一种异槲皮素的制备方法

技术领域

本发明涉及生物转化技术领域，具体为一种异槲皮素的制备方法。

背景技术

芦丁，又称为芸香苷、维生素P，分子式为C27H30O16，是一种天然的黄酮苷。广泛存在于植物的根、茎、叶等部位，其含量在槐、芸香草、红旱莲、荞麦等植物中较高。芦丁具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗病毒等功效，广泛应用于生物医药领域。

异槲皮素，是芦丁的去鼠李糖基产物异槲皮素(槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷)，异槲皮素在安全性，生物利用度和某些活性方面相比芦丁具有的显著的优势。异槲皮素具有更好的生物利用度，能够更好地被吸收。酶法修饰(α-葡萄糖基化)的异槲皮素是目前唯一被美国FDA批准的的黄酮类食品添加剂。异槲皮素与许多特殊的生物活性成分一样，虽然广泛分布于天然产物中，但含量很低，难以提取分离进行大规模制备。因此，一种高效制备异槲皮素的方法对其广泛的应用具有重要意义。

α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶，主要作用于α-1，2、α-1，3、α-1，4、α-1，6以及α1链接的糖苷键，能够水解结合与底物末端非还原性的α-L-鼠李糖糖苷键，同时释放出鼠李糖和相应的配基。芦丁与异槲皮素两者之间仅相差一个鼠李糖，通过有效的手段选择性地切除芦丁上的鼠李糖残基将易于获得低含量高附加值产物异槲皮素。

现有的异槲皮素的制备通常采用加压方式断掉鼠李糖，这使普通设备难以满足反应要求，且得到的异槲皮素的收率和含量都比较低。通过微生物转化和酶转化制备异槲皮素也多有研究，但反应时间长，芦丁浓度低，后续纯化复杂并应用了大量有机溶剂等，进一步增加了生产成本；鉴于此，我们提出了一种异槲皮素的制备方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效稳定且环保的酶法制备异槲皮素的方法，通过α-L-鼠李糖苷酶水解，能够有效地通过酶催化水解芦丁获得异槲皮素。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种异槲皮素的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1、首先将芦丁置于反应釜中，加入醇和缓冲液；

S2、加入酶制剂，进行酶解反应；

S3、将S2步骤所得反应液冷却后过滤；

S4、将S3步骤所得滤饼加入醇搅拌溶解后，加入活性炭进行脱色；

S5、将S4步骤所得过滤，滤液浓缩后，放置冷却结晶；

S6、将S5步骤所得过滤，结晶干燥。

可选的，所述S1步骤中芦丁先用醇润湿后再加入缓冲液，所述芦丁与醇的质量比为1:1-2。芦丁与缓冲液的比例为1:100-150；

所述芦丁液相含量为≥95％，所述醇为乙醇或甲醇，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠，乙酸-乙酸钠其中的一种或多种混合物。

可选的，所述S2步骤中酶为微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶，所述鼠李糖苷酶与芦丁的质量比为0.35-0.45：1，鼠李糖苷酶先用少量缓冲液溶解后再加入。

可选的，所述S2中酶解反应时间为4-6，pH为4.0-5.0，反应温度为45-60℃。

可选的，所述S3步骤中冷却温度为0-10℃，冷却时间为2-3h，S3步骤中过滤后收集滤液以制备鼠李糖。

可选的，所述S4步骤中加入醇的量为芦丁量的10-20倍，活性炭用量为芦丁量10％-20％。

可选的，所述S4步骤中脱色时间为40-80min，脱色温度为60-75℃。

可选的，所述S5步骤中冷却温度为2-8℃，冷却时间为4-8h。

可选的，所述S6进一步的包括：以芦丁为底物，鼠李糖苷酶为催化剂，在缓冲液中进行反应生成异槲皮素。

本发明提供了一种异槲皮素的制备方法。具备以下有益效果：

1、该异槲皮素的制备方法，使用的鼠李糖苷酶，酶活稳定，所使用的设备简单，条件温和，步骤简单，产物单一，所得异槲皮素收率高，纯度可达95％以上，适合工业化生产，可以满足食品和医药应用。

