操纵涉及信号转导的基因以控制发酵和生产期间的真菌形态

本申请要求2018年6月6日提交的第62/681,604号美国临时申请的优先权，所述美国临时申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及调节在各种生长条件下的真菌细胞的菌丝生长。所揭示的菌丝生长调节需要对丝状真菌进行遗传操纵以产生在生产条件下菌丝生长受限的真菌生产菌株。所得真菌生产菌株很适合生长在浸没培养物中，例如用于大规模生产用于商业应用的所关注产物(例如抗生素、代谢物、蛋白质等)。

关于序列表的声明

以文本格式代替纸本拷贝提供与本申请相关的序列表，且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是：ZYMR_015_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件约307KB，创建于2019年6月6日，并且以电子方式通过EFS-Web提交。

背景技术

真核细胞是用于生产多肽和次级代谢物的优选生物体。实际上，丝状真菌能够将原生蛋白质和异源蛋白质表达到高水平，使得其很适合大规模生产用于工业、药物、动物健康和食品和饮料应用的酶和其它蛋白质。然而，使用丝状真菌进行大规模生产所关注产物通常需要遗传操纵所述真菌并且使用自动化机器和设备，且丝状真菌生命周期的某些方面可能使得难以进行遗传操纵和操作。

举例来说，将引入到真菌中的DNA随机整合到基因组内，产生主要经随机整合的DNA片段，所述DNA片段通常可整合成多个串联重复序列(参见例如卡斯凯罗(Casqueiro)等人，1999，《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》181:1181-1188)。表达盒的这种不受控制的“随机多重整合”可能是一种潜在有害的过程，其可能导致对宿主基因组的不必要修饰。

另外，用于丝状真菌的现有转染系统可能非常费力(综述参见芬彻姆(Fincham)，1989，《微生物学评论(Microbiol.Rev.)》53:148-170)，并且本质上尺度相对较小。这可能涉及原生质体形成、粘性液体操作(即聚乙二醇溶液)、玻璃管的单个涡流和后续选择性涂覆。此外，用于原生质体产生的条件可能难以确定且产量可能通常很低。此外，原生质体可含有多个细胞核，使得引入所期望遗传操纵可能使得形成异核原生质体，所述异核原生质体可能难以与同核原生质体分离。

此外，典型的丝状真菌细胞(包括来源于原生质体的那些细胞)生长成长纤维，被称为菌丝，其可形成致密菌丝网络，称为菌丝体。这些菌丝可能含有可在基因型上彼此不同的多个细胞核。菌丝可分化并且形成可易于分散在空气中的无性孢子。如果菌丝含有不同基因型的细胞核，那么孢子也将含有细胞核的混合物。由于真菌生长的这一方面，遗传操纵本质上产生混合群体，必须将所述混合群体纯化达到同质，以便评估所作出的遗传改变的任何作用。此外，在自动化环境中，孢子可造成设备污染，其可不利地影响纯化菌株的能力，且可污染设备上进行的任何其它工作。

为了缓解孢子的空气分散，可使丝状真菌在浸没培养物中生长。然而，由浸没培养物中菌丝丝状真菌生长形成的菌丝体可能影响培养液的流变学特性。一般来说，培养液的粘度越高，氧和养分分布越不均匀，并且搅拌培养物所需的能量越多。在一些情况下，由于菌丝丝状真菌生长，培养液的粘度变得足够高，从而显著干扰氧和养分的溶解，由此不利地影响真菌的生长并且最终影响任何所关注的所期望产物的产量和产率。

因此，在所属领域中存在对工程改造丝状真菌的新颖方法的巨大需求，所述新颖方法没有真菌中传统菌株构建程序所固有的前述缺点，并且大大加快了发现和合并有益突变的过程。

本发明克服了在自动化高通量平台中遗传操纵丝状真菌固有的许多挑战。本文所提供的方法经设计为通过使用与自动化筛选转化体组合的自动化共转化并入遗传变化，由此允许在两种菌株之间交换遗传性状而不经历有性杂交，来产生具有所期望形态的真菌生产菌株。

发明内容

在一个方面，本文提供一种衍生自亲本菌株的丝状真菌的变异菌株，其中所述变异菌株的细胞当在浸没培养物中生长时，与所述亲本菌株的细胞相比，具有非菌丝体成球粒表型，这是由于所述变异菌株具有渗透反应路径的一或多个基因中的遗传变异，其使得当在浸没培养条件下生长时，与所述亲本菌株的细胞相比，所述变异菌株的细胞产生减少量或大体上减少量的由所述渗透反应路径的一或多个基因编码的功能蛋白，和/或其活性较低或大体上活性较低的形式。在一些情况下，当在非浸没生长条件下生长时，与所述亲本菌株相比，所述变异菌株正常产孢。在一些情况下，所述丝状真菌选自：棉霉属(Achlya)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、头孢霉属(Cephalosporium)、金孢霉属(Chrysosporium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球酵母属(Cryptococcus)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、色二孢属(Diplodia)、内斯菌属(Endothis)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、胶霉属(Gliocladium)、腐殖菌属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、毁丝菌属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))、白霉菌属(Mucor)、红霉菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、柄孢壳属(Podospora)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、梨胞霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂殖菌属(Schizophyllum)、革节孢属(Scytalidium)、孢子丝菌属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、栓菌属(Tramates)、弯颈霉菌属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。在一些情况下，所述丝状真菌为黑曲霉(Aspergillus niger/A.niger)或其有性世代或无性世代。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae/S.cerevisiae)SLN1基因或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa/N.crassa)nik1基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。在一些情况下，所述遗传变异选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的核酸序列。在一些情况下，所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。在一些情况下，所述比色标记基因为aygA基因。在一些情况下，所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。在一些情况下，所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。在一些情况下，所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素(pheomycin)的抗性。在一些情况下，渗透应激反应路径的一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因的突变形式为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物的突变形式为SEQ ID NO.7的核酸序列。在一些情况下，所述变异菌株进一步包含选自具有SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的基因的不含SNP的形式的一或多个基因的遗传变异。在一些情况下，所述遗传变异选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。在一些情况下，所述比色标记基因为aygA基因。在一些情况下，所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。在一些情况下，所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。在一些情况下，所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。在一些情况下，所述一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。在一些情况下，所述一或多个基因的突变形式为选自SEQ ID NO:5、6或8的核酸序列。

在另一方面，本文提供一种丝状真菌宿主细胞，其包含可操作地连接于调节所述宿主细胞的形态的基因的启动子，其中所述启动子与所述基因异源，其中所述启动子具有选自由SEQ ID NO.1-4组成的群组的核序列。在一些情况下，与不具有可操作地连接到调节所述宿主细胞的形态的所述基因的所述启动子的参考丝状真菌宿主细胞相比，所述丝状真菌宿主细胞在发酵培养基中在浸没培养条件下生长时具有非菌丝体球粒形态。在一些情况下，所述发酵培养基包含至少14ppb的锰。在一些情况下，所述发酵培养基不含或大体上不含螯合剂(例如，所属领域中已知的用于产生所关注产物(例如柠檬酸)的发酵培养基中存在的螯合剂的量或浓度小于5％、4％、3％、2％或1％)。在一些情况下，所述发酵培养基不含螯合剂。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞产生的所关注产物的量至少等于由不具有可操作地连接到调节所述宿主细胞的形态的所述基因的所述启动子的所述参考丝状真菌宿主细胞产生的量。在一些情况下，所述所关注产物为柠檬酸或所关注的酶。在一些情况下，调节形态的所述基因选自渗透反应路径的一或多个基因、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。在一些情况下，调节形态的所述基因为所述基因的野生型或突变形式。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ IDNO:7的核酸序列的不含SNP的形式。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列。在一些情况下，所述启动子选自SEQ ID NO:1或2的核酸序列。

在又一方面，本文提供一种丝状真菌宿主细胞，其包含所述宿主细胞的渗透反应路径的一或多个基因的异源修饰，其中经修饰的一或多个基因相对于不具有所述宿主细胞的渗透反应路径的所述经修饰的一或多个基因的亲本丝状真菌宿主细胞，具有降低的活性和/或减少的表达。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞在发酵培养基中在浸没培养条件下生长时具有非菌丝体球粒形态。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。在一些情况下，所述异源修饰选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。在一些情况下，所述比色标记基因为aygA基因。在一些情况下，所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。在一些情况下，所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。在一些情况下，所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。在一些情况下，渗透应激反应路径的一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。在一些情况下，渗透应激路径的一或多个基因为所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物的突变形式为SEQ ID NO.7的核酸序列。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞进一步包含选自具有SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的基因的不含SNP的形式的一或多个基因的遗传变异。在一些情况下，所述遗传变异选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。在一些情况下，与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。在一些情况下，所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。在一些情况下，所述比色标记基因为aygA基因。在一些情况下，所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。在一些情况下，所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。在一些情况下，所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。在一些情况下，所述一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。在一些情况下，所述一或多个基因的突变形式为选自SEQ ID NO:5、6或8的核酸序列。

在再一方面，本文提供一种发酵培养液，其包含至少14ppb的锰和包含非菌丝体球粒表型的丝状真菌细胞，其中所述培养液不含或大体上不含螯合剂(例如，所属领域中已知的用于产生所关注产物(例如柠檬酸)的发酵培养液中存在的螯合剂的量或浓度小于5％、4％、3％、2％或1％)，并且其中所述丝状真菌细胞包含来自所述丝状真菌细胞的渗透反应路径的一或多个遗传变异基因。在一些情况下，来自所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因可操作地连接到异源启动子。在一些情况下，所述异源启动子选自SEQ ID NO:1或2。在一些情况下，来自所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因包含突变。在一些情况下，SNP中的突变。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的遗传变异丝状真菌直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的遗传变异黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为具有选自SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因的遗传变异形式。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的遗传变异黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述遗传变异黑曲霉直系同源物为具有SEQ ID NO:7的核酸序列的基因。

在一个方面，本文提供一种用于产生启动子交换丝状真菌菌株库的方法，其包含以下步骤：a.提供在形态上对基础丝状真菌菌株起作用的一或多个靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基础丝状真菌菌株中展现出不同表达谱的多种启动子；以及b.对所述基础丝状真菌菌株的基因组进行工程改造，借此创建包含多种个别丝状真菌菌株的初始启动子交换丝状真菌菌株库，所述多种个别丝状真菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含来自所述启动子梯的可操作地连接到在渗透应激反应上对所述基础丝状真菌菌株起作用的所述一或多个靶基因中的一个的启动子中的一或多个。在一些情况下，所述启动子梯包含见于表2中的启动子。在一些情况下，在形态中起作用的所述一或多个靶基因包含破坏。在一些情况下，所述破坏为SNP、错义突变、无义突变、缺失和/或插入。在一些情况下，在形态中起作用的所述一或多个靶基因选自渗透反应路径的一或多个基因、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列。

在另一方面，本文提供一种用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其包含以下步骤：a.提供在形态上对基础丝状真菌菌株起作用的多个靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基础丝状真菌菌株中展现出不同表达谱的多种启动子；b.对所述基础丝状真菌菌株的基因组进行工程改造，借此创建包含多种个别丝状真菌菌株的初始启动子交换丝状真菌菌株库，所述多种个别丝状真菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含来自所述启动子梯的可操作地连接到在形态上对所述基础丝状真菌菌株起作用的所述多个靶基因中的一个的启动子中的一或多个；c.针对优于参考丝状真菌菌株的形态表型改良来筛选和选择所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的个别丝状真菌菌株，借此鉴别赋予形态表型改良的独特基因变异；d.提供各自包含来自基因变异的独特基因变异组合的后续多种丝状真菌微生物，所述基因变异存在于先前步骤中筛选的至少两种个别丝状真菌菌株中，借此创建后续启动子交换丝状真菌菌株库；e.针对优于所述参考丝状真菌菌株的形态表型改良来筛选和选择所述后续启动子交换丝状真菌菌株库的个别丝状真菌菌株，借此鉴别赋予额外形态表型改良的独特基因变异组合；以及f.以线性或非线性方式重复步骤d)-e)一次或多次，直至相较于所述生产丝状真菌菌株的形态表型，丝状真菌菌株的形态表型展现出所期望改良水平，其中每次后续迭代创建了新的微生物菌株的启动子交换丝状真菌菌株库，其中新的库中的每种菌株包含基因变异，所述基因变异为选自先前库的至少两种个别丝状真菌菌株当中的基因变异的组合。在一些情况下，所述后续启动子交换丝状真菌菌株库是所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库。在一些情况下，所述后续启动子交换丝状真菌菌株库是所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库的子集。在一些情况下，所述后续启动子交换丝状真菌菌株库为先前启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库。在一些情况下，所述后续启动子交换丝状真菌菌株库为先前启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库的子集。在一些情况下，所述启动子梯包含见于表2中的启动子。在一些情况下，在形态中起作用的所述一或多个靶基因包含破坏。在一些情况下，所述破坏为SNP、错义突变、无义突变、缺失和/或插入。在一些情况下，在形态中起作用的所述一或多个靶基因选自渗透反应路径的一或多个基因、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。在一些情况下，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。在一些情况下，所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。在一些情况下，所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列。在一些情况下，所述形态表型改良包含赋予在浸没培养条件下生长时形成非菌丝体球粒形态的能力。在一些情况下，所述浸没培养条件包含培养基，其包含至少14ppb的锰并且不含或大体上不含螯合剂(例如，所属领域中已知的用于产生所关注产物(例如柠檬酸)的发酵培养基中存在的螯合剂的量或浓度小于5％、4％、3％、2％或1％)。在一些情况下，所述发酵培养基不含螯合剂。

