时均仅达30％左右，远远落后于本发明实施例1的氢氧组，这与之前的分析结果一致，参见图6。同时本研究还采用了HE和Masson染色，观察伤口的上皮化和胶原表达情况，可以看出，33％O

实施例5.氢氧混合气相对于纯氢吸入对创伤表皮层生长的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

通常情况下，自皮肤损伤第3天，增值阶段开始进行，表皮层开始生长，在此期间，角化细胞在各种因子的作用下迁移到创面处，引起新的上皮化过程。为了验证吸入H

实施例6.氢氧混合气对干细胞增值和分化的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

正常表皮细胞包括表皮干细胞(ESCs)、短暂增值细胞和其他类型的角质细胞，以ESCs为主的皮肤基底层不断增生分化并向上迁移，这对于维持表皮的自我更新和修复至关重要，从而来促进伤口的愈合，角蛋白是表皮细胞的结构蛋白，具有支撑和保护的功能，目前已有足够的证据表明角蛋白15可以作为表皮干细胞的标记分子物；人类的p63基因位于染色体3q27-3q29区，是p53的同源基因转录因子，能够区分表皮干细胞和暂时增值细胞，因而p63被认为是表皮干细胞的标记物。吸入氢气使得伤口愈合的速度加快，由实施例6结果可知，生长因子对其上皮化进程的功效较小，因此进行氢氧混合气和新上皮细胞的形成和迁移的有关实验。

因此本发明申请人采用免疫化学方法测定了损伤第3天皮肤组织石蜡切片中的K15、P63的表达水平，如图11所示。IHC检测干细胞来源的k15和P63在皮肤组织中的表达情况，结果可以看出，K15在66％H

目前，富含亮氨酸重复序列的G蛋白欧联受体5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptors 5，LGR5)和LGR6已经被证实是最重要的毛囊干细胞(HFs)的标记分子，我们利用IHC方法检测LGR5和LGR6在皮肤损伤第3天的表达情况，结果如图12所示，三组的LGR6均呈现阴性，而LGR5均高表达，可以看出66％H

由上述结果可知，66％H

因此，本发明申请人推断，吸入氢气使得伤口愈合较快是由于在氢气作用下，LGR5和K15分子被提前激活，表皮干细胞提前进入了增值和分化期。Ki67是一种核蛋白，与细胞的增值相关，是判断细胞活跃程度的重要指标，基于以上研究结论，对第2天和第3天的组织切片进行Ki67的免疫化学染色，结果如图14所示。通过IHC检测ki67在第3天的表达情况，来进一步验证表皮细胞的增值情况，染色结果显示，66％H

综上所述，LGR5和CK15被66％含氢量的氢氧混合气激活，初步判断是毛囊干细胞的增值和分化加快了上皮化的进程，提高了创面愈合的速度。

实施例7.氢氧混合气对伤口床代谢的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为两组：66％H

氢氧混合气可以促进表皮层的生长可能并非通过分泌局部生长因子来发挥作用，而是通过激活干细胞，促进其增值和分化，而分析小鼠的愈合速率可知，高氢氧组和对照组产生显著差异发生在创伤后的第3天。因此，本发明申请人提取了第3天皮肤创面组织样本，对伤口床进行代谢组学分析，分析结果如图15所示。主成分分析算法(PCA)是最常用的线性降维方法，图15中对组内样本进行了PCA分析，反映样本之间的代谢差异和变异性，图中表格显示了高氢氧组和对照组的脂质产物无明显变化，而水相代谢物中共有12个代谢物差异显著，该12种水相代谢物都是氨基酸及其衍生物，氢氧混合气使其均上调。聚类分析是通过数据建模简化数据的一种方法，往往用于反映不同实验条件下样品差异表达量的变化模式，本部分研究对差异显著的12种亲水性代谢物(L-脯氨酸、4-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、非对称二甲基精氨酸、鸟氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和L-甲硫氨酸)进行统计学分析，结果如图16所示高氢氧组和对照组之间聚类良好，分界明显，具体如图17所示。