2、该异槲皮素的制备方法，芦丁经水解后，水解液进一步对其进行常规纯化处理即可制备鼠李糖。因此采用本发明方法，可同时制得异槲皮素和鼠李糖。

3、该异槲皮素的制备方法，原料芦丁易得，溶剂仅使用水和醇，原辅料成本低，原料转化率高，操作安全简单，环境友好。

附图说明

图1为本发明原料芦丁液相色谱图；

图2为本发明产物异槲皮素液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

请参阅图1-图2，本发明提供一种技术方案：一种异槲皮素的制备方法，包括以下步骤：将芦丁10g置于反应容器中，加入乙醇10ml将芦丁润湿，再加入100ml柠檬酸-柠檬酸钠(pH4.2)，45℃±2℃，搅拌20min。加入鼠李糖苷酶3.8g，酶用少量缓冲液溶解后加入，45℃±2℃搅拌反应5h。转化结束4℃冷却1h后将反应液过滤，滤液收集以制备鼠李糖，滤饼加入130ml乙醇，1g活性炭，70℃±2℃，120r/min搅拌脱色1h。结束后过滤，滤液浓缩至小体积，放置冷却结晶，抽滤后得到异槲皮素，干燥。

实施例2：

本发明提供一种技术方案：一种异槲皮素的制备方法，包括以下步骤：将芦丁20g置于反应容器中，加入乙醇25ml将芦丁润湿，再加入260ml柠檬酸-柠檬酸钠(pH5.0)，55℃±2℃搅拌20min。加入鼠李糖苷酶8.0g，酶用少量缓冲液溶解后加入，55℃±2℃搅拌反应5h。转化结束后将反应液过滤，滤液收集以制备鼠李糖，滤饼加入300ml乙醇，20g活性炭，65℃±2℃，120r/min搅拌脱色1h。结束后过滤，滤液浓缩至小体积，放置冷却结晶，抽滤后得到异槲皮素。

实施例3：

本发明提供一种技术方案：一种异槲皮素的制备方法，包括以下步骤：将芦丁10g置于反应容器中，加入甲醇10ml将芦丁润湿，再加入120ml柠檬酸-柠檬酸钠(pH4.5)，45℃±2℃搅拌20min。加入鼠李糖苷酶4.0g，酶用少量缓冲液溶解后加入，45℃±2℃搅拌反应5h。转化结束后将反应液过滤，滤液收集以制备鼠李糖，滤饼加入150ml甲醇，10g活性炭，65℃±2℃，120r/min搅拌脱色1h。结束后过滤，滤液浓缩至小体积，放置冷却结晶，抽滤后得到异槲皮素。

实施例4：

本发明提供一种技术方案：一种异槲皮素的制备方法，包括以下步骤：将芦丁20g置于反应容器中，加入甲醇15ml将芦丁润湿，再加入300ml乙酸-乙酸钠(pH5.0)，50℃±2℃搅拌20min。加入鼠李糖苷酶8.5g，酶用少量缓冲液溶解后加入，50℃±2℃搅拌反应5h。转化结束后将反应液过滤，滤液收集以制备鼠李糖，滤饼加入320ml甲醇，25g活性炭，60℃±2℃，120r/min搅拌脱色1h。结束后过滤，滤液浓缩至小体积，放置冷却结晶，抽滤后得到异槲皮素。

实施例1-实施例4中所得提取物，所统计的数据如下表所示：

本发明使用的鼠李糖苷酶，酶活稳定，所使用的设备简单，条件温和，步骤简单，产物单一，所得异槲皮素收率高，纯度可达95％以上，适合工业化生产，可以满足食品和医药应用。芦丁经水解后，水解液进一步对其进行常规纯化处理即可制备鼠李糖。因此采用本发明方法，可同时制得异槲皮素和鼠李糖。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。