附图说明

图1说明用于在丝状真菌细胞中进行启动子交换的方法。确切地说，展示了具有注释的启动子的基因的启动子交换设计。

图2说明说明性启动子的表达谱，其根据本发明的启动子梯展现出一定范围的调节表达。启动子A表达在添加所选底物后立即达到峰值，但随着底物浓度降低而快速返回到不可检测的水平。启动子B表达在添加所选底物后立即达到峰值且与底物相应的减少一起缓慢降回到不可检测的水平。启动子C表达在添加所选底物后达到峰值，且在整个培养期间保持高度表达，即使在底物已耗尽之后。

图3说明将四种不同启动子置于靶基因的前方以产生4种不同菌株。随后可以在测试中比较这些菌株的所期望性状，并且可以确定理想表达量。

图4说明使用融合PCR以产生用于本发明的分裂标记构筑体。

图5说明如图4所描绘产生的分裂标记构筑体的质量控制分析。

图6表示如何使用分裂标记系统将SNP靶向到丝状真菌中的特定基因座。标记基因(在这个实例中为pyrG)扩增成两个不能够在无恢复基因功能的同源重组的情况下补充靶菌株中的突变的组件。侧接这些片段的是DNA的直接重复序列，其中每一个含有待靶向到基因座的SNP。每个构筑体上的非重复DNA序列促进了通过原生同源重组路径的恰当整合。

图7说明侧接标记基因的直接重复序列为不稳定的且将通过直接重复序列之间的同源重组使得标记物去除。基本上，环出通过并入到转化DNA中的直接重复序列来促进。基本上，环出通过并入到转化DNA中的直接重复序列来促进。针对选择标记物反向选择的细胞含有直接重复序列区所侧接的环DNA的缺失。

图8说明使用缺失构筑体用于评估如实例2中所描述的来自表3的每个SNP的缺失表型。缺失表型可以用于为路径分析提供信息。

图9说明形态基因(即，FungiSNP_18；SEQ ID NO:7)的启动子交换。控制这种基因的表达的不同启动子影响形态。含有manB融合物和amyB融合物的菌株相对于11414亲本菌株保留多个顶端，而具有较高表达srpB和mbfA的菌株不具有多个顶端表型。在30℃下，使菌株在柠檬酸生产培养基(14％w/v葡萄糖，pH 2，贫含Mn++)中生长48小时。当培育168小时时，具有较高表达启动子的菌株以及亲本对照菌株都含有长丝状菌丝。使具有来自启动子融合物amyB和manB的较低表达量的菌株保持球粒化。

图10示出根据本发明的实施例的计算机系统的实施例。

图11说明基础1015菌株和11414生产菌株中形态基因标靶18(FungiSNP_18)的启动子交换。与FungiSNP_18相关的基因产物为对渗透应激起反应的信号传导激酶(即，酿酒酵母SLN1的黑曲霉直系同源物)。这张图展示了当通过用较弱启动子置换原生启动子来降低所述基因的基因表达时，细胞维持更紧密的较不细长的表型，其在本文中称为‘球粒’表型(参见右图在基础1015菌株和11414生产菌株中表达manB(p)snp18基因的细胞)。在30℃下，使菌株在柠檬酸生产培养基(14％w/v葡萄糖，pH 2，贫含Mn++)中生长24小时。这种类型的生长对于搅拌槽发酵可为有利的。

图12说明通过在manB(p)启动子(SEQ ID NO:1)的控制下引入FungiSNP_18基因(SEQ ID NO:7)，减少了基础菌株(即黑曲霉1015)中FungiSNP_18基因产物含量，使得不能在基础菌株基因背景中产孢。当将相同构筑体引入到生产菌株(即，黑曲霉11414)时，未观测到这种表型。

图13说明含有基础SNP18的菌株在低pH值培养基上生长得更快。

图14说明含有基础SNP18的菌株在提供渗透应激的培养基上生长得更快。

图15说明基础菌株与生产菌株之间交换FungiSNP_18对产孢和径向生长速率具有影响。

图16说明在生产菌株中含有SNP(即来自表4的FungiSNP)的所有编码序列的基础菌株中的缺失。

图17说明含有FungiSNP_18的基因对于生产菌株中的产孢而言并非必需，但对基础菌株中的产孢不是这样。

图18说明二分构筑体的设计和用于进行实例3所述的PROSWP实验的通用方案。

图19说明实例3中所用的较弱启动子影响形态。在弱manB启动子下含有FungiSNP_18(SNP18)的菌株具有比含有其它启动子组合的菌株更紧密的菌落形态。相较于在低pH值下，在渗透应激下，SNP18控制的影响更显著。

图20说明FungiSNP_12(snp_12)的PROSWP。可操作地连接到snp_12的较低强度启动子产生菌丝中的黄色色素和一些改变的形态(在菌落的边缘观察到)。这种黄色色素常见于多种突变体并且被认为是代谢应激的标志。

图21说明当由较弱启动子驱动时，相较于生产菌株中，基础菌株中的FungiSNP_18(snp_18)具有更重度的形态表型。

图22说明将含有点突变(即，FungiSNP_18的来自表3的SNP；编码结构域中的C>T核苷酸变化，如SEQ ID NO.76相对于SEQ ID NO.7所示)的曲霉nikA(也称为二组分系统蛋白质C(TcsC))基因引入到基础菌株中得到较高柠檬酸产量和恰当渗透反应的保持。图22还展示nikA的缺失引起基础菌株中的较慢生长和较低柠檬酸产量。

图23A-B说明在摇瓶中将包含图22中所描述的点突变的曲霉nikA基因插入到基础菌株中将柠檬酸效价增加33％。图23A展示使用酶分析(美加占(Megazyme)；K-CITR)由在摇瓶中在柠檬酸生产培养基中生长96小时的培养物定量的柠檬酸的效价。一式三份地生长菌株。误差条指示与平均值的一个标准差。图23B展示具有指示95％置信区间的线的点的单向ANOVA的图。总的来说，图23A-B展示将包含点突变的曲霉nikA基因引入到基础菌株中使得柠檬酸效价增加33％。

具体实施方式

本发明克服了在自动化高通量平台中遗传操纵丝状真菌固有的许多挑战。本文所提供的方法经设计以产生具有改变的菌丝生长，以在浸没培养物中更有效地生长的真菌生产菌株。所述方法包含使用与自动化筛选转化体组合的自动化共转化并入遗传变化，由此允许在两种菌株之间交换影响真菌细胞的生长和形态的遗传性状而不经历有性杂交。

定义

尽管相信所属领域的普通技术人员充分理解以下术语，但仍阐述以下定义以便于对本发明主题进行解释。

术语“一(a/an)”是指所述实体中的一或多个，即可以指多个提及物。因此，术语“一”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可互换地使用。此外，通过不定冠词“一”提及“一要素”并不排除存在超过一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个并且仅存在一个要素。

如本文所用，术语“细胞生物体”、“微生物体”或“微生物”应该在广泛意义上使用。这些术语可互换地使用并且包括但不限于两种原核生物域：细菌和古细菌，以及某些真核真菌和原生生物。在一些实施例中，本发明是指存在于本发明中的列表/表格和图式中的“微生物体”或“细胞生物体”或“微生物”。这种表征不仅可以指所述表格和图式的已鉴别类属，而且指已鉴别的类种，以及所述表格或图式中的各种新颖和最新鉴别或设计的任何生物体株系。对于这些术语在本说明书的其它部分(如实例)中的叙述来说，相同表征保持成立。

如本文所用，术语“多核体”或“多核生物体”可以指多核细胞或包含多核细胞的生物体。不同于合胞体是由细胞聚集、继之以物质内部细胞膜的溶解产生，多核细胞可由多个核分裂产生而不具有其伴随的胞质分裂。与本文提供的方法、组合物和系统有关的多核生物体的实例可以包括原生生物(例如藻类、原生动物、多连体(粘菌)、囊泡虫、植物、真菌(例如丝状真菌)和/或后生动物(例如果蝇)。

术语“原核生物”是所属领域公认的且是指不含细胞核或其它细胞器的细胞。原核生物通常以两种域(细菌和古细菌)中的一种来分类。古细菌和细菌域生物体之间的决定性差异是基于16S核糖体RNA中的核苷酸碱基序列的基本差异。

术语“古细菌”是指疵壁菌门(Mendosicutes)的生物体类别，其典型地发现于异常环境中且根据若干个标准而与其余的原核生物区分开来，所述若干个准则包括核糖体蛋白的数目和细胞壁中的胞壁酸的缺乏。基于ssrRNA分析，古细菌由两个系统发生学不同的群组组成：泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)。古细菌基于其生理学可以组织成三种类型：产甲烷菌(methanogens)(产生甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(extremehalophiles)(在极高浓度的盐(NaCl)下生活的原核生物)；和极端(超)嗜热菌(extreme(hyper)thermophilus)(在极高温度下生活的原核生物)。除有别于细菌的统一古细菌特征(即，细胞壁中没有胞壁质、酯连型膜脂质等)之外，这些原核生物还展现出使其适应其特定栖息地的独特结构或生物化学属性。泉古菌门主要由超嗜热性硫依赖性原核生物组成，且广古菌门含有产甲烷菌和极端嗜盐菌。

“细菌”或“真细菌”是指原核生物体域。细菌包括如下至少11种不同群组：(1)革兰氏阳性(革兰+)细菌，其存在两大亚门：(1)高G+C群组(放线菌(Actinomycetes)、分枝杆菌(Mycobacteria)、微球菌(Micrococcus)等)，(2)低G+C群组(芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridia)、乳杆菌(Lactobacillus)、葡萄球菌(Staphylococci)、链球菌(Streptococci)、霉浆菌(Mycoplasmas))；(2)变形菌门(Proteobacteria)，例如紫色光合+非光合革兰氏阴性细菌(包括最“常见”的革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌(Cyanobacteria)，例如有氧光养型；(4)螺旋菌(Spirochetes)和相关物种；(5)浮霉状菌(Planctomyces)；(6)畸形菌体(Bacteroide)、黄杆菌(Flavobacteria)；(7)衣原体(Chlamydia)；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也是厌氧性光养型)；(10)耐放射性微球菌(Radioresistantmicrococci)和相关菌种；(11)栖热孢菌(Thermotoga)和嗜热性热袍菌(Thermosiphothermophiles)。

“真核生物”是其细胞含有细胞核和包封于膜内的其它细胞器的任何生物体。真核生物属于真核或真核生物分类群。将真核细胞与原核细胞(前述细菌和古细菌)区分开来的限定性特征是其具有膜结合的细胞器，尤其是含有遗传物质且被核被膜封闭的细胞核。

术语“经过基因修饰的宿主细胞”、“重组宿主细胞”和“重组菌株”在本文中可互换地使用，且是指已经利用本发明的克隆和转化方法进行基因修饰的宿主细胞。因此，所述术语包括宿主细胞(例如细菌、酵母细胞、真菌细胞、CHO、人类细胞等)，相较于其所来源的天然存在的生物体，所述宿主细胞已经遗传变异、修饰或工程改造，以便其展现经变异、修饰或不同的基因型和/或表型(例如当基因修饰影响微生物体的编码核酸序列时)。应理解，在一些实施例中，所述术语不仅指所讨论的特定重组宿主细胞，且还指这种宿主细胞的后代或潜在后代。

术语“野生型微生物体”或“野生型宿主细胞”描述自然界中存在的细胞，即尚未经过基因修饰的细胞。

术语“亲本菌株(parent strain/parental strain)”或“亲本”可以指突变菌株所来源的宿主细胞。因此，“亲本菌株”是一种其基因组受所属领域中已知和/或本文所提供的任何方式干扰以产生一或多个突变菌株的宿主细胞或细胞。“亲本菌株”可能具有或可能不具有与野生型菌株相同的基因组。

术语“经基因工程改造”可以指对宿主细胞的基因组的任何操纵(例如核酸的插入、缺失、突变或置换)。

术语“对照物”或“对照宿主细胞”是指适当的比较宿主细胞，其用于确定基因修饰或实验处理的作用。在一些实施例中，对照宿主细胞是野生型细胞。在其它实施例中，除了使处理宿主细胞不同的一或多个基因修饰之外，对照宿主细胞在基因上与经过基因修饰的宿主细胞相同。在一些实施例中，本发明教示使用亲本菌株作为对照宿主细胞。在其它实施例中，宿主细胞可以是基因相同的细胞，其不具有处理宿主细胞中所测试的特定启动子或SNP。

如本文所用，术语“一或多种等位基因”意指基因的一或多种替代形式中的任一种，其所有等位基因涉及至少一种性状或特征。在二倍体细胞中，所指定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。在实施例中，因为本发明涉及QTL，即可以包含一或多个基因或调节序列的基因组区域，所以在一些情况下，称为“单倍型”(即染色体区段的等位基因)比“等位基因”更准确，然而，在那些情况下，术语“等位基因”应理解为包含术语“单倍型”。

