一种下调MAPK8表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种下调MAPK8表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法。

背景技术

目前已经建立了小分子化合物诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的技术体系。该体系能够在使用一个小分子化合物的条件下诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞，诱导时间仅需要4-8天，诱导效率为3％左右。通过小分子化合物诱导或者干扰/敲除等方法来下调体细胞TGFβR1的表达或者过表达SMAD3都可以得到这一重编程现象，从而获得诱导乳腺上皮细胞。如何更为精确的调控该体细胞重编程现象，可以降低调控上游基因带来的可能存在的副作用。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种下调MAPK8表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法，以克服现有技术的不足，MAPK8是TGFβR1/SMAD3的下游相关基因，能够更加精确的调控该体细胞重编程现象，降低调控上游基因带来的可能存在的副作用。

本发明首先提供了下调MAPK8基因表达在诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞方面的用途。

优选的，所述体细胞为山羊成纤维细胞。

下降低TGFβR1基因表达的方式有很多，包括但不限于，应用小分子化合物抑制剂诱导、基因干扰、基因敲除、基因敲低中的一种。

优选的，MAPK8基因敲除、敲低或干扰降低MAPK8基因表达的方法，包括以下步骤，1)MAPK8基因敲除、敲低或干扰载体的构建；2)利用包装了MAPK8基因敲除、敲低或者干扰载体的慢病毒感染体细胞；3)诱导乳腺上皮细胞。

优选的，步骤2)中，通过以下方法获得敲除，敲低或者干扰MAPK8基因表达的体细胞，a、将慢病毒重组质粒与病毒包膜质粒VSVG、包装质粒NRF共转染293T细胞，其中重组质粒为MAPK8基因敲除、敲低或者干扰质粒；b、用步骤a的病毒液感染体细胞。

优选的，步骤3)中，诱导乳腺上皮细胞的培养基为N2B27培养基或BFTV培养基；其中N2B27培养基包括Knockout DMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、KSR、Glutamine(100×)；且组分体积比为39.6:0.4:39.2:0.8:19:1；BFTV培养基包括N2B27培养基、非必需氨基酸(100×)、β-巯基乙醇(100×)、VPA(V)、Forskolin(F)、Tranylcypromine(T)、TTNPB(B)；其中N2B27培养基、非必需氨基酸(100×)、β-巯基乙醇(100×)的体积比为：98:1:1；、VPA(V)、Forskolin(F)、Tranylcypromine(T)、TTNPB(B)的浓度分别为0.5mM、10μM、10μM、1μM。

利用基因调控方法下调MAPK8表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞。

(一)MAPK8基因敲除/敲低以及干扰质粒载体的构建

参考NCBI上山羊MAPK8(JNK)靶基因序列，设计sgRNA/敲低/干扰靶点序列，合成单链DNA oligo，其两端含酶切位点粘端，经退火处理形成双链DNA，连入相应载体。将连接好的产物使用TOP10感受态转化，菌落PCR得到阳性克隆后测序，从而得到序列正确表达的慢病毒质粒。

(二)慢病毒包装

使用Lipofectamine 3000试剂将慢病毒重组质粒与慢病毒包装载体共转染293T细胞，置于37℃、5％ CO2培养箱转染48-72h后收集病毒悬液。将病毒悬液转移到15mL离心管中，4℃、2000r/min，离心10min，取上清，弃沉淀，0.45um的滤器过滤上清，于-80℃保存。

(三)成纤维细胞的病毒感染以及诱导乳腺上皮细胞的获得

1、待山羊成纤维细胞融合度达到50％时，根据细胞MOI值，加入上述包装好的病毒悬液，12h后观察细胞状态。若细胞状态良好无明显死亡，继续培养至24h后更换为成纤维细胞培养基；如果细胞形态发生明显变化，出现明显死亡，立即更换为成纤维细胞培养基(DMEM+体积分数10％FBS)。

2、病毒感染48h-72h后，进一步加入嘌呤霉素(Puromycin)筛选，得到纯化的敲除/敲低/干扰MAPK8基因的细胞株(MAPK8-GEFs)。

3、MAPK8-GEFs细胞在饱和湿度5％ CO2，37℃培养箱中，使用基础液(N2B27)或小分子化合物培养基(BFTV)培养4-8天，即可获得诱导乳腺上皮细胞(MAPK8-iMECs)。

