一种高效培养草分枝杆菌的方法

技术领域

本发明属于菌种培养领域，具体涉及一种高效培养草分枝杆菌的方法。

背景技术

随着畜禽养殖业的快速发展，集约化、规模化已成为未来发展的趋势，但随着用药越来越多，细菌耐药性变强，也就导致养殖场用药剂量加大，最终引发动物食品中的药物残留，国家也因此提出抗菌药使用减量化的国家方针，以加快实现减抗替抗，最终达到无抗养殖。

而随着国家相关政策的出台，微生态制剂和中药制剂逐渐进入人们的视野。而近年来微生态制剂在畜禽养殖中的应用展现出良好的效果。微生态制剂己被广泛应用于饲料、农业食品等领域，由于其为无公害制剂，不会引发耐药性，在畜禽养殖业中已经逐步地取代了传统的添加剂。微生态制剂的应用将是行业的一种发展趋势，是抗生素的最佳替代品，对维护人类健康安全也具有重要意义。

草分枝杆菌属于放线菌纲，放线菌目，分枝杆菌科，是一种典型的非致病性腐生菌，它对人和动物几乎无致病性。草分枝杆菌灭活处理后，其细胞壁活性成分胞壁酰二肽(MDP)、草分枝杆菌多糖(MPS)及CpG免疫调节序列等能够刺激相应免疫细胞产生免疫应答，进而调节机体免疫功能，增强机体免疫力。在临床上多用作免疫增强剂，是一种宝贵的微生态制剂资源，其在医药领域具有重要的研究价值。

然而草分枝杆菌在畜牧领域的研究和应用才刚起步。目前我国的草分枝杆菌药物主要来源于德国，国内缺少草分枝杆菌发酵培养的相关资料，而且作者在前期研究发现，由于草分枝杆菌属于放线菌纲，生长过程中极易结团沉降，生长速度慢，从而导致菌体产量低、生产效率低，因而在工业化生产中难以达到要求。如何获得产量较高的菌体是目前亟待解决的问题，这直接影响工业化生产的效率，也关乎其成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题便是针对上述现有技术的不足，提供一种高效培养草分枝杆菌的方法，工艺简单、产菌量大、效率高的特点，为草分枝杆菌的规模化生产提供了一个可行性方案。

本发明所采用的技术方案是：一种高效培养草分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1、准备菌种：取草分枝杆菌备用；

步骤2、种子活化：采用斜面培养基对草分枝杆菌在37℃的条件下培养72-96h，所述斜面培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖2-5g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和琼脂15-20g/L，余量为纯水；

步骤3、种子发酵：将步骤2中活化后的草分枝杆菌接入装有100ml液体培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于发酵装置中进行发酵，发酵装置转速为180rpm/min，发酵温度为37℃，发酵时间为24-48h，得到草分枝杆菌种子发酵液，对得到的草分枝杆菌种子发酵液进行检查，确认其无污染，所述的液体培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl 4-9g/L，余量为纯水；

步骤4、扩大培养：将步骤3中得到的草分枝杆菌种子发酵液按照体积比5-10％的接种量加入装有1L扩大培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于培养装置中进行扩大培养，培养装置转速为180rpm/min，培养温度为37℃，培养时间72-96h，得到草分枝杆菌扩培液，所述的扩大培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl4-9g/L，余量为纯水；

步骤5、冷冻干燥：将步骤4中得到的草分枝杆菌扩培液105-121℃处理15-30min，离心收集菌体，离心收集过程中转速为7000rpm/min，收集到的菌体用PBS洗3次，再用PBS重悬，低温冷冻后，置于冷冻干燥仪中冷冻干燥，得到草分枝杆菌冻干菌体。

其中一个实施例中，步骤3中，所述的锥形瓶体积为250mL，瓶内加入铺满瓶底1/3-4/5的珠子。

其中一个实施例中，步骤4中，所述的锥形瓶体积为3L，瓶内加入铺满瓶底1/3-4/5的珠子。

其中一个实施例中，所述的珠子为3-7mm的玻璃珠或钢珠。

其中一个实施例中，步骤3中，发酵时间为48h。

其中一个实施例中，步骤4中，培养时间为96h。

其中一个实施例中，步骤2、步骤3和步骤4中所述的斜面培养基、液体培养基和扩大培养基pH均为7.2-7.4，均在121℃的环境下灭菌30min备用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明公开的草分枝杆菌扩培方法，使用“种子发酵1-2天+扩大培养3-4天”扩培模式，在尽可能短的时间内，菌落数可达10