如本文所用，术语“基因座(locus)”(基因座(loci)的复数形式)意指发现有例如基因或基因标记物的染色体上的一或多个特定位置或一位点。

如本文所用，术语“以基因方式连接”是指在育种期间，两种或更多种性状以高比率共同遗传，使得其难以通过杂交来分离。

如本文所用，“重组”或“重组事件”是指染色体交叉或独立分类。术语“重组”是指具有由于重组事件而产生的新基因组成的生物体。

如本文所用，术语“表型”是指个别细胞、细胞培养物、生物体或生物体群组的可观测特征，其是由所述个体的基因组成(即基因型)与环境之间的相互相用产生的。

如本文所用，当描述核酸序列或蛋白质序列时，术语“嵌合”或“重组”是指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子，或使至少一个天然核酸或蛋白质序列的一或多个元件重新排列的核酸或蛋白质序列。举例来说，术语“重组”可以指序列中两个以其它方式分离的区段例如通过化学合成或通过基因工程改造技术操纵核酸的分离区段进行的人工组合。

如本文所用，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是已知不存在于自然界中或不天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其它天然存在的核苷酸序列相比时，所述合成核苷酸序列将包含至少一种核苷酸差异。

如本文所用，术语“核酸”是指具有任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式或其类似物。这一术语是指分子的初级结构，并且因此包括双股和单股DNA，以及双股和单股RNA。其还包括经修饰的核酸，如甲基化和/或封端核酸、含有经修饰的碱基、主链修饰的核酸等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换地使用。

如本文所用，术语“DNA骨架”或“核酸骨架”是指人工产生的核酸骨架或改用作骨架的天然存在的序列。在本发明的一个实施例中，核酸骨架为合成脱氧核糖核酸骨架。合成骨架的脱氧核糖核苷酸可包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然或衍生的脱氧核糖核苷酸碱基。如本文中更详细描述，本发明的核酸骨架用以在空间和时间上组装和固定生物路径中涉及的两种或更多种蛋白质(即生物合成酶)，以产生功能性复合物。每种生物学路径蛋白质在骨架上的组装和固定通过骨架的蛋白质结合序列(即蛋白质对接位点)中的一个与嵌合生物合成酶的对应DNA结合部分之间的结合相互作用进行。因此，核酸骨架包含一或多个亚单元，每个亚单元包含两个或更多个蛋白质结合序列，以适应两种或更多种不同嵌合生物路径蛋白质的结合。

如本文所用，“DNA结合序列”或“DNA结合位点”是指通过本发明的嵌合生物合成基因的DNA结合结构域部分来识别和结合的特定核酸序列。许多DNA结合蛋白结构域和其同源结合伴侣识别位点(即，蛋白质结合位点)为所属领域中众所周知的。举例来说，多种锌指结合结构域和其对应DNA蛋白质结合标靶位点是所属领域中已知的并且适用于本发明。其它DNA结合结构域包括但不限于亮氨酸拉链结合结构域和其对应DNA蛋白质结合位点、翼状螺旋结合结构域和其对应DNA蛋白质结合位点、翼状螺旋-转角-螺旋结合结构域和其对应DNA蛋白质结合位点、HMG-盒结合结构域和其对应DNA蛋白质结合序列、螺旋-环-螺旋结合结构域和其对应DNA蛋白质结合序列以及螺旋-转角-螺旋结合结构域和其对应DNA蛋白质结合序列。其它已知的具有已知DNA蛋白结合序列的DNA结合结构域包括免疫球蛋白DNA结构域、B3 DNA结合结构域和TAL效应DNA结合结构域。本发明的核酸骨架亚单元可以包含前述蛋白质结合位点中的任何两个或更多个。

如本文所用，术语“基因”是指与生物功能相关联的任何DNA区段。因此，基因包括但不限于其表达所需的编码序列和/或调节序列。基因还可包括未表达的DNA区段，其例如形成针对其它蛋白质的识别序列。基因可以从多种来源获得，包括从所关注的来源克隆或利用已知或预测的序列信息合成，并且可以包括经设计具有所期望参数的序列。

如本文所用，术语“同源”或“同系物”或“直系同源物”在所属领域中已知并且是指具有共同祖先或家族成员并且基于序列一致性程度确定的相关序列。术语“同源性”、“同源”、“大体上类似”和“大体上对应”在本文中可互换地使用。它们是指核酸片段，其中一或多个核苷酸碱基的变化不影响所述核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰，如相对于初始未经修饰的片段，不显著改变所得核酸片段的功能特性的一或多个核苷酸的缺失或插入。因此应理解，如所属领域的技术人员将了解，本发明涵盖除所述特定示范性序列之外的序列。这些术语描述了一种物种、亚种、变种、栽培品种或菌株中所发现的基因另一种物种、亚种、变种、栽培品种或菌株中的对应或等效基因之间的关系。出于本发明的目的，对同源序列进行比较。“同源序列”或“同系物”或“直系同源物”被认为、相信或已知在功能上是相关的。功能关系可以用多种方式中的任一种指示，包括但不限于：(a)序列一致性程度和/或(b)相同或类似生物功能。优选地，指示(a)和(b)两者。可使用所属领域中容易获得的软件程序测定同源性，如《现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.奥斯贝(F.M.Ausubel)等人编，1987)增刊30，章节7.718，表7.71中所论述的那些软件程序。一些比对程序是MacVector(英国牛津的牛津分子有限公司(Oxford Molecular Ltd,Oxford,U.K.))、ALIGN Plus(宾夕法尼亚州的科学和教育软件(Scientific and Educational Software,Pennsylvania))以及AlignX(Vector NTI，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))。另一种比对程序是Sequencher(密歇根安娜堡的基因科德公司(Gene Codes,Ann Arbor,Michigan)，其使用默认参数。

如本文所用，术语“内源”或“内源基因”是指天然存在的基因，在其所处位置发现其天然地存在于宿主细胞基因组内。在本发明的上下文中，将异源启动子可操作地连接到内源基因意指，在现有基因天然存在的位置中，以基因方式将异源启动子序列插入到所述基因之前。如本文所描述的内源基因可以包括天然存在的基因的等位基因，所述等位基因已经根据本发明的任何方法发生突变。

如本文所用，术语“外源”与术语“异源”可互换地使用且是指来自不同于其原生来源的一些来源的物质。举例来说，术语“外源蛋白质”或“外源基因”是指来自非原生来源或位置且已经通过人工方式提供到生物系统中的蛋白质或基因。

如本文所用，术语“异源修饰”可以指来自除特定生物系统(例如，如本文所提供的宿主细胞)原生的来源以外的来源的修饰，或来自特定生物系统原生的来源，但在非原生情境/方位/位置中发现的修饰。因此，修饰就其中已引入或将引入所述修饰的生物系统(例如，如本文所提供的宿主细胞，或宿主细胞内的非原生情境/方位/位置)而言，是非原生的或非天然存在的。因此，异源修饰可以认为被人工地引入到生物系统(例如，如本文所提供的宿主细胞，或宿主内的异源情境/方位/位置)。修饰可以是基因或表观基因变异、破坏或扰动。基因变异、破坏或扰动可以例如将基因的原生启动子和/或终止子用并非所述宿主原生的启动子和/或终止子置换，或其可以是来自已移动到非原生异源情境/方位/位置的宿主生物体内的启动子和/或终止子。基因变异、破坏或扰动可以是用非原生或天然存在的基因(例如，可选标记基因)置换原生或天然存在的基因。或者，基因变异、破坏或扰动可以是将原生或天然存在的基因用来自宿主基因组内的另一原生基因(例如启动子)置换或交换，将所述另一原生基因置于非天然情境/方位/位置中。基因变异、破坏或扰动可以是将原生或天然存在的基因用基因的非原生或天然存在形式置换。基因的非原生或天然存在形式可以是在特定宿主细胞中非天然发现的基因的突变形式和/或可操作地连接到异源启动子和/或终止子的在特定宿主细胞中非天然发现的基因的突变形式。

如本文所用，术语“核苷酸变化”是指例如核苷酸取代、缺失和/或插入，如所属领域中充分了解。举例来说，突变含有产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码的蛋白质的特性或活性或如何制得蛋白质的变异。

如本文所用，术语“蛋白质修饰”是指例如氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入，如在所属领域中充分理解。

如本文所用，核酸或多肽的术语“至少一部分”或“片段”意指具有所述序列的最小尺寸特征的部分，或全长分子任何更大的片段，最多是并且包括全长分子。本发明的多核苷酸的片段可以编码基因调节元件的生物活性部分。基因调节元件的生物活性部分可通过分离本发明的多核苷酸之一的包含基因调节元件的部分并且如本文中所述评估活性来制备。类似地，多肽部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸等，最多是全长多肽。待使用的部分的长度将视特定应用而定。适用作杂交探针的核酸部分可短到12个核苷酸；在一些实施例中，其是20个核苷酸。适用作抗原决定基的多肽部分可以短到4个氨基酸。发挥全长多肽功能的多肽部分将通常长于4个氨基酸。

变异多核苷酸还涵盖衍生自诱变和诱重组程序(如DNA改组)的序列。所述DNA改组的策略在所属领域中已知。参见例如施特默尔(Stemmer)(1994)《美国国家科学院院刊(PNAS)》91:10747-10751；施特默尔(1994)《自然(Nature)》370:389-391；凯默瑞(Crameri)等人(1997)《自然生物技术(Nature Biotech.)》15:436-438；穆尔(Moore)等人(1997)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》272:336-347；张(Zhang)等人(1997)《美国国家科学院院刊》94:4504-4509；凯默瑞等人(1998)《自然》391:288-291；和第5,605,793号与第5,837,458号美国专利。

对于本文所揭示的多核苷酸的PCR扩增，可以设计用于PCR反应中的寡核苷酸引物以由从所关注的任何生物体提取的cDNA或基因组DNA扩增对应DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法是所属领域中通常已知的且揭示于萨布鲁克(Sambrook)等人(2001)《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约普莱恩维尤(Plainview,New York))中。还参见英尼斯(Innis)等人编(1990)《PCR方案：方法和应用指导(PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications)》(学术出版社(Academic Press)，纽约)；英尼斯和吉尔凡(Gelfand)编(1995)《PCR策略(PCR Strategies)》(学术出版社，纽约)；以及英尼斯和吉尔凡编(1999)《PCR方法手册(PCR Methods Manual)》(学术出版社，纽约)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分不匹配引物等的方法。

如本文所用，术语“引物”是指一种寡核苷酸，其当置于诱导引物延伸产物合成的条件下时(即，在核苷酸和聚合试剂(如DNA聚合酶)存在下且在适合温度和pH值下)，能够与扩增标靶粘接，从而允许DNA聚合酶附著，借此充当DNA合成的起始点。(扩增)引物优选是单股的，以获得最大的扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核苷酸。引物必须足够长以在聚合试剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于多种因素，包括引物的温度和组成(A/T相对于G/C含量)。一对双向引物由一个正向和一个反向引物组成，如在DNA扩增(如PCR扩增)领域中通常使用。

术语“严格度”或“严格杂交条件”是指影响杂交物的稳定性的杂交条件，例如温度、盐浓度、pH值、甲酰胺浓度等。这些条件可凭经验优化以最大化特异性结合和最小化引物或探针与其靶核酸序列的非特异性结合。所使用的术语包括提及探针或引物将与其靶序列杂交的条件，相较于其它序列，所述杂交可检测程度更高(例如，至少是背景的2倍)。严格条件为序列依赖性的并且将在不同情形下不同。更长序列在更高温度下特异性地杂交。一般来说，选择严格条件，使其在既定离子强度和pH值下比特定序列的热解链点(Tm)低约5℃。Tm是使50％的互补靶序列与完全匹配的探针或引物杂交的温度(在既定离子强度和pH值下)。典型地，严格条件将是其中在pH 7.0到8.3下，盐浓度低于约1.0M Na+离子，典型地为约0.01到1.0M Na+离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针或引物(例如10到50个核苷酸)温度为至少约30℃且对于长探针或引物(例如大于50个核苷酸)至少为约60℃的条件。严格条件也可以用添加去稳定化剂(如甲酰胺)来实现。示范性低严格条件或“严格度降低的条件”包括在37℃下在30％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液下杂交并且在40℃下，在2×SSC中洗涤。示范性高严格度条件包括在37℃下，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60℃下，在0.1×SSC中洗涤。杂交程序是所属领域中众所周知的并且由例如奥斯贝等人，1998和萨布鲁克等人，2001所述。在一些实施例中，严格条件是在45℃下，在含有1mMNa2EDTA、0.5-20％(如0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％)十二烷基硫酸钠的0.25M Na2HPO4缓冲剂(pH 7.2)中杂交，随后在55℃到65℃下，在含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的5×SSC中洗涤。

如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。在一些实施例中，启动子序列由近端和更远端上游元件组成，后者元件通常被称作增强子。因此，“增强子”是能够刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的固有元件或为了增强启动子的含量或组织特异性而插入的异源元件。启动子可完全来源于原生基因，或由来源于自然界中所发现的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成DNA区段。所属领域的技术人员应理解，不同启动子可引导不同组织或细胞类型中，或处于不同发展阶段，或回应于不同的环境条件的基因的表达。本文所述的方法和系统中使用的启动子可以是诱导型的，使得在所述启动子的控制下的一或多个基因的表达通过存在和/或不存在特定试剂来调节。诱导型启动子可以是其转录活性通过存在或不存在化学或物理条件(例如醇、四环素、类固醇、金属或所属领域中已知的其它化合物)或通过存在或不存在光或低温或高温来调节的任何启动子。另外认识到，由于在大多数情况下，调节序列的确切边界尚未完全界定，因此一些变异形式的DNA片段可以具有相同的启动子活性。