L-脯氨酸、4-羟脯氨酸是胶原最主要的合成原料；L-异亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸属于TCA循环的中间产物或能与之相互转化的物质；非对称二甲基精氨酸、鸟氨酸属于尿素循环的中间产物或能与之相互转化的物质；L-丝氨酸、L-亮氨酸尽管不涉及TCA循环及尿素循环两条通路，但已有研究证明其与胶原合成具有关联的物质；L-苯丙氨酸、1-甲基组氨酸和L-甲硫氨酸目前还未有研究表明其与胶原的形成有关。如图17所示，分别表示了按代谢途径和作用分组后以下氨基酸或其衍生物在两组样本中的差异表达情况。

其中作为胶原合成原料的L-脯氨酸，在高氢氧处理组样本中表达显著高于对照组(p<0.01)，而另一存在差异的原料分子4-羟脯氨酸在氢气处理组中表达升高，但无显著性差异；此外，氢气处理组中和尿素循环过程相关且具有差异的非对称二甲基精氨酸、鸟氨酸两种分子均显著高于对照组，提示了氢气处理可能显著提升组织内经由尿素循环代谢途径合成脯氨酸，并以此作为原料产生胶原的过程；天冬氨酸和天冬酰胺之间能够相关转化，在尿循环中，天冬氨酸是一个重要的分子，以其为原料，精氨琥珀酸合成酶能够催化瓜氨酸向精氨琥珀酸的合成，得到的精氨琥珀酸在精氨琥珀酸裂解酶催化下能生成精氨酸，并进入脯氨酸等的合成渠道，由此在皮肤组织中产生更高含量的脯氨酸，合成胶原，促进创面愈合。

综上所述，非靶向代谢组学分析发现，高氢氧处理后第3天，伤口床代谢物出现显著差异，上调的12种代谢物均为水相代谢物，其中脯氨酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、鸟氨酸等为胶原ECM合成的主要原料，因此本实验对胶原的形成进行了进一步的验证。

实施例8.氢氧混合气体吸入对胶原堆积的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

伤口区域的血流量和血氧水平，是检测血管形成的重要参数，而形成血管又是创面愈合过程中最重要的指标之一，因此采用激光多普勒血流血氧成像仪检测造模后的早期阶段(0-4天)和晚期阶段(4-12天)，每次检测的时间分辨率为1秒-1分钟，每组之间的成像结果如图18和图19所示。

在前4天中，三组之间伤口表面下方的血流灌注量无明显差异，然而从第6天开始，66％H

基于血流灌注量的变化，本研究同时检测了血液中的氧含量，利用血氧仪来评估了皮肤血流的变化，每次观察的时间分辨率为1秒到1分钟，每处检测3次，取均值计入数据，选取了稳定且有代表性的流动图像如图20所示，从图中可以看出，SO

实施例9.氢氧混合气体吸入对新生血管形成的影响

实验方法∶血管形成实验是测量在体外血管生成的一种快速的、可量化的方法，内皮细胞体外管腔形成是模拟体内血管生成过程常用的研究手段。

为了更好的模拟体内实验氢氧气的吸入情况，设置了66％H

新生血管的形成在创面修复的过程中有着十分重要的作用。血管内皮祖细胞是一类能循环和增殖并直接分化为血管内皮细胞的前体细胞，而基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)是能够诱导内皮细胞的定向迁移到损伤部位而参与新血管形成。基于以上研究结果，在骨髓受伤的第3天进行SDF-1α组织化学染色，染色结果如图22显示，66％H

实施例10.氢氧混合气在炎症期对外周血炎症细胞分布比例的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

早期的炎症反应影响着伤口的愈合和细胞质基质的沉积，已有报道显示，氢分子具备抗炎抗氧化的作用。因此，采用全自动血液细胞分析仪(北京大学医学部动物检测中心)检测了全血血常规指标，观察前三天(24小时、48小时和72小时)炎症细胞的变化情况。主要分析炎症相关指标白细胞(WBC)数量、粒细胞比例(GR％)、淋巴细胞比例(LY％)、单核细胞比例(MO％)。结果显示，在前三天的任何时间点上，三组间WBC的数量均无差异，但GR和MO的比例在第三天时却分别下降了约8％和10％，48h，66％H