2、本发明本发明公开的草分枝杆菌扩培方法，通过加入一定量的特定大小的玻璃珠或钢珠，能完全解决草分枝杆菌结团沉降的问题，使菌体充分扩增，在同等条件下达到更高数量级的产菌量。

3、本发明提出了一种高效扩培草分枝杆菌的方法，操作简单，有效降低生产成本的同时，极大地提高了发酵菌液的产菌量，为规模化的工业生产提供了一个可行性的方案。

附图说明

图1为本发明草分枝杆菌菌体加入玻璃珠和未加入玻璃珠OD值图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

本发明公开了一种高效培养草分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1、准备菌种：取草分枝杆菌备用；

步骤2、种子活化：采用斜面培养基对草分枝杆菌在37℃的条件下培养72-96h，所述斜面培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖2-5g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和琼脂15-20g/L，余量为纯水；

步骤3、种子发酵：将步骤2中活化后的草分枝杆菌接入装有100ml液体培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于发酵装置中进行发酵，发酵装置转速为180rpm/min，发酵温度为37℃，发酵时间为24-48h，得到草分枝杆菌种子发酵液，对得到的草分枝杆菌种子发酵液进行检查，确认其无污染，所述的液体培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl 4-9g/L，余量为纯水；

步骤4、扩大培养：将步骤3中得到的草分枝杆菌种子发酵液按照体积比5-10％的接种量加入装有1L扩大培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于培养装置中进行扩大培养，培养装置转速为180rpm/min，培养温度为37℃，培养时间72-96h，得到草分枝杆菌扩培液，所述的扩大培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl4-9g/L，余量为纯水；

步骤5、冷冻干燥：将步骤4中得到的草分枝杆菌扩培液105-121℃处理15-30min，离心收集菌体，离心收集过程中转速为7000rpm/min，收集到的菌体用PBS洗3次，再用PBS重悬，低温冷冻后，置于冷冻干燥仪中冷冻干燥，得到草分枝杆菌冻干菌体。

本实施例中，步骤3中，所述的锥形瓶体积为250mL，瓶内加入铺满瓶底1/3-4/5的珠子。

本实施例中，步骤4中，所述的锥形瓶体积为3L，瓶内加入铺满瓶底1/3-4/5的珠子。

本实施例中，所述的珠子为3-7mm的玻璃珠或钢珠。

本实施例中，步骤3中，发酵时间为48h。

本实施例中，步骤4中，培养时间为96h。

本实施例中，步骤2、步骤3和步骤4中所述的斜面培养基、液体培养基和扩大培养基pH均为7.2-7.4，均在121℃的环境下灭菌30min备用。

为解决草分枝杆菌菌体结团沉降的问题，得到数量更多的菌体，本发明对添加玻璃珠的影响进行了验证。草分枝杆菌菌体在含有或不含有玻璃珠的液体培养基中进行7-8天的培养，检查菌液OD值，结果如图1所示。

结果显示，添加玻璃珠的菌液的OD值能达到2，而不添加玻璃珠的只有1.6，说明添加玻璃珠对草分枝杆菌的生长影响较大。因此，添加玻璃珠为更优的培养方式。

实施例2：

本发明公开了一种高效培养草分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1、准备菌种：取草分枝杆菌备用；

步骤2、种子活化：采用斜面培养基对草分枝杆菌在37℃的条件下培养72h，所述斜面培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖2-5g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和琼脂15-20g/L，余量为纯水；

步骤3、种子发酵：将步骤2中活化后的草分枝杆菌接入装有100ml液体培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于发酵装置中进行发酵，发酵装置转速为180rpm/min，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，得到草分枝杆菌种子发酵液，对得到的草分枝杆菌种子发酵液进行检查，确认其无污染，所述的液体培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl 4-9g/L，余量为纯水；

步骤4、扩大培养：将步骤3中得到的草分枝杆菌种子发酵液按照体积比5％的接种量加入装有1L扩大培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于培养装置中进行扩大培养，培养装置转速为180rpm/min，培养温度为37℃，培养时间72h，得到草分枝杆菌扩培液，所述的扩大培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl 4-9g/L，余量为纯水；