(四)、下调MAPK8基因表达获得的诱导乳腺上皮细胞的生物学特性鉴定。

通过免疫荧光(Immunofluorescence，IF)对诱导乳腺上皮细胞(MAPK8-iMECs)进行相关蛋白表达的检测。结果显示与对照组比较，诱导乳腺上皮细胞表达乳腺上皮细胞特异性蛋白，包括CDH1、EPCAM和CK8。证明所获得的诱导乳腺上皮细胞具有乳腺上皮细胞的生物学特性。

优选的，用小分子化合物抑制剂诱导降低MAPK8基因表达时，小分子化合物抑制剂为SP600125(P)、DB07268(D)、Cucurbitacin IIb(Cu)、Trans-Zeatin(TZ)、IQ 3(I)、SU3327(S)、Bentamapimod(AS602801)、Indirubin-3′-oxime、NDMC101、Mulberroside A、CC-401Hydrochloride、RPI-1、IMM-H007、Ginsenoside Re、5'-N-Ethylcarboxamidoadenosine(NECA)、IQ-1S、Urolithin B、BI-78D3、JNK Inhibitor VIII、JNKInhibitor IX、JNK-IN-8、Tanzisertib(CC-930)、Doramapimod(BIRB 796)中的一种或两种以上。

具体操作方法：以60mm培养皿为标准，成纤维细胞(Fibroblasts)接种密度为5×105个，接种后加入DMEM+体积分数10％FBS(成纤维细胞培养基/FM)置于5％二氧化碳，湿度95％，37℃的培养箱，培养过夜后更换上述诱导培养基(Induction medium)，再继续诱导培养8天，其中每间隔两天更换一次新的诱导培养基。诱导8天后获得转分化的乳腺上皮细胞(CiMECs)。

优选的，用小分子化合物抑制剂诱导降低MAPK8基因表达时，使用的培养基为N2B27培养基或BFTV培养基；N2B27培养基包括Knockout DMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、KSR、Glutamine(100×)；且组分体积比为39.6:0.4:39.2:0.8:19:1；BFTV培养基包括N2B27培养基、非必需氨基酸(100×)、β-巯基乙醇(100×)、VPA(V)、Forskolin(F)、Tranylcypromine(T)、TTNPB(B)；其中N2B27培养基、非必需氨基酸(100×)、β-巯基乙醇(100×)的体积比为：98:1:1；、VPA(V)、Forskolin(F)、Tranylcypromine(T)、TTNPB(B)的浓度分别为0.5mM、10μM、10μM、1μM。

利用小分子化合物抑制剂下调MAPK8表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞。

基础液(N2B27)：100mL体系：

BFTV培养基：100mL体系

以N2B27或BFTV培养基为基础(实施举例以N2B27为例)，添加以下小分子化合物中的一种或几种SP600125(P)、DB07268(D)、Cucurbitacin IIb(Cu)、Trans-Zeatin(TZ)、IQ 3(I)、SU3327(S)、Bentamapimod(AS602801)、Indirubin-3′-oxime、NDMC101、MulberrosideA、CC-401 Hydrochloride、RPI-1、IMM-H007、Ginsenoside Re、5'-N-Ethylcarboxamidoadenosine(NECA)、IQ-1S、Urolithin B、BI-78D3、JNK Inhibitor VIII、JNK Inhibitor IX、JNK-IN-8、Tanzisertib(CC-930)、Doramapimod(BIRB 796)，形成诱导培养基。

具体操作方法：以60mm培养皿为标准，成纤维细胞(Fibroblasts)接种密度为5×10

本发明同时提供一种下调MAPK8表达诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法，应用小分子化合物抑制剂诱导、基因干扰、基因敲除、基因敲低中的一种，下调MAPK8基因表达。

相对于现有技术，本发明可以利用下调MAPK8基因表达在4-8天内将体细胞诱导重编程为乳腺上皮细胞，可应用于高效精准的调控体内特定组织细胞重编程为乳腺上皮细胞，更加有利于体内乳腺再生与修复。同时也有利于简单高效收集和纯化诱导乳腺上皮细胞分泌物。

附图说明

构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例一中，敲除MAPK8诱导成纤维细胞重编程为乳腺上皮细胞(Ko-MAPK8-iMECs/Ko-MAPK8-GEFs-8d)的形态变化图。GEFs-空载组未形成上皮样细胞聚集。标尺，100μm；