实施例11.氢氧混合气对组织浸润区炎症细胞分布的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

单核细胞的比例在第72小时下降，原因可能是在伤口处的细胞发生了转化形成巨噬细胞，发挥其吞噬病菌、防御和修复的作用，因此分别在第24h、48h、72h进行了CD86/CD163双荧光免疫组化实验，CD86是M1型巨噬细胞的标志物，M1巨噬细胞是可以产生促炎细胞因子的巨噬细胞，是普通的巨噬细胞，具有吞噬大量病原体的能力，杀死微生物病菌，M2型巨噬细胞常常用CD163标记，是活化的巨噬细胞在组织重塑、血管生成等反应中起着核心作用。双荧光染色结果如图23所示。

可以看出，在前两天M1、M2型巨噬细胞在三组中均几乎呈现阴性表达，72h时，三组均出现阳性(图c1、c2、c3)，66％H

实施例12.氢氧混合气对脾脏T细胞亚型分布的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

脾脏是人体最大的免疫器官，也是重要的淋巴器官。由实施例11结果可知在吸H

在创伤后24h，66％H

实施例13.氢氧混合气以及吸入时间对胶原沉积的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为三组：66％H

伤口收缩是组织修复正常和必需的过程，当伤口成纤维细胞的分泌活动结束后，在细胞因子和生长因子的作用下，转变成表达可收缩的肌动蛋白α-SMA的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是细胞外基质合成的主要细胞，不仅能够拉紧伤口边缘使之帮助皮肤组织的收缩和上皮形成，还对基质的重构有着重要作用。胶原是动物皮肤内广泛存在，含量丰富的纤维蛋白质，在愈合的后期阶段，不同类型的胶原蛋白比例开始变化，如三型胶原向I型胶原蛋白的转化，I型胶原蛋白ECM的主要成分之一，在不同的细胞之间存在很强的亲和力和粘附力，还能刺激组织的再生与修复，合成新的、更稳定的ECM。CK14伤口愈合的关键在于周围组织的角化细胞移动至伤口处，帮助恢复表皮的屏障功能，角蛋白是存在于皮肤上皮细胞质中的结构蛋白，是表皮的主要分化产物，细胞角蛋白14(CK14)是组成细胞骨架的蛋白质之一，对伤口的新上皮化起着关键作用，可以通过检测CK14的表达水平反应角化细胞的分化和成熟情况。因此，本研究通过免疫组织化学染色检测小鼠皮肤组织α-SMA、col-1、K14、ki67分子的表达量，验证氢处理后对ECM(尤其是胶原)的影响。

实施例14.氢氧混合气对上皮化过程的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为两组：高氢氧治疗组和短期对照组。高氢氧治疗组在创伤治疗前吸入氢氧混合气(66.67％氢气+33.33％氧气)，用本发明的氢氧混合气发生器制备的氢氧混合气通过吸入导出口连接到透明容器中，供治疗小鼠吸入，每次呼吸1小时，一天一次。短期对照组在创伤愈合初期(0-3天)吸入氢氧混合气(66.67％氢气+33.33％氧气)，用本发明的氢氧混合气发生器制备的氢氧混合气通过吸入导出口连接到透明容器中，供治疗小鼠吸入，每次呼吸1小时，一天一次，之后自然愈合。

采用激光多普勒血流血氧成像仪检测高氢氧治疗组和短期对照组在治疗阶段的血流情况(4-12天)，每次检测的时间分辨率为1秒-1分钟。在前3天中，两组之间伤口表面下方的血流灌注量无明显差异，然而从第4天开始，高氢氧治疗组的血流灌注量变化显著(P＜0.01)，从第4天开始(P[高氢氧治疗组vs短期对照组]＜0.0001)，一直持续到愈合周期的最后一天血流的变化显著，短期对照组的愈合结果不如预期。

基于血流灌注量的变化，同时检测了血液中的氧含量，利用血氧仪来评估了皮肤血流的变化，每次观察的时间分辨率为1秒到1分钟，每处检测3次，取均值计入数据，结果SO

同时在第3天后，上皮化过程开始变得明显和显著，因此可以判断氢氧混合气处理创面后，不仅在早期阶段即开始促进胶原的沉积，而且在创伤的整个愈合过程均需要呼吸氢氧混合气体，以诱导血管更快的形成，减少血凝块的产生，加快上皮化进程，同时刺激胶原蛋白的沉积。