如本文所用，“终止子”一般是指标记基因组DNA中的基因的末端并且能够终止转录的DNA序列的区段。终止子可完全来源于原生基因，或由来源于自然界中所发现的不同终止子的不同元件构成，或甚至包含合成DNA区段。所属领域的技术人员应理解，不同终止子可引导不同组织或细胞类型中，或处于不同发展阶段，或回应于不同的环境条件的基因的表达。

如本文所用，短语“重组构筑体”、“表达构筑体”、“嵌合构筑体”、“构筑体”以及“重组DNA构筑体”在本文中可互换地使用。重组构筑体包含核酸片段的人工组合，例如自然界中未一同发现的调节和编码序列。举例来说，嵌合构筑体可以包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或来源于相同来源的调节序列和编码序列，但其以与自然界中所发现不同的方式排列。所述构筑体可以单独使用或可以与载体结合使用。如所属领域的技术人员众所周知，如果使用载体，那么载体的选择取决于用于转化宿主细胞的方法。举例来说，可以使用质粒载体。所属领域的技术人员深知，为了成功地转化、选择和繁殖包含本发明的任一经分离核酸片段的宿主细胞，基因元件必须存在于载体上。所属领域的技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将引起不同的表达量和模式(琼斯(Jones)等人，(1985)，《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》4:2411-2418；德阿尔梅达(De Almeida)等人，(1989)，《分子基因遗传学(Mol.Gen.Genetics)》218:78-86)，且因此必须对多个事件进行筛选以便获得呈现所期望表达量和模式的株系。所述筛选尤其可通过DNA的萨慎印迹分析(Southernanalysis)、mRNA表达的RNA印迹分析(Northern analysis)、蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析来实现。载体可以是质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等，其自主地复制或可以整合到宿主细胞的染色体中。载体还可以是非自发复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由相同股内的DNA和RNA构成的多核苷酸、聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等。如本文所用，术语“表达”是指功能性最终产物(例如mRNA或蛋白质(前体或成熟物))的产生。

在本文中，“可操作地连接”意指根据本发明的启动子多核苷酸与其它寡核苷酸或多核苷酸的依序排列，从而引起所述其它多核苷酸的转录。

如本文所用，术语“所关注产物”或“生物分子”是指由原料中的微生物产生的任何产物。在一些情况下，所关注产物可以是小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、乙醇等。举例来说，所关注产物或生物分子可以是任何初级或次级胞外代谢物。初级代谢物尤其可以是乙醇、柠檬酸、乳酸、谷氨酸、谷氨酸盐、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和其它氨基酸、维生素、多糖等。次级代谢物尤其可以是抗生素化合物，如青霉素，或免疫抑制剂，如环孢菌素A(cyclosporin A)；植物激素，如赤霉素；抑制素药物，如洛伐他汀(lovastatin)；杀真菌剂，如灰黄霉素(griseofulvin)等。所关注产物或生物分子也可以是微生物产生的任何胞内组分，如：微生物酶，包括：催化酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖异构酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、乳糖酶、链激酶及多种其它物质。胞内组分也可包括重组蛋白，如：胰岛素、B型肝炎疫苗、干扰素、粒细胞集落刺激因子、链激酶等。所关注产物还可以指“所关注的蛋白质”。

术语“所关注的蛋白质”一般是指期望在丝状真菌中表达的任何多肽。所述蛋白质可以是酶、衬底结合蛋白质、表面活性蛋白质、结构蛋白质等，并且可以高水平表达，并且可以是出于商业化目的。所关注的蛋白质可以由相对于变异菌株和/或亲本菌株的内源基因或异源基因编码。所关注的蛋白质可以细胞内表达或以分泌的蛋白质形式表达。如果所关注的蛋白质不是天然分泌的，那么可根据所属领域中已知的技术对编码蛋白质的多核苷酸进行修饰，以具有信号序列。分泌的蛋白质可以是天然表达的内源蛋白，但也可以是异源的。“异源”意指由蛋白质编码的基因不在丝状真菌宿主细胞中的原生条件下产生。可以由本发明的丝状真菌产生的酶的实例为：糖酶，例如纤维素酶(如内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶)，纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶，半纤维素或果胶分解酶，如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、聚半乳糖醛酸酶、裂解酶或淀粉分解酶；磷酸酶，如植酸酶、酯酶(如脂肪酶)、蛋白水解酶、氧化还原酶(如氧化酶)、转移酶或异构酶。

术语“碳源”一般是指适用作供细胞生长用的碳源的物质。碳源包括但不限于生物质水解产物、淀粉、蔗糖、纤维素、半纤维素、木糖和木质素，以及这些底物的单体组分。碳源可以包含各种形式的各种有机化合物，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽等。这些包括例如各种单糖，如葡萄糖、右旋糖(D-葡萄糖)、麦芽糖、寡糖、多糖、饱和或不饱和脂肪酸、丁二酸盐、乳酸盐、乙酸盐、乙醇等，或其混合物。光合生物体可以另外产生作为光合成产物的碳源。在一些实施例中，碳源可以选自生物质水解产物和葡萄糖。

术语“原料”定义为供应给微生物体或发酵过程的原材料或原材料混合物，利用所述过程可以制备其它产物。举例来说，碳源，如生物质或来源于生物质的碳化合物，是供在发酵过程中产生所关注产物(例如小分子、肽、合成化合物、燃料、乙醇等)的微生物体用的原料。然而，原料可以含有不同于碳源的营养物。

术语“体积生产率”或“生产速率”定义为每体积培养基每单位时间形成的产物的量。体积生产率可以克/升/小时(g/L/h)为单位来报告。

术语“比生产率”定义为产物的形成速率。比生产力在本文中进一步定义为以克产物/克细胞干重(CDW)/小时(g/g CDW/h)为单位的比生产力。使用指定微生物体的CDW与OD

术语“产率”定义为每单位重量的原材料所得的产物的量且可以用克产物/克底物(g/g)表示。产率可以用理论产量的百分比表示。“理论产量”定义为每指定量的底物可产生的最大产物量，如根据用于制造产物的代谢路径的化学计量学所指定。

术语“滴度(titre)”或“效价(titer)”定义为溶液的浓度(strength)或溶液中的物质的浓度(concentration)。举例来说，将所关注产物(例如小分子、肽、合成化合物、燃料、乙醇等)在发酵培养液中的滴度描述为溶液中的所关注产物克数/升发酵培养液(g/L)。

术语“总效价”定义为工艺中所产生的所有所关注产物的总和，包括但不限于溶液中的所关注产物、气相(如果适用)中的所关注产物和从工艺中去除并且相对于工艺中的初始体积或工艺中的操作体积所回收的任何所关注产物。

如本文所用，术语“HTP基因设计库”或“库”是指根据本发明的基因扰动的集合。在一些实施例中，本发明的库可显现为i)在数据库或其它计算机文件中的序列信息的集合，ii)对前述系列的基因元件进行编码的基因构筑体的集合，或ⅲ)包含所述基因元件的宿主细胞菌株。在一些实施例中，本发明的库可以指个别元件的集合(例如用于PRO交换库的启动子的集合，或用于STOP交换库的终止子的集合)。在其它实施例中，本发明的库也可以指基因元件的组合，如启动子::基因、基因:终止子或甚至启动子:基因:终止子的组合。在一些实施例中，本发明的库进一步包含与库中的每个成员应用于宿主生物体中的作用相关的元数据。举例来说，如本文所用的库可以包括启动子::基因序列组合的集合，以及那些组合对一或多种表型的所得作用，如在特定物种中当在浸没培养物中生长时形态的改变，由此改良在未来启动子交换中使用所述组合的未来预测值。

如本文所用，术语“SNP”可以指一或多种小核多态性。在一些实施例中，本发明的SNP应广义理解，且包括单核苷酸多态性、序列插入、缺失、倒位和其它序列置换。如本文所用，术语“非同义”或非同义SNP”是指引起宿主细胞蛋白中的编码变化的突变。

“高通量(HTP)”基因组工程改造方法可能涉及使用自动化设备(例如液体处置机或培养板处置机)的至少一个零件执行所述方法的至少一个步骤。

术语“大体上减少”和“大体上更少”在本文中可互换地使用，并且当提及蛋白质或酶的表达量或量或活性水平时，可以指所述量或活性相比于或相对于所述蛋白质或酶的对照或参考水平或活性降低百分比或百分比范围。术语“大体上减少”和“大体上更少”可指相比于或相对于对照组或参考组(例如所述蛋白质或酶的对照或参考水平或活性)，蛋白质或酶的量或含量或酶的活性降低至少、至多、恰好或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。术语“大体上减少”和“大体上更少”可指相比于或相对于对照组或参考组(例如所述蛋白质或酶的对照或参考含量或活性)，蛋白质或酶的量或含量或酶的活性(例如酶促活性)降低1％-5％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-100％，包括端点。术语“大体上减少”和“大体上更少”也可以意味着蛋白质或酶的量或酶的活性可以是所述蛋白质或酶的对照或参考形式的量或所述酶的活性的至少、至多、恰好或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。术语“大体上减少”和“大体上更少”也可以意味着蛋白质或酶的量或酶的活性是所述蛋白质或酶的对照或参考形式的量或酶的活性的1％-5％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％、30％-35％、35％-40％、40％-45％、45％-50％、50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-100％，包括端点。关于蛋白质或酶的含量或量，对照组或参考组可以是对照或参考细胞中所述蛋白质或酶的含量或量。在一个实施例中，参考细胞的对照组中的所测试的蛋白质或酶不具有异源修饰。关于酶的活性，对照组或参考组可以是对照或参考细胞中所述蛋白质或酶的活性。在一个实施例中，参考细胞的对照组中的所测试的蛋白质或酶不具有异源修饰。

本文所提供的蛋白质或酶的含量或活性可以在细胞内或在从细胞提取和/或分离之后(例如，体外)测量。在一些情况下，测量或测定编码所关注的蛋白质的基因的含量或量。本文所提供的基因的含量或量可以在细胞内或在从细胞提取之后(例如，体外)测量。在一些情况下，测量或测定由本文所提供的基因编码的酶的活性。由本文所提供的基因编码的酶的活性(例如，比活性)可以在细胞内或在从细胞提取之后(例如，体外)测量。用于测量本文所提供的基因或蛋白质的表达水平或量的分析在本质上可为高通量的。用于测量由本文所提供的基因编码的酶的活性的分析在本质上可为高通量的。

本文所提供的基因的含量或量可以使用所属领域中已知的用于测量核酸层级的基因的含量或量的任何分析测量。用于测定或测量核酸(例如本文所提供的基因)含量的适合分析的实例可以选自微阵列分析、RT-PCR(如定量RT-PCR(qRT-PCR))、基因表达的连续分析(SAGE)、RNA测序、RNA印迹法、数字分子条形码技术(例如Nanostring Counter分析)和TaqMan定量PCR分析。可以应用mRNA检测和定量的其它方法，如mRNA原位杂交。可以使用QuantiGene ViewRNA(昂飞(Affymetrix))测量mRNA原位杂交，所述QuantiGene ViewRNA使用探针组以用于特异性地结合于扩增系统的每个mRNA以放大杂交信号；这些经过放大的信号可以使用标准荧光显微镜或成像系统观测。这一系统例如可检测和测量非均质样品中的转录水平；

由本文所提供的基因编码的蛋白质的含量或量可以使用所属领域中已知的用于测量蛋白质层级的含量或量的任何分析测量。用于测定或测量蛋白质含量(例如由本文所提供的基因编码)的适合的分析的实例可以选自定量质谱分析或免疫分析，包括例如免疫组织化学、ELISA、蛋白质印迹法(Western blot)、免疫沉淀法、

由本文所提供的基因编码的酶的活性可以使用所属领域中已知的用于测量酶活性的任何分析来测量。用于测定酶活性的适合的分析的实例可以是所属领域中已知的任何激酶分析，例如可购自以下的生物化学激酶分析：EMD密理博(EMD Millipore)(例如基于FRET的HTRF分析)、电子生物科学(eBioscience)(例如Instant One细胞信号传导分析)、生命技术(Life Technologies)(LanthaScreen或Omnia激酶分析)、西马尼司(Symansis)(例如多激酶分析阵列)、艾碧康(Abcam)或普洛麦格(Promega)(例如ADP-Glo激酶分析)。激酶活性分析可以是基于辐射测量的并且使用放射性同位素(例如λ-