图2为本发明实施例一中，免疫荧光检测GEFs、Ko-MAPK8-iMEC细胞和GEF-空载细胞(空载对照组)以及R-8D细胞(阳性对照组)中成纤维细胞的特异性标记抗原(Vimentin)和乳腺上皮细胞的特异性标记抗原(CK8、CDH1、EPCAM)。结果显示Ko-MAPK8-iMEC表达CK8、CDH1、EPCAM，而GEFs、GEF-空载细胞(空载对照组)以及R-8D细胞(阳性对照组)则不表达；

图3为本发明实施例二中，SP600125诱导成纤维细胞转分化获得乳腺上皮细胞(SP-8d/SP-CiMECs)的形态图；

图4为本发明实施例二中，免疫荧光结果显示SP600125诱导成纤维细胞转分化获得的乳腺上皮细胞(SP-8d/SP-CiMECs)表达乳腺上皮细胞特异性抗原EPCAM、CD49f、CK8和CK19；

图5为本发明实施例二中，WB结果显示SP600125诱导成纤维细胞转化得到的乳腺上皮细胞(SP-8d/SP-CiMECs)表达beta酪蛋白(CSN2)。R-CiMECs为阳性对照组，GEFs为阴性对照组。与GEFs比较，MAPK8在R-CiMECs和SP-CiMECs中下调，表明小分子化合物诱导下调MAPK8的表达水平。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明创造中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。

实施例一

通过敲除MAPK8的方法已成功将关中奶山羊的成纤维细胞重编程为乳腺上皮细胞。

具体操作如下：

1、敲除MAPK8载体的构建与鉴定

1.1sgRNA设计与合成

根据GenBank上提供的山羊MAPK8基因编码序列，根据载体酶切位点设计sgRNA靶点序列，合成单链DNA oligo，用于目的基因的扩增。详细序列见表1和表2。

表1sgRNA序列

Table 1The sequence of sgRNA

表2oligo序列

Table 2The sequence of oligo

1.2RNA的提取及cDNA的合成

(1)总RNA提取。去掉培养基用PBS洗三次，加入1ml预冷的TRIZOL裂解液，吹打混匀后冰上放置5min，使之充分裂解。加入200μL的氯仿，盖紧，剧烈震荡15s，置EP管于冰上5min。12000r/min，4℃离心15min。离心结束后，取上层水相转移到预冷的异丙醇中，颠倒混匀后冰上放置5min。再次离心(4℃，12000r/min，10min)。离心结束后除去上清液，加入1mL预冷的体积分数75％乙醇，指尖轻弹管底使RNA悬浮，充分洗涤RNA和管壁，4℃离心(7500r/min，8min)。在离心的同时制备质量分数1％琼脂糖凝胶，用来检测提取RNA的质量，制好备用。离心结束后，弃去上清液，待沉淀呈半透明状时，加入适量DEPC水完全溶解RNA，取1μL进行纯度和完整性检测，其余进行反转录或者冻于-80℃冰箱待反转。(2)cDNA的合成。采用两步法合成CDNA，按照Vazyme R223-01合成试剂盒方法，第一步，去除基因组DNA:模板RNA1ug，4x gDNA wiper Mix4uL,RNase-free ddH20补足体积至16μL，混匀，42℃放置2min；第二步，逆转录反应：在第一步的产物中直接加5x HiScriptII qRT SuperMix II 2uL，50℃孵育15min；85℃孵育5s。cDNA置于-20℃保存备用。

1.3RT-PCR扩增目的基因

以cDNA为模板，PCR扩增山羊MAPK8基因。反应体系：金牌Mix(green)45μL；10mmol/L上下游引物各2μL；模版cDNA 1μL(400ng/μL)。PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；70℃退火10s；72℃延伸14s；30个循环；72℃终延伸1min；4℃结束反应。

1.4载体构建及测序

PCR产物经质量分数1.0％琼脂糖凝胶电泳检测分离，将目的DNA片段进行胶回收，纯化。将空载用限制性内切酶BsmBI进行酶切反应，回收酶切产物，用T4连接酶与目的DNA片段进行连接。将连接产物转化TOP10感受态细胞，在含氨苄青霉素(Amp+)抗性的LB固体平板培养基上涂布，置于37℃培养箱倒置培养12～16h。挑取单克隆，在含Amp+的LB液体培养基中继续培养。将菌液进行菌落PCR鉴定，选取鉴定正确的菌液用质粒提取试剂盒提取质粒进一步酶切鉴定，将鉴定正确的质粒进行测序。测序正确的质粒将其对应菌液进行扩大培养，用去内毒质粒提取试剂盒提取重组质粒，命名为：Ko-MAPK8，置于-20℃保存备用。