步骤5、冷冻干燥：将步骤4中得到的草分枝杆菌扩培液105℃处理15min，离心收集菌体，离心收集过程中转速为7000rpm/min，收集到的菌体用PBS洗3次，再用PBS重悬，低温冷冻后，置于冷冻干燥仪中冷冻干燥，得到草分枝杆菌冻干菌体。

本实施例中，步骤3中，所述的锥形瓶体积为250mL，瓶内加入铺满瓶底2/3的珠子。

本实施例中，步骤4中，所述的锥形瓶体积为3L，瓶内加入铺满瓶底2/3的珠子。

本实施例中，所述的珠子为3-7mm的玻璃珠或钢珠。

本实施例中，步骤2、步骤3和步骤4中所述的斜面培养基、液体培养基和扩大培养基pH均为7.2-7.4，均在121℃的环境下灭菌30min备用。

本实施例采用本发明的扩培体系得到的草分枝杆菌冻干菌体产量达5g/L；取一定量草分枝杆菌冻干菌体与适量PBS混合均匀后，用均质机进行匀浆破碎，得到草分枝杆菌悬液，即草分枝杆菌免疫增强剂注射液，4℃保存。

实施例3：

本发明公开了一种高效培养草分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1、准备菌种：取草分枝杆菌备用；

步骤2、种子活化：采用斜面培养基对草分枝杆菌在37℃的条件下培养96h，所述斜面培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖2-5g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和琼脂15-20g/L，余量为纯水；

步骤3、种子发酵：将步骤2中活化后的草分枝杆菌接入装有100ml液体培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于发酵装置中进行发酵，发酵装置转速为180rpm/min，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，得到草分枝杆菌种子发酵液，对得到的草分枝杆菌种子发酵液进行检查，确认其无污染，所述的液体培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl 4-9g/L，余量为纯水；

步骤4、扩大培养：将步骤3中得到的草分枝杆菌种子发酵液按照体积比10％的接种量加入装有1L扩大培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置于培养装置中进行扩大培养，培养装置转速为180rpm/min，培养温度为37℃，培养时间96h，得到草分枝杆菌扩培液，所述的扩大培养基配方为：胰蛋白胨15-19g/L、大豆胨2-6g/L、葡萄糖10-30g/L、磷酸氢二钾1-3g/L和NaCl 4-9g/L，余量为纯水；

步骤5、冷冻干燥：将步骤4中得到的草分枝杆菌扩培液105℃处理15min，离心收集菌体，离心收集过程中转速为7000rpm/min，收集到的菌体用PBS洗3次，再用PBS重悬，低温冷冻后，置于冷冻干燥仪中冷冻干燥，得到草分枝杆菌冻干菌体。

本实施例中，步骤3中，所述的锥形瓶体积为250mL，瓶内加入铺满瓶底1/3的珠子。

本实施例中，步骤4中，所述的锥形瓶体积为3L，瓶内加入铺满瓶底1/3的珠子。

本实施例中，所述的珠子为3-7mm的玻璃珠或钢珠。

本实施例中，步骤2、步骤3和步骤4中所述的斜面培养基、液体培养基和扩大培养基pH均为7.2-7.4，均在121℃的环境下灭菌30min备用。

本实施例取一定量草分枝杆菌冻干菌体与适量PBS混合均匀后，用均质机进行匀浆破碎，得到草分枝杆菌悬液，即草分枝杆菌免疫增强剂注射液，4℃保存。

为证明草分枝杆菌用于增强动物免疫力的使用效果，选取21只生长状况一致的5周龄昆明小鼠，小鼠随机分成3组，每组7只。其中A组为对照组，B、C组为实验组。注射实施例2和3制备的草分枝杆菌悬液，含量以草分枝杆菌干重计。各组操作如下表1：

表1实验操作表

给药完成后眼球取血，分离血清，测定免疫指标IgG，IL-2的变化情况。结果显示：注射草分枝杆菌增强剂的实验组B相较于注射生理盐水的对照组IgG指标提高4.5％，IL-2指标提高5.6％；实验组C相较于注射生理盐水的对照组IgG指标提高5.2％，IL-2指标提高6.1％。说明注射草分枝杆菌免疫增强剂，能提高小鼠机体的免疫能力。

综上所述，本发明采用“种子发酵1-2天+扩大培养3-4天”的扩培模式，其中，“种子发酵2天+扩大培养4天”的扩培模式为最佳；通过上述扩培模式制备得到的草分枝杆菌菌体数提高到10

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。