概述

本发明的一个目的是提供当在用于所关注产物的生产培养基中生长时具有所期望形态表型的丝状真核生物体的菌株以及产生丝状真核生物体的所述菌株的方法。与亲本或对照菌株相比，使用本文所提供的方法产生的具有所期望形态表型的变异菌株可得到所述所关注产物的更高产量、效价或总效价。与亲本或对照菌株相比，使用本文所提供的方法产生的具有所期望形态表型的变异菌株可以更高的生产速率产生所述所关注产物。与亲本或对照菌株相比，使用本文所提供的方法产生的具有所期望形态表型的变异菌株可以更高体积生产率或比生产率产生所述所关注产物。丝状真核生物体可以是所属领域中已知和/或本文中提供的任何丝状真核生物体，例如黑曲霉(Aspergillus niger/A.niger)。对于所关注的所期望产物，所期望形态表型当在浸没培养条件下在所期望生产培养基中生长时可为非菌丝体球粒表型。所期望产物或所关注产物可以是表1中列出的任何产物。在一个实施例中，所关注的所期望产物为酶。酶可以是所属领域中已知的将由遗传工程改造的生物体产生的任何酶。酶可以是见于表1中的任何酶。在一个实施例中，所关注的所期望产物为柠檬酸，且所期望生产培养基为柠檬酸生产(CAP)培养基。在一些情况下，包含所期望形态表型(例如非菌丝体球粒形态)的丝状真核菌株(例如黑曲霉)可在不含或大体上不含(例如，所属领域中已知的用于产生所关注产物(例如柠檬酸)的发酵培养液中存在的螯合剂的量或浓度小于5％、4％、3％、2％或1％)螯合剂(例如锰螯合剂)的包含锰的CAP培养基中生长。锰可以约13ppb或更大的量存在。锰可以约14ppb或更大的量存在。在另一实施例中，包含所期望形态表型(例如非菌丝体球粒形态)的丝状真核菌株(例如黑曲霉)的所提供的菌株包含一或多种在控制已变异或被破坏的形态中起作用的基因。破坏或变异可以是基因的编码结构域内的突变。破坏或变异可以是基因控制元件(例如启动子和/或终止子)的变异。破坏或变异可以是基因的编码结构域内的突变与基因控制元件(例如启动子和/或终止子)的变异的组合。基因控制元件的变异可以是用非原生或异源基因控制元件置换内源基因控制元件。在一些情况下，所述基因控制元件为启动子。启动子可以选自表2中列出的启动子。在控制形态中起作用的一或多个基因可以是所属领域中已知的在控制丝状真核生物体(例如黑曲霉)的形态中起作用的任何基因。在控制形态中起作用的基因可以是编码在细胞的物理结构中起作用的蛋白质的基因，以及作为直接或间接调节或管控在细胞的物理结构中起作用的蛋白质的表达的生物化学路径的一部分的基因。在控制形态中起作用的一或多个基因可以是本文所提供的任何基因，例如单独的来自表4的由SEQ ID NO:5、6、7或8或其直系同源物表示的含有SNP的基因序列，或其与在与所述含有SNP的基因序列相同的路径内发现的一或多个基因的组合。在一个实施例中，在控制形态中起作用的一或多个基因为来自渗透反应或渗透应激反应路径的一或多个基因。举例来说，一或多个基因或其直系同源物可以选自表7中所示的渗透反应路径基因。在一个实施例中，在控制曲霉宿主细胞(例如黑曲霉)的形态中起作用的一或多个基因为表7中展示的酵母渗透路径基因中的一或多个的直系同源物。举例来说，酵母渗透反应路径的一或多个基因的黑曲霉直系同源物可以选自由SEQID NO.9-32、76或其任何组合表示的核酸序列。产生当在用于所关注产物的生产培养基中生长时具有所期望形态表型的丝状真核生物体的菌株的方法可包含进行如本文所提供的PRO交换方法、SNP交换方法或PRO交换和SNP交换方法的组合。SNP交换和/或PRO交换方法可以如2018年6月6日提交的PCT/US2018/036360中所描述进行，所述文献以引用的方式并入本文中。

表1.-本发明的所关注宿主细胞和产物的非限制性列表。

本发明的另一目的是提供一种包含来自宿主细胞的渗透反应路径的基因的异源修饰的丝状真菌宿主细胞。所述基因可以是来自丝状真菌宿主细胞的渗透反应路径的基因中的任一个或其组合。来自渗透路径的经修饰的基因与基因的未经修饰形式相比可具有降低的表达和/或编码具有降低的活性的蛋白质。在一个实施例中，所述基因为表7中列出的酵母渗透反应路径基因中的一个的丝状真菌直系同源物。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为曲霉宿主细胞(例如黑曲霉)，且所述基因为表7中展示的酵母渗透路径基因中的一或多个的黑曲霉直系同源物。举例来说，酵母渗透反应路径的一或多个基因的黑曲霉直系同源物可以选自由SEQ ID NO.9-32或76表示的核酸序列。在另一实施例中，来自表7中列出的酵母渗透反应路径基因的多种丝状真菌直系同源物在丝状真菌宿主细胞中经异源修饰。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞包含酿酒酵母SLN1基因的丝状真菌宿主细胞直系同源物的异源修饰。酿酒酵母SLN1基因的经修饰的直系同源物相对于不具有异源修饰的亲本丝状真菌宿主细胞可具有降低的表达和/或编码具有降低的活性的酿酒酵母SLN1蛋白质的直系同源物。丝状真菌宿主可具有非菌丝体成球粒表型。这种球粒表型可归因于丝状真菌宿主细胞在一或多个来自渗透反应路径的基因(例如酿酒酵母SLN1基因的直系同源物)中具有异源修饰，使得相比于不具有所述一或多个异源修饰的丝状宿主细胞的细胞，丝状宿主细胞的细胞产生减少量或大体上减少量的一或多个经修饰的基因的功能直系同源物(例如酿酒酵母SLN1蛋白质的直系同源物)，和/或其活性较低或大体上活性较低的形式。相比于亲本或对照菌株中相应功能蛋白的量，丝状真菌宿主细胞中功能蛋白的量可以减少至少、至多、恰好或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。功能蛋白的量(例如摩尔量)可以使用所属领域中已知的任何方法测量，例如ELISA、

在一个实施例中，当在非浸没生长条件(例如在固体培养基上)下生长时，与亲本菌株相比，丝状真菌宿主细胞正常产孢。在另一实施例中，只有当来自表3的含有SNP的基因或其直系同源物中的一种、全部或组合也在丝状真菌宿主细胞中表达时，当在非浸没生长条件(例如在固体培养基上)下生长时，与亲本菌株相比，丝状真菌宿主细胞正常产孢。在一个实施例中，丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且只有当来自表3的含有SNP的基因中的一种、全部或组合也在所述黑曲霉宿主细胞中表达时，当在非浸没生长条件(例如在固体培养基上)下生长时，与亲本菌株相比，所述黑曲霉宿主细胞正常产孢。在又一实施例中，只有当来自表4的含有SNP的基因的直系同源物中的一种、全部或组合也在丝状真菌宿主细胞中表达时，当在非浸没生长条件(例如在固体培养基上)下生长时，与亲本菌株相比，丝状真菌宿主细胞正常产孢。在一个实施例中，丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且只有当来自表4的含有SNP的基因中的一种、全部或组合也在所述黑曲霉宿主细胞中表达时，当在非浸没生长条件(例如在固体培养基上)下生长时，与亲本菌株相比，所述黑曲霉宿主细胞正常产孢。浸没培养条件可以包含在CAP培养基中生长变异菌株。CAP培养基可包含锰并且不含或大体上不含(例如，所属领域中已知的用于产生所关注产物(例如柠檬酸)的发酵培养液中存在的螯合剂的量或浓度小于5％、4％、3％、2％或1％)螯合剂。锰可以至少13ppb或更高的量存在。锰可以至少14ppb或更高的量存在。

来自丝状真菌的渗透反应路径的多个基因的基因或每个基因的遗传变异或异源修饰可以是用突变形式置换基因的野生型形式、用相比于原生启动子更弱地表达基因的异源启动子置换基因的原生启动子，或其组合。或者，来自丝状真菌的渗透反应路径的多个基因的基因或每个基因的遗传变异或异源修饰可以是去除基因(例如酿酒酵母SLN1基因的直系同源物的基因)并且用可选标记基因置换。来自丝状真菌的渗透反应路径的多个基因的基因或每个基因的突变形式可包含SNP、无义突变、错义突变、缺失、插入或其任何组合。来自渗透反应路径的多个基因的基因或每个基因可以是来自丝状真菌宿主细胞的渗透反应路径的基因中的任一个。在一个实施例中，来自渗透反应路径的多个基因的基因或每个基因是表7中列出的酵母渗透反应路径基因中的一个的丝状真菌直系同源物。在一个实施例中，来自渗透反应路径的基因是酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因或其任何组合的直系同源物。酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因的核酸序列可选自SEQ ID NO:50-75。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且酵母SLN1、Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因的直系同源物为黑曲霉直系同源物或其突变体。举例来说，黑曲霉直系同源物可以选自由SEQ ID NO.9-32或76表示的核酸序列。在一个实施例中，作为渗透反应路径的一部分的黑曲霉直系同源物可以选自由SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合表示的核酸序列。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且来自渗透反应路径的基因为酿酒酵母SLN1基因的黑曲霉直系同源物。在另一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且来自渗透反应路径的基因具有SEQ ID NO:7的核酸序列，其包含将所编码蛋白质中的272氨基酸位置处的组氨酸转化成酪氨酸的错义突变。在又一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且来自渗透反应路径的基因具有SEQ ID NO:7的核酸序列，其包含将所编码蛋白质中的272氨基酸位置处的组氨酸转化成酪氨酸的错义突变，并且可操作地连接到更弱地表达SEQ ID NO.7的核酸序列的启动子。在再一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且来自渗透反应路径的基因具有SEQ ID NO:14或76的核酸序列，其可操作地连接到更弱地表达SEQ ID NO.14或76的核酸序列的启动子。此外，对以上实施例中的任一个，异源启动子可以选自表2中列出的启动子。在一个实施例中，异源启动子为manB或amyB启动子。此外，对这个实施例，异源启动子可具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。在一个实施例中，所述启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子可以用于确保在产孢期间基因(如酿酒酵母SLN1基因(例如黑曲霉nikA基因)的直系同源物)的恰当表达，但降低在产生所关注的所期望产物所需的特定条件下(例如在发酵条件下)所述基因的表达以便在所述条件下促进非菌丝体球粒表型。amyB启动子为可如此利用的诱导型启动子的实例。可选标记物可以选自如本文所提供的营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

在一个实施例中，本文中所提供或使用本文中所提供的方法产生的丝状真菌宿主细胞具有减少量或大体上减少量的酿酒酵母SLN1蛋白质的功能直系同源物，和/或其活性较低或大体上活性较低的形式，并且进一步包含作为与酿酒酵母SLN1蛋白质的直系同源物相同的路径(即，渗透反应路径)的一部分的一或多种额外基因中的遗传破坏或变异。作为相同路径的一部分的一或多个基因可以是来自表7中列出的酵母渗透反应路径的基因中的任一个的直系同源物。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞进一步包含酿酒酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因或其任何组合的直系同源物。酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因的核酸序列可选自SEQ ID NO:50-75。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且酿酒酵母SLN1、Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因的直系同源物为黑曲霉直系同源物或其突变体。举例来说，黑曲霉直系同源物可以选自由SEQ ID NO.9-32或76表示的核酸序列。此外，对这个实施例，作为相同路径(即，渗透反应路径)的一部分的一或多个基因可以选自由SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合表示的核酸序列。丝状真菌宿主细胞可以进一步包含一或多个基因的遗传破坏或变异，所述基因是已知或疑似在控制丝状真菌形态中起作用的一或多个不同路径的一部分。作为一或多个不同路径的一部分的一或多个基因可以选自具有由SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合表示的核酸序列的基因的直系同源物。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且作为一或多个不同路径的一部分的一或多个基因为具有由SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合表示的核酸序列的黑曲霉基因。在另一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且作为一或多个不同路径的一部分的一或多个基因为具有由SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合表示的核酸序列的黑曲霉基因的不含SNP的形式。具有由SEQ ID NO:5、6、8表示的核酸序列的黑曲霉基因的不含SNP的形式可以分别是SEQ ID NO.77-79的核酸序列。

作为已知或疑似在控制丝状真菌形态中起作用的一或多个不同路径的一部分的一或多个基因的遗传破坏或变异可为用基因的突变形式置换基因的野生型形式、用相比于原生启动子改变基因的表达(例如更高或更低)的异源启动子置换基因的原生启动子，或其组合。启动子可以是表2中列出的启动子。在一个实施例中，所述启动子可以是诱导型启动子。或者，是已知在控制丝状真菌形态中起作用的不同路径的一部分的一或多个基因的遗传破坏或变异可以是去除基因并且用可选标记基因置换。可选标记物可以选自如本文所提供的营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

本文还提供产生具有减少量或大体上减少量的一或多种功能蛋白和/或其活性较低或大体上活性较低的形式的丝状真菌宿主细胞的方法，所述蛋白为所述丝状真菌宿主细胞的渗透反应路径的一部分。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞具有减少量或大体上减少量的一或多种功能蛋白和/或其活性较低或大体上活性较低的形式，所述蛋白为如所属领域中已知和/或表7中所示的来自酵母渗透反应路径的一或多种蛋白质的直系同源物。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞具有减少量或大体上减少量的功能蛋白和/或其活性较低或大体上活性较低的形式，所述蛋白为酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的直系同源物。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞具有减少量或大体上减少量的功能蛋白和/或其活性较低或大体上活性较低的形式，所述蛋白为如表7中所示的来自酵母渗透反应路径的多个基因中的每一个的蛋白。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且所述宿主细胞具有减少量或大体上减少量的功能蛋白和/或其活性较低或大体上活性较低的形式，所述蛋白为来自酵母渗透反应路径的多个基因中的每一个的黑曲霉直系同源物。所述黑曲霉直系同源物可以选自由SEQ ID NO.9-32或76表示的核酸序列。所述方法可包含进行如本文所提供的PRO交换方法、SNP交换方法或PRO交换和SNP交换方法的组合。相比于亲本或对照菌株中相应功能蛋白的量，丝状真菌宿主细胞中功能蛋白的量可以减少至少、至多、恰好或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。功能蛋白的量(例如摩尔量)可以使用所属领域中已知的任何方法测量，例如ELISA、