1.5慢病毒的包装及收集

使用Lipofectamine 3000试剂将慢病毒重组质粒KO-MAPK8与慢病毒包装载体VSVG和NRF共转染293T细胞，置于37℃、5％ CO

2、慢病毒感染

将山羊成纤维细胞(GEFs)以2.5×10

待细胞融合度为85～90％时，用胰蛋白酶消化细胞进行传代处理，传代后细胞融合度达60％左右时，在培养基中加入3μg/mL的嘌呤霉素进行抗性筛选，获得纯化的敲除MAPK8的细胞株(Ko-MAPK8-GEFs)。

3、诱导乳腺上皮细胞的获得

将Ko-MAPK8-GEFs和对照组GEFs-空载细胞以5×10

4、免疫荧光(IF)检测乳腺上皮细胞标志蛋白。

为探究上述所获得的诱导乳腺上皮细胞(Ko-MAPK8-iMECs)是否表达乳腺上皮细胞的标志性抗原，利用免疫荧光技术对GEFs、Ko-MAPK8-iMECs细胞和GEFs-空载细胞以及R-8D(R-CiMECs，阳性对照组)进行免疫荧光检测。结果表明，Ko-MAPK8-iMECs细胞和R-8D均表达乳腺上皮细胞标志性抗原CK8、CDH1、EPCAM，不表达成纤维细胞标志性抗原Vimentin。同时，GEFs和GEFs-空载细胞则不表达乳腺上皮细胞标志性抗原，只表达成纤维细胞标志性抗原。具体操作如下：用4％PFA室温固定细胞20min，加体积分数1％的TritonX-100，室温孵育15分钟；1％的BSA，封闭1.5-2h后，加入一抗，4℃孵育过夜；次日，孵育二抗，室温1.5h，进行拍照。

综上所述，目前实验结果可以证明在成纤维细胞中敲除MAPK8基因可以获得诱导乳腺上皮细胞。

实施例二

通过小分子化合物抑制剂SP600125(MAPK8抑制剂)诱导的方法已成功将关中奶山羊的成纤维细胞重编程为乳腺上皮细胞。

具体操作如下：

1、MAPK8抑制剂(SP600125)诱导乳腺上皮细胞的形成。

成纤维细胞培养基：DMEM+体积分数10％FBSSP600125诱导培养基(SP)：N2B27+1μMSP600125。

将山羊成纤维细胞以5×10

2、免疫荧光染色(Immunofluorescence，IF)以及蛋白免疫印迹(western blot，WB)检测SP-CiMECs细胞的乳腺上皮细胞标记性抗原。

结果如图4和图5显示：与阳性对照组R-8d(R-CiMECs)类似，SP-CiMECs(SP-8d)细胞表达乳腺上皮细胞标记蛋白EPCAM、CD49f、CK8、CK19以及酪蛋白CSN2。同时，SP-CiMECs组的MAPK8的蛋白表达量显著下调。

IF具体步骤如下：质量分数4％多聚甲醛(PFA)室温固定培养板中的细胞20min；阻断液清洗三次，每次清洗5min；然后加体积分数1％TritonX-100透化细胞，室温15min；阻断液再次清洗三次；随后加入体积分数5％驴血清封闭非特异性位点，室温条件下封闭2h；用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗三次，每次5min；加入一抗，置于4℃孵育过夜；次日，将培养板置于室温条件下，复温20min，随后用TBP清洗3次，每次5min，避光加入二抗和Hoechst混合液，室温孵育1h；TBP溶液洗3次，即可进行荧光显微镜观察拍照实验。WB具体操作步骤如下：细胞在含有蛋白酶抑制剂的变性裂解缓冲液中溶解30分钟，12,000rpm/min,4℃离心10min；用BCA蛋白检测试剂盒测定裂解液中的蛋白浓度；用质量分数12％蛋白胶进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到硝化纤维素滤膜，脱脂奶粉室温封闭1小时；孵育一抗，4℃过夜；次日，孵育二抗，室温1h；进行显影。

综上所述，MAPK8抑制剂(SP600125)可以诱导山羊成纤维细胞重编程为具有泌乳功能的乳腺上皮细胞。