实施例15.不同浓度的氢氧混合气对愈合速率的影响

实验方法∶小鼠全层皮肤缺损创伤模型造模后，随机分为六组：

95％组(95％氢气+5％氧气)、66％氢氧组(66％氢气+33％氧气)、52％组(52％氢气+26％氧气)、30％组(30％氢气+21％氧气)、NAC组(79％氢气+21％氧气)和低氢氧Control对照组(2％氢气+98％氧气)。

上述氢氧治疗组均在创伤治疗前按不同氢氧配比浓度吸入氢氧混合气(余量为空气，但空气中的氧计入氧含量)，用本发明的氢氧混合气发生器制备的氢氧混合气和空气混合到所需要的浓度，通过吸入导出口连接到透明容器中，供治疗小鼠吸入，每次呼吸1小时，一天一次。

对于治疗小鼠的创伤创面，拍照观察11天，利用I-mage软件进行量化伤口面积，比较六组之间愈合的速度，发现尽管在低浓度时呈现氢气浓度依赖的方式愈合，浓度越高，愈合越快；但在达到66％的氢浓度时达到峰值，继续增加氢气浓度，则反而愈合效果开始下降。

从造模后的创面愈合情况的整体来看，2％的低氢氧Control对照组的愈合效果最差，愈合率仅为53％，其次是5％的氢氧组，愈合率约为70％，而NAC组(79％氢气+21％氧气)和95％组、30％组的愈合效果显著优于对照组，但三组的愈合率在第11天时分别为80％、82％和78％左右，远远落后于66％氢氧气浓度组的92％和52％组的89％，这一愈合量化的结果与之前氢气浓度越高，治疗效果越好的设想不一致。

之后对这一结果进行集中重复观察，各组之间的血流灌注的变化确是从第6天开始变得差异显著，同时对血液中的血氧检测显示从第4天开始66％组和52％组的血氧饱和度、总血红蛋白和脱氧血红蛋白的值均高于其它组，且这一结果是可重复的。这个现象表明66％氢氧组和52％氢氧组的氧水平和容量较其它组更高。结合血管生成的指标CD31、CD34和VEGF的免疫荧光染色结果来看，66％氢氧组和52％氢氧组均表现出了更强的阳性和更高的血管密度，提示了氢氧分子按一定比例和浓度的吸入可能促进血管生成的作用。

胶原是创伤修复过程中重要成分，它的变化贯穿于创面愈合的全过程，对创面后期的组织重塑和成熟起重要作用。本演技利用Masson染色观察愈合后期胶原的形成情况，可知胶原纤维排布规整，细胞更紧密，低浓度氢的真皮层更薄，且未见大量的胶原排布，而对照组的上皮化并不明显，而且真皮-表皮发生分离。进一步研究发现，α-SMA和col-1在66％氢氧组和52％氢氧组中呈现高表达，主要集中在真皮层，提示了高氢气组肌成纤维细胞和I型胶原蛋白的增值更快，这一结果与上述的胶原纤维染色以及多普勒血流血氧检测呼应。

综上所述，申请人认为，氢分子可以通过增加血流血氧的含量，促进血管的形成，上调胶原纤维的沉积量以及细胞的排布，从而加快创面的愈合速率，且具有浓度依赖性，即吸入氢气和氧气在特定浓度范围内，愈合速率更大。多次的重复试验表明，66％氢氧组和52％氢氧组对创面的愈合效果确实比较好。

综上所述，现有技术中普遍认为，氢分子在多重疾病中作用的报道多数集中在其抑制ROS的爆发和抗氧化功能上。但本发明所述的氢氧混合气的吸入对干细胞的激活和ECM的沉积有更多的影响。在动物实验期间，给所有试验小鼠口服恩诺沙星，整个实验过程中均未观察到有小鼠感染，因此本研究中的伤口可以认为是无菌的，而在这种情况下，本身自由基爆炸的程度会轻一些。其次，NAC纯氢组可以看出，除了其抗炎作用，该组几乎延迟了所有的愈合过程，包括M1/M2型巨噬细胞的转化、再上皮化、干细胞的激活以及胶原的沉积等，导致创面并不能良好的愈合。这些研究表明，ROS在创伤治疗中有不可或缺的作用，但吸入氢氧气所产生的治疗作用并不止于此，在伤口愈合的早期阶段(从第3天开始)，吸入H

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。