本发明的另一目的是提供一种包含具有选自SEQ ID NO.5、6、8、77、78、79或其任何组合的核酸序列的黑曲霉基因的宿主细胞的直系同源物的异源修饰的丝状真菌宿主细胞，其中包含所述异源修饰使得具有选自SEQ ID NO.5、6、8、77、78、79或其任何组合的核酸序列的黑曲霉基因的经修饰的直系同源物相对于不具有一或多个异源修饰的亲本丝状真菌宿主细胞，具有降低的活性和/或减少的表达。丝状真菌宿主当在浸没培养物中生长时相比于亲本菌株的细胞可具有非菌丝体成球粒表型，这是由于所述丝状宿主细胞具有对具有SEQ ID NO:5、6、8、77、78、79或其任何组合的核酸序列的黑曲霉基因的直系同源物的异源修饰。具有SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的黑曲霉基因的直系同源物可使得在浸没培养条件下生长时相比于亲本宿主细胞的细胞，宿主细胞的细胞产生减少量或大体上减少量的由具有所述SEQ ID NO的黑曲霉基因的直系同源物编码的功能蛋白，和/或其活性较低或大体上活性较低的形式。丝状宿主细胞和所述丝状真菌宿主细胞的亲本菌株可以是所属领域中已知和/或本文中提供的任何丝状真菌，例如黑曲霉。在一个实施例中，当在非浸没生长条件(例如在固体培养基上)下生长时，与亲本菌株相比，丝状宿主细胞菌株正常产孢。在一些情况下，具有SEQ ID NO:5、6、8、77、78或79的黑曲霉基因的直系同源物进一步遗传变异。进一步遗传变异可以是用相比于原生启动子更弱地表达基因的异源启动子置换基因的原生启动子。或者，进一步遗传变异可以是去除具有SEQ ID NO:5、6、8、77、78或79的黑曲霉基因的直系同源物并且用可选标记基因置换。可选标记物可以选自如本文所提供的营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。异源启动子可以选自表2中列出的启动子。在一个实施例中，异源启动子为manB或amyB启动子。此外，对这个实施例，异源启动子可具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。在一个实施例中，启动子为诱导型启动子。浸没培养条件可以包含在CAP培养基中生长变异菌株。CAP培养基可包含锰，且大体上不含或不含螯合剂。锰可以至少13ppb或更高的量存在。锰可以至少14ppb或更高的量存在。应理解，在其中丝状真菌宿主细胞为黑曲霉的实施例中，黑曲霉基因具有选自SEQ ID NO.5、6、8或其野生型形式的核酸序列(例如，具有SEQ ID NO.77-79的核酸序列)可包含本文详述的异源修饰。

具有大体上减少量或减少量的由具有选自SEQ ID NO:5、6、8、77、78或79的序列的黑曲霉基因的直系同源物所编码的功能蛋白，和/或其大体上活性较低或活性较低的形式的丝状真菌宿主细胞可进一步包含是相同路径的一部分的一或多个基因的遗传破坏或变异。丝状真菌宿主细胞可进一步包含一或多个基因的遗传破坏或变异，所述基因是已知在控制丝状真菌形态中起作用的不同路径的一部分。作为不同路径的一部分的一或多个基因可以是本文所提供的基因中的任一个，如作为宿主细胞渗透反应路径的一部分的基因。作为相同路径的一部分，或已知在控制丝状真菌形态中起作用的不同路径的一部分的一或多个基因的遗传破坏或变异可以是用基因的突变形式置换基因的野生型形式，用相比于原生启动子改变基因的表达(例如更高或更低)的异源启动子置换基因的原生启动子，或其组合。启动子可以是表2中列出的启动子。在一个实施例中，启动子为诱导型启动子。或者，作为相同路径的一部分，或已知在控制丝状真菌形态中起作用的不同路径的一部分的一或多个基因的遗传破坏或变异可以是去除基因并且用可选标记基因置换。可选标记物可以选自如本文所提供的营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

本文还提供产生具有大体上减少量或减少量的由具有SEQ ID NO:5、6、8、77、78或79的黑曲霉基因的直系同源物所编码的功能蛋白，和/或其大体上活性较低或活性较低的形式的丝状真菌的变异菌株的方法。所述方法可包含进行如本文所提供的PRO交换方法、SNP交换方法或PRO交换和SNP交换方法的组合。相比于亲本或对照菌株中相应功能蛋白的量，变异菌株中由具有SEQ ID NO:5、6、8、77、78或79的黑曲霉基因的直系同源物所编码的功能蛋白的量可以减少至少、至多、恰好或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。功能蛋白的量(例如摩尔量)可以使用所属领域中已知的任何方法测量，例如ELISA、

本发明的又一目的是提供一种丝状真菌宿主细胞，其包含可操作地连接于调节所述宿主细胞的形态的基因的启动子，其中所述启动子与所述基因异源，且其中所述启动子具有选自由SEQ ID NO.1-4组成的群组的核酸序列。丝状真菌宿主细胞可以是所属领域中已知和/或本文提供的任何丝状真菌，例如黑曲霉。在一些情况下，当在非浸没生长条件(例如在固体培养基上)下生长时，与宿主细胞的亲本菌株相比，真菌宿主细胞正常产孢，但当在浸没培养条件下生长时，形成非菌丝体球粒形态。在一些情况下，宿主细胞可包含调节形态的一或多个基因，以使得所述一或多个基因中的每一个具有与其连接的异源启动子。调节宿主细胞形态的一或多个基因可以是如本文所提供的任何所述基因，例如单独或呈组合形式的来自表4的由SEQ ID NO:5、6、7或8或其直系同源物表示的含有SNP的基因序列。在一些情况下，来自表4的由SEQ ID NO:5、6、7或8或其直系同源物表示的含有SNP的基因序列可以与来自与相应含有SNP的基因序列相同的路径的一或多个基因组合。在一个实施例中，所述一或多个基因为具有单独或呈组合形式的选自SEQ ID NO:5、6、7或8的核酸序列(例如SEQ ID NO.76-79的核酸序列)或其直系同源物的基因的野生型或不含SNP的形式。在另一实施例中，具有选自SEQ ID NO:5、6、7或8的核酸序列(例如SEQ ID NO.76-79的核酸序列)或其直系同源物的基因的野生型或不含SNP的形式可以与来自与相应野生型或不含SNP的基因序列相同的路径的一或多个基因组合。在一个实施例中，调节宿主细胞的形态的基因可以是来自宿主细胞的渗透反应路径的基因。在另一实施例中，来自宿主细胞的渗透反应路径的多个基因组合使用以调节宿主细胞的形态。在一个实施例中，调节宿主细胞的形态的基因可以是酿酒酵母SLN1基因的直系同源物或如表7中所示的来自酵母渗透反应路径的基因的直系同源物。在另一实施例中，如表7中所示的来自酵母渗透反应路径的多个直系同源物组合使用以调节宿主细胞的形态。在一个实施例中，来自酵母渗透反应路径的基因的直系同源物可选自酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因或其任何组合的直系同源物。在一个实施例中，来自酵母渗透反应路径的基因的直系同源物可以具有为选自SEQ ID NO:50-75的核酸序列的直系同源物的序列。

在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物可操作地连接到具有选自由SEQ ID NO.1-4组成的群组的核酸序列的启动子。在另一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物可操作地连接到具SEQ ID NO.1的核酸序列的启动子。在另一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物可操作地连接到具SEQ ID NO.2的核酸序列的启动子。酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物可为基因的野生型或突变形式。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的突变黑曲霉直系同源物具有SEQ ID NO:7的核酸序列。在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的野生型黑曲霉直系同源物具有SEQ ID NO:14或76的核酸序列。浸没培养条件可以包含在CAP培养基中生长变异菌株。CAP培养基可包含锰并且不含或大体上不含(例如，所属领域中已知的用于产生所关注产物(例如柠檬酸)的发酵培养基中存在的螯合剂的量或浓度小于5％、4％、3％、2％或1％)或不含螯合剂。锰可以至少13ppb或更高的量存在。锰可以至少14ppb或更高的量存在。

在一个实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且来自酵母渗透反应路径的一或多个直系同源物可操作地连接到具有选自由SEQ ID NO.1-4组成的群组的序列的启动子。在另一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且来自酵母渗透反应路径的直系同源物中的一或多个可操作地连接到具有SEQ ID NO.1的核酸序列的启动子。在又一实施例中，所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉，且来自酵母渗透反应路径的直系同源物中的一或多个可操作地连接到具有SEQ ID NO.2的核酸序列的启动子。一或多个直系同源物可选自表7中列出的黑曲霉直系同源物。举例来说，黑曲霉直系同源物可以选自由SEQ ID NO.14-32、76或其任何组合表示的核酸序列。在一个实施例中，一或多个直系同源物选自由SEQ IDNO:9、10、11、12、13或其任何组合表示的核酸序列。浸没培养条件可以包含在CAP培养基中生长变异菌株。CAP培养基可包含锰并且不含或大体上不含(例如，所属领域中已知的用于产生所关注产物(例如柠檬酸)的发酵培养基中存在的螯合剂的量或浓度小于5％、4％、3％、2％或1％)或不含螯合剂。锰可以至少13ppb或更高的量存在。锰可以至少14ppb或更高的量存在。

丝状真核微生物

在一个实施例中，本文所提供的用于产生具有所期望球粒形态的丝状真菌宿主细胞或菌株的方法和系统使用来源于丝状真菌的能够在培养基中容易地与其它所述元件分离，并且能够复制自身的真菌元件。举例来说，例如真菌元件可以是孢子、繁殖体、菌丝片段、原生质体或微球粒。在一优选实施例中，本文所提供的系统和方法利用来源于丝状真菌的原生质体。适合的丝状真菌宿主细胞包括例如子囊菌门(Ascomycota)、半知菌门(Deuteromycota)、接合菌门(Zygomycota)或半知菌(Fungi imperfecti)门的任何丝状形式。适合的丝状真菌宿主细胞包括例如真菌门(Eumycotina)亚门的任何丝状形式。(参见例如霍克索斯(Hawksworth)等人，《安·贝氏真菌词典(Ainsworth and Bisby's Dictionaryof The Fungi)》，第8版，1995年，CAB国际，大学出版社，英国剑桥(CAB International,University Press,Cambridge,UK)，所述文献以引用的方式并入本文中)。在某些说明性但非限制性的实施例中，丝状真菌宿主细胞可以是以下物种的细胞：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。在一个实施例中，丝状真菌选自由以下组成的群组：构巢曲霉、米曲霉、酱油曲霉，和黑曲霉群组的曲霉菌(Aspergilli)。在一优选实施例中，丝状真菌为黑曲霉。

在一个实施例中，丝状真菌为选自以下的生产菌株：臭曲霉ACM 3996(Aspergillus foetidus ACM 3996)(＝FRR 3558)、稻热病菌Guy-11(Magnaporthe griseaGuy-11)或黄孢原毛平革菌RP78(Phanerochaete chrysosporium RP78)。在分开的实施例中，丝状真菌为所属领域中已知的黑曲霉生产菌株。本文所提供的方法中使用的黑曲霉生产菌株的实例可包括黑曲霉ATCC 11414、ATCC 1015、ACM 4992(＝ATCC 9142)、ACM 4993(＝ATCC10577)、ACM 4994(＝ATCC 12846)、ATCC26550、ATCC 11414、N402、CBS 513.88或NRRL3(ATCC 9029、CBS 120.49)。

在另一实施例中，真菌物种的特定突变体用于本文所提供的方法和系统以产生具有所期望球粒形态的丝状真菌宿主细胞或菌株。在一个实施例中，使用真菌物种的特定突变体，其适用于本文所提供的高通量和/或自动化方法和系统。所述突变体的实例可以是非常良好地形成原生质体的菌株；主要产生具有单核的原生质体的菌株；在微量滴定板中高效再生的菌株；再生较快的菌株和/或高效吸收多核苷酸(例如DNA)分子的菌株；随机整合较少的菌株(例如失能的非同源末端接合路径)；或其组合。在又一实施例中，供本文所提供的方法和系统使用的特定突变菌株可以是不具有可选标记基因的菌株，例如需要尿苷的突变菌株。这些突变菌株可以缺乏分别由pyrG或pyrE基因编码的乳清酸核苷5磷酸脱羧酶(OMPD)或乳清酸对核糖基转移酶(OPRT)(T.古森(T.Goosen)等人，《现代遗传学(CurrGenet.)》，1987，11:499 503；J.贝格瑞特(J.Begueret)等人，《基因》，1984 32:487 92。

在再一实施例中，用于本文所提供的方法和系统中以产生具有所期望球粒形态的丝状真菌宿主细胞或菌株的突变菌株在其DNA修复系统中经修饰，其修饰方式为使得所述突变菌株在同源重组中极高效和/或在随机整合中极低效。核酸构筑体通过同源重组靶向整合到宿主细胞的基因组中(即在预定靶基因座中整合)的效率可以通过宿主细胞增强的同源重组能力和/或减弱的非同源重组能力来提高。同源重组的增强可以通过过度表达涉及同源重组的一或多个基因(例如Rad51和/或Rad52蛋白质)来实现。本发明的宿主细胞中的非同源重组或非同源末端接合(NHEJ)路径的去除、破坏或减少可以通过所属领域中已知的任何方法实现，例如通过使用针对非同源重组(NHR)或NHEJ路径的组分(例如酵母KU70、酵母KU80或其同系物)的抗体、化学抑制剂、蛋白质抑制剂、物理抑制剂、肽抑制剂或反义或RNAi分子。可使用化学抑制剂实现NHEJ路径的抑制，所述化学抑制剂如阿拉斯SMD(ArrasSMD)，弗雷泽JA(Fraser JA)(2016)，《非同源末端接合的化学抑制剂增加新型隐球菌中的靶向构筑体整合(Chemical Inhibitors of Non-Homologous End Joining IncreaseTargeted Construct Integration in Cryptococcus neoformans)》公共科学图书馆·综合11(9)：e0163049中所描述，其内容以引用的方式并入本文中。用一或多种化学抑制剂处理以促进停用或减少NHEJ路径可以在产生原生质体之前和/或期间进行。或者，用于本文中所提供的方法的宿主细胞可能缺乏NHR路径的一或多个基因(例如酵母ku70、ku80或其同系物)。所述突变体的实例为如WO 05/95624中所描述的缺乏hdfA或hdfB基因的细胞。用于抑制本文所提供的方法中所用的宿主细胞中的NHR的化学抑制剂的实例可以是W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、味淋(mirin)、SCR7、AG14361或其组合，如阿拉斯SDM等人(2016)《非同源末端接合的化学抑制剂增加新型隐球菌中的靶向构筑体整合》，公共科学图书馆·综合11(9)中所描述。

在一个实施例中，通过本文所提供的方法和系统中产生的丝状真菌细胞的突变菌株具有停用或减少的非同源末端接合(NHEJ)路径并且在培养物(例如浸没培养物)中生长时具有酵母样非菌丝体形成表型。在浸没培养物中生长时的酵母样非菌丝体形成表型是由于一或多个如本文所提供展示在控制或影响真菌形态中起作用的基因(例如具有SEQ IDNO:5、6、7或8的基因)的破坏。一或多个如本文所提供展示在控制或影响真菌形态中起作用的基因可以是对渗透应激的宿主细胞渗透反应路径的一部分。所述突变菌株中的NHEJ路径可由于用化学抑制剂(例如W7、氯丙嗪、香草精、Nu7026、Nu7441、味淋、SCR7、AG14361或其任何组合)处理而减少或停用。在一个实施例中，所述化学抑制剂为W7。丝状真菌宿主细胞(例如黑曲霉)可以用最低抑制浓度(MIC)的W7(其可以是宿主菌株依赖性的)处理。所述一或多种突变菌株可随后用于产生所关注的所期望产物，例如表1中列出的产物中的任一个。

形态相关基因

本文所提供的方法、菌株和系统中使用的形态相关基因可以是所属领域中已知的已经展示或疑似在控制或影响丝状真核微生物(例如丝状真菌宿主细胞或菌株)的形态中起作用的任何基因。调节宿主细胞的形态的基因可以是如本文所提供的任何所述基因。在一个实施例中，在宿主细胞的形态中起作用或调节宿主细胞的形态的基因可以是作为管控所述宿主细胞对渗透应激的反应的宿主细胞路径的一部分的任何基因。因此，基因可以是来自丝状真菌宿主细胞的渗透反应路径的任何基因或所述基因的组合。在一个实施例中，所述基因为如表7中所示的来自酵母渗透反应路径的基因的直系同源物，例如酵母(例如酿酒酵母)Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因或其任何组合的直系同源物。酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因的核酸序列可选自SEQ ID NO:50-75。在一个实施例中，所述基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物。在一个实施例中，宿主细胞是曲霉(例如黑曲霉)，并且酿酒酵母SLN1基因的直系同源物可选自表6中列出的SLN1直系同源物或SEQ ID NO.76的核酸序列。在一个实施例中，酿酒酵母SLN1基因的黑曲霉直系同源物具有选自SEQ ID NO:14-17的核酸序列。在一个实施例中，酿酒酵母SLN1基因的黑曲霉直系同源物具有选自SEQ ID NO:76的核酸序列。在一个实施例中，宿主细胞是曲霉(例如黑曲霉)，并且所述基因为如在表7中列出的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。在一个实施例中，所述基因为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa/N.crassa)nik1的直系同源物。在一个实施例中，宿主细胞为曲霉(例如，黑曲霉)，且粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物可为表6中列出的nik1直系同源物。在一个实施例中，宿主细胞为曲霉(例如黑曲霉)且所述基因为曲霉nikA基因。在另一实施例中，形态相关基因可以是来自与粗糙脉孢菌nik1基因或曲霉nikA基因的直系同源物相同的路径的任何基因。在另一实施例中，所述基因为具有核酸SEQ ID NO:5或77的黑曲霉基因的直系同源物，和/或与具有核酸SEQ ID NO:5或77的黑曲霉基因的所述直系同源物相同的生物化学路径中的任何基因。在另一实施例中，所述基因为具有核酸SEQ ID NO:6或78的黑曲霉基因的直系同源物，和/或与具有核酸SEQ ID NO:6或78的黑曲霉基因的所述直系同源物相同的生物化学路径中的任何基因。在另一实施例中，所述基因为具有核酸SEQ IDNO:8或79的黑曲霉基因的直系同源物，和/或与具有核酸SEQ ID NO:8或79的黑曲霉基因的所述直系同源物相同的生物化学路径中的任何基因。在另一实施例中，所述宿主细胞为黑曲霉，且所述基因为具有核酸SEQ ID NO:5或77的黑曲霉基因，和/或与具有核酸SEQ IDNO:5或77的黑曲霉基因相同的生物化学路径中的任何基因。在另一实施例中，所述宿主细胞为黑曲霉，且所述基因为具有核酸SEQ ID NO:6或78的黑曲霉基因，和/或与具有核酸SEQID NO:6或78的黑曲霉基因相同的生物化学路径中的任何基因。在另一实施例中，所述宿主细胞为黑曲霉，且所述基因为具有核酸SEQ ID NO:8或79的黑曲霉基因，和/或与具有核酸SEQ ID NO:8或79的黑曲霉基因相同的生物化学路径中的任何基因。

表6.黑曲霉ATCC 1015中的酿酒酵母Sln1和粗糙脉孢菌nik1直系同源物

表7.渗透路径基因

本文所提供的方法、菌株和系统中使用的形态相关基因可以是所属领域中已知的已经展示或疑似在控制或影响黑曲霉的形态中起作用的任何基因。在一个实施例中，所述基因为具有选自SEQ ID NO:5、6、7或8的核酸序列的含有SNP的基因(参见表4)。在一个实施例中，所述基因为多个基因。所述多个基因可以是具有选自SEQ ID NO:5、6、7或8的核酸序列的含有SNP的基因的任何组合。所述多个基因可以是具有选自SEQ ID NO:5和任何存在于相同生物化学路径内的基因的核酸序列的含有SNP的基因的任何组合。所述多个基因可以是具有选自SEQ ID NO:6和任何存在于相同生物化学路径内的基因的核酸序列的含有SNP的基因的任何组合。所述多个基因可以是具有选自SEQ ID NO:7和任何存在于相同生物化学路径(即渗透反应路径)内的基因的核酸序列的含有SNP的基因的任何组合。所述多个基因可以是具有选自SEQ ID NO:8和任何存在于相同生物化学路径内的基因的核酸序列的含有SNP的基因的任何组合。在一个实施例中，所述基因为具有选自SEQ ID NO:5、6、7或8的核酸序列的基因(参见表4)的野生型或不含SNP的形式。在一个实施例中，所述基因为具有选自SEQ ID NO:76到79的核酸序列的基因的野生型或不含SNP的形式。

在一个实施例中，调节黑曲霉宿主细胞的形态的基因为酿酒酵母SLN1基因的黑曲霉直系同源物。酿酒酵母SLN1基因的黑曲霉直系同源物可为野生型形式或突变形式。酿酒酵母SLN1基因的黑曲霉直系同源物的突变形式可以是来自表3或4的FungiSNP_18或具有SEQ ID NO:7的核酸序列。在另一实施例中，形态相关基因可以是来自与酿酒酵母SLN1基因的黑曲霉直系同源物相同的路径(即，渗透反应路径)的任何基因。作为相同路径(即渗透反应路径)的一部分的基因可以选自酿酒酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因或其任何组合的黑曲霉直系同源物。酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22的核酸序列可选自SEQ ID NO:50-75。作为与酿酒酵母SLN1基因(或粗糙脉孢菌nik1基因)的黑曲霉直系同源物相同的路径(即渗透反应路径)的一部分的基因可具有选自SEQ ID NO:18到32的核酸序列。作为相同路径(即渗透反应路径)的一部分的基因可以选自由SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合表示的核酸序列。

形态相关基因可以是戴(Dai)等人(《通过使用抑制消减杂交在黑曲霉中鉴别与形态有关的基因(Identification of Genes Associated with Morphology inAspergillus niger by Using Suppression Subtractive Hybridization)》《应用和环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)》，2004年4月，第2474-2485页)所揭示的基因或其直系同源物中的任一种，所述文献内容以全文引用的方式并入本文中。形态相关基因可以选自gas1基因、sfb3基因、seb1基因、mpg1基因、crz1基因和tps2基因。形态相关基因中的任一种的表达可取决于基因是否促进丝状或菌丝体形态或球粒形态而增加或降低。

如本文所描述，本文所提供的形态相关基因或其突变体(例如来自表4的FungiSNP9、12、18或40)中的任一种的表达可以通过用赋予在不同于原生启动子的水平(例如更高或更低)下的表达的异源启动子置换基因的原生启动子来控制。所述异源启动子可以选自表2。原生启动子的置换可以使用如本文所提供的PRO交换方法进行。

启动子梯

启动子调节基因转录的速率且可以通过多种方式影响转录。举例来说，不论内部或外部细胞条件如何，组成性启动子都引导其相关基因以恒定速率转录，而可调节、可调谐或可诱导型启动子却取决于内部和/或外部细胞条件提高或降低基因转录的速率，所述条件例如生长速率、温度、对特定环境化学物质的反应等。启动子可以从其正常细胞情境中分离出来且经工程改造以调节几乎任何基因的表达，从而能够有效修改细胞生长、产物产量和/或所关注的其它表型。

启动子序列可以可操作地连接到本文所提供的待在如本文所提供的在丝状真菌宿主细胞中表达的任何序列(例如形态相关基因)的5'端。多种已知真菌启动子可能在本发明的宿主菌株中具有功能性，例如以下的启动子序列：C1内切葡聚糖酶、55kDa纤维二糖水解酶(CBH1)、甘油醛-3-磷酸去氢酶A、来自金孢霉属的卢氏金孢霉(C.lucknowense)GARG27K和30kDa木聚糖酶(Xy1F)启动子，以及例如以下中所描述的曲霉启动子：第4,935,349号；第5,198,345号；第5,252,726号；第5,705,358号；和第5,965,384号美国专利；以及WO93/07277PCT申请。

在一个实施例中，用于本文所提供的用于在特定生长条件(即浸没培养物)下产生包含所期望球粒形态的菌株或宿主细胞的方法和系统的启动子为诱导型启动子。诱导型启动子可以是转录活性通过存在或不存在化学物质(例如醇、四环素、类固醇、金属或所属领域中已知的其它化合物)来调节的任何启动子。诱导型启动子可以是转录活性由存在或不存在光或低温或高温调节的任何启动子。在一个实施例中，诱导型启动子选自丝状真菌基因，如srpB基因、amyB基因、manB基因或mbfA基因。在一个实施例中，诱导型启动子选自表2中列出的启动子。在一个实施例中，诱导型启动子是由葡萄糖抑制的分解代谢物。由葡萄糖抑制的分解代谢物可为来自米曲霉的amyB启动子。

在一些实施例中，本发明教示用于控制一或多个基因的表达的启动子梯的产生，所述基因控制丝状真菌生长和/或形态和/或在控制丝状真菌生长和/或形态中起作用。在一些实施例中，本发明的启动子梯包含展现连续表达谱范围的启动子集合。举例来说，在一些实施例中，通过鉴别回应于刺激而展现一系列表达强度的天然、原生或野生型启动子，或通过组成性表达(参见例如图2)来产生启动子梯。这些所鉴别的启动子可以作为启动子梯分组在一起。

在其它实施例中，本发明教示了启动子梯的产生，所述启动子梯跨越不同条件展示一定范围的表达谱。举例来说，在一些实施例中，本发明教示了启动子梯的产生，所述启动子梯具有遍布在发酵的不同阶段的表达峰。在其它实施例中，本发明教示了启动子梯的产生，所述启动子梯回应于特定刺激具有不同表达峰动力学(参见例如图2)。所属领域的技术人员将认识到，本发明的调节性启动子梯可以代表任何一或多种调节曲线。

在一些实施例中，本发明的启动子梯经设计以跨越反应的连续范围以可预测的方式干扰基因表达。在一些实施例中，启动子梯的连续性质赋予菌种选育程序额外的预测能力。举例来说，在一些实施例中，交换展示或怀疑控制或影响形态的基因的启动子可产生关于形态的宿主细胞性能曲线，其标识用于在所期望生长条件下产生具有所期望球粒形态的菌株或宿主细胞的特定基因的最优表达率或曲线；产生其中所靶向基因不再是特定反应或基因级联的限制因素的菌株，同时还避免了在不适当情形下的不必要过度表达或错误表达。在一些实施例中，启动子梯如下产生：鉴别展示所期望曲线的天然、原生或野生型启动子。在其它实施例中，通过使天然存在的启动子发生突变以衍生多种突变启动子序列来产生启动子梯。测试这些突变启动子中的每一种对靶基因表达和所得形态表型的作用。在一些实施例中，测试经编辑的启动子跨越多种条件的表达活性，以便记录/表征/注释每一启动子变异体的活性且存储于数据库中。随后将所得经编辑的启动子变异体组织成基于其表达强度而排列的启动子梯(例如其中高表达性变异体靠近顶部，且减弱的表达靠近底部，因此产生术语“梯”)。

在一些实施例中，本发明教示作为所鉴别的天然存在的启动子和突变的变异启动子的组合的启动子梯的产生和/或用途。

在一些实施例中，本发明教示了鉴别满足以下两个标准的天然、原生或野生型启动子的方法：1)表示组成性启动子梯；和2)可以由短DNA序列(理想地小于100个碱基对)编码。在一些实施例中，本发明的组成性启动子展示跨越两种所选生长条件的恒定基因表达(典型地在工业培养期间所经历的条件当中进行比较)。在一些实施例中，本发明的启动子将由约60个碱基对核心启动子和长度在26与40个碱基对之间的5'UTR组成。

在一些实施例中，选择前述所鉴别的天然存在的启动子序列中的一或多种进行基因编辑。在一些实施例中，通过上文所描述的任一种突变方法来编辑天然启动子。在其它实施例中，本发明的启动子是通过合成具有所期望序列的新颖启动子变异体来编辑。

表2中提供用于产生包含所期望球粒形态的菌株或宿主细胞的方法和系统的启动子的非穷尽性列表。启动子序列中的每一种可以称为异源启动子或异源启动子多核苷酸。

表2.本发明的所选启动子序列

在一些实施例中，本发明的启动子展示与来自上表的启动子至少100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％或75％的序列一致性。

启动子交换

在一些实施例中，本发明教示选择具有最优表达特性的启动子以产生对整体宿主菌株表型(例如，在所期望生长条件(即，在发酵培养基中的浸没培养物)下的非菌丝体球粒形态)的有益作用的方法。

举例来说，在一些实施例中，本发明教示了鉴别一或多种启动子和/或在宿主细胞内产生一或多种启动子的变异体的方法，所述启动子展现一系列表达强度(例如下文论述的启动子梯)或优良调节特性(例如针对所选基因的更严格调控)。这些所鉴别和/或产生的启动子的特定组合可以一起归类为启动子梯。

本文还提供用于基因工程改造丝状真菌细胞以产生或表达所期望性状(例如所期望球粒形态)的启动子交换方法。一般来说，启动子交换(即PRO交换)需要系统地使来自如所描述的启动子梯的每个启动子与所关注的给定基因相关联。因此，举例来说，如果具有启动子P

在一特定实施例中，本文所提供的启动子交换(PRO交换)方法需要使来自表2中所描绘的启动子梯的每个启动子与展示出或疑似在特定条件下生长时发挥作用或影响丝状真菌细胞的形态的基因(称为靶形态基因)系统地关联。基因的扰动可引起所期望形态表型。当在生产培养基(例如，CAP培养基)的浸没培养物中生长时，所期望表型可以是非菌丝体球粒形态。因此，如果具有启动子P

此外，可利用包含启动子P

四种启动子和10种靶基因的前述实例仅是说明性的，这是因为所述概念可以伴随基于一系列表达强度的展现而已经分组在一起的任何给定数目的启动子和任何给定数目的靶形态基因应用。所属领域的技术人员还将认识到能够将两个或更多个启动子可操作地连接到任何基因标靶之前。因此，在一些实施例中，本发明教示了启动子交换库，其中来自启动子梯的1、2、3或更多个启动子可操作地连接到一或多个基因。

综上所述，利用各种启动子来驱动生物体中的各种基因的表达是最优化所关注的性状(例如，浸没培养条件下的球粒形态)的强大工具。如本文所描述的启动子交换的分子工具使用已经展现在至少一种条件(例如在CAP培养基中的浸没培养物)下改变至少一个基因座(例如，FungiSNP_9、FungiSNP_12、FungiSNP_18或FungiSNP_40)的表达的启动子序列梯(例如表2)。接着使用高通量基因组工程改造将这种梯系统地应用到生物体中的一组基因(例如，与本文所提供的FungiSNP_18相同的路径内)。基于多种方法中的任一种方法，确定这组基因影响所关注性状的可能性较高。这些方法可包括基于已知功能或对所关注性状(即，形态)的影响而进行的选择，或基于先前测定的有益基因多样性而进行的算法选择。在一些实施例中，基因的选择可包括指定宿主中的所有形态基因。在其它实施例中，基因的选择可以是随机选择或基于已知或疑似的路径功能特定选择的给定宿主中的所有形态基因的子集。

接着评估含有连接到形态基因的启动子序列的生物体的所得HTP基因设计微生物菌株库在高通量筛选模型中的性能，并且确定引起性能提高的启动子-基因键和存储于数据库中的信息。基因扰动的集合(即，给定启动子x可操作地连接到给定基因y)形成“启动子交换库”，其可以用作微生物工程改造处理中所用的潜在遗传变异的来源。随着时间推移，当针对宿主细胞背景的更大多样性实施基因扰动的更大集合时，每个库作为实验上被证实的数据的主体而变得更强大，其可用于针对所关注的任何背景更精确地且可预测地设计出靶向变化。

生物体中的基因转录水平是影响生物体行为的控制关键点。转录与翻译(蛋白质表达)紧密关联，并且哪种蛋白质以什么数量表达决定了生物体行为。细胞表达数千种不同类型的蛋白质，并且这些蛋白质以多种复杂的方式发生相互作用以产生功能。通过系统性地改变蛋白质集合的表现量，可以使功能改变，由于复杂性，因此难以预测功能改变的方式。有些变异可以增强性能且因此与用于评估性能的机制关联，这项技术能够产生功能改良的生物体。

在一些实施例中，本发明的启动子交换工具用于鉴别所选形态基因标靶的最优表达。在一些实施例中，启动子交换的目标可以是增加靶形态基因的表达，以减少代谢或基因路径中的瓶颈。在其它实施例中，启动子交换的目标可以是减少靶形态基因的表达，以在并不需要所述靶形态基因的表达时，避免宿主细胞中不必要的能量消耗。

在其它细胞系统(如转录、转运或信号传导)的情形下，可以使用各种合理方法先验地尝试且找出哪种蛋白质是表达变化的标靶和那种变化应该是什么变化。这些合理方法减少了扰动数目，所述扰动必须加以测试以发现改良性能的扰动，但是这样做的成本相当大。基因缺失研究鉴别出其存在对特定功能至关重要的蛋白质，且接着可以过度表达重要基因。由于蛋白质相互作用的复杂性，因此这对于增强性能而言通常是低效的。已经开发出不同类型的模型，其试图利用第一原理描述转录或信号传导行为与细胞中的蛋白质含量的关系。这些模型通常表明其中表达变化的标靶可以产生不同或改良的功能。这些模型所基于的假设过分简单化并且参数难以测量，因此其所产生的预测通常是不正确的，尤其对于非模型生物体来说。在基因缺失与建模的情况下，确定如何影响某种基因所需的实验不同于产生使性能改良的变化的后续工作。启动子交换避开了这些挑战，原因是突显了特定扰动的重要性的所构筑菌株也已经是改良的菌株。

在特定实施例中，用于产生包含所期望球粒形态的丝状真菌菌株或宿主细胞的启动子交换为包含以下的多步工艺：

1.选择一组“x”个启动子充当“梯”。理想的是，这些启动子已经展示引起跨越多个基因组基因座的高度可变表达，但唯一的要求是以某种方式干扰基因表达。在一个实施例中，充当梯的一组“x”个启动子包含表2中的启动子。

2.针对标靶选择一组“n”基因。此组可为基因组中的每一开放阅读框架(ORF)，或展示在控制或影响形态中起作用的ORF子集。可以使用与功能相关ORF的注释、根据与先前证实的有益扰动的关系(先前启动子交换或先前SNP交换)、通过基于先前所产生的扰动之间的上位相互作用而进行的算法选择、基于与针对标靶的有益ORF有关的假设的其它选择标准，或通过随机选择来选择子集。在一个实施例中，一组“n”基因可以是酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物(例如表6中列出的黑曲霉直系同源物)和/或作为相同路径的一部分的一或多个基因的直系同源物(例如表7中列出的渗透反应路径基因)。酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物(例如表6中列出的黑曲霉直系同源物)和/或作为相同路径的一部分的一或多个基因的直系同源物(例如表7中列出的渗透反应路径基因)可以是野生型的，是所述基因的突变形式。在一个实施例中，所述丝状真菌菌株或宿主细胞为黑曲霉，且所选择的一组“n”基因为见于表3或表4中的含有SNP的基因。在黑曲霉为宿主细胞的另一实施例中，所选择的一组“n”基因为见于表3或表4中的含有SNP的基因的非SNP或野生型形式。当黑曲霉为宿主细胞时，除作为相同路径的一部分的一或多个基因以外，一组“n”基因可为见于表3和4中的FungiSNP_9的基因。当黑曲霉为宿主细胞时，除作为相同路径的一部分的一或多个基因以外，一组“n”基因可为见于表3和4中的FungiSNP_12的基因。当黑曲霉为宿主细胞时，除作为相同路径的一部分的一或多个基因以外，一组“n”基因可为见于表3和4中的FungiSNP_40的基因。在另一实施例中，当黑曲霉为宿主细胞时，除作为相同路径的一部分的一或多个基因(例如表7中列出的黑曲霉渗透反应路径基因)以外，一组“n”基因可为来自表3和4中的FungiSNP_18(即，酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的突变形式)的基因。酿酒酵母SLN1基因(或粗糙脉孢菌nik1基因)和/或在相同路径中的一或多个基因的黑曲霉直系同源物可为基因(例如表7中列出的黑曲霉渗透反应路径基因)的野生型或突变形式。酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的突变形式可为具有SEQ ID NO:7的形式。路径中的一或多个基因可以是酵母(例如酿酒酵母)Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22基因或其任何组合的黑曲霉直系同源物。酵母Ypd1、Skn7、Ssk1、Ste11、Bck1、Ste7、Mkk2/22、Pbs2、Fus1/Kss3、Mpk1、Hog1、Phk1/2、Chk1、Phk3、Spy1、Mcs4、SskA、Prr1、Rim15、Cek1、Rim15和Ssk2/22的核酸序列可选自SEQ ID NO:50-75。作为相同路径的一部分的一或多个基因可以选自由SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合表示的核酸序列。

3.快速且在一些实施例中并行执行以下基因修饰的高通量菌株工程改造：当原生启动子存在于形态靶基因n的前方并且其序列为已知的时，用梯(例如见于表2中的启动子梯)中的x启动子中的每一个置换原生启动子。当原生启动子不存在或其序列未知时，将梯中的x启动子中的每一个插入基因n之前(参见例如图1)。以这种方式构筑形态表型菌株“库”(也称为HTP基因设计库)，其中库的每个成员为可操作地连接到n形态靶基因的x启动子在其它方面一致的基因背景下的例子。如此前所述，可以插入启动子组合，从而在构筑库时扩大组合可能性的范围。

4.在针对一或多种度量标准的菌株性能指示所优化的性能的背景下，高通量筛选菌株库。所述背景可为在浸没培养物中在培养基中生长以得到所关注的所期望产物，例如在CAP培养基中生长以产生柠檬酸。

尤其可以扩展此基本工艺以提供菌株性能的进一步改良：(1)将多个有益扰动合并到单一菌株背景中，以互动式工艺一次一个进行；或作为多个变化在单一步骤中进行。多个扰动可以是一组特定的定义变化或部分随机化的变化组合库。举例来说，如果标靶集是路径中的每个基因，那么使扰动库依序再生到先前菌株库的一或多个改良成员中可优化路径中的每个基因的表达量，而不论哪种基因在任一次给定迭代时是速率限制的；(2)将由库的个别和组合世代所得到的性能数据馈送到算法中，所述算法使用所述数据基于每个扰动的相互作用来预测最优的扰动集合；以及(3)实施上述两种方法的组合。

上文所论述的分子工具或技术表征为启动子交换，但不限于启动子并且可以包括系统地改变一组标靶的表达量的其它序列变化。用于改变一组基因的表达量的其它方法可以包括：a)核糖体结合位点梯(或真核生物中的Kozak序列)；b)用其它起始密码子中的每一种置换每个标靶的起始密码子(例如，下文论述的起始/终止密码子交换)；c)使各种mRNA稳定化或去稳定化序列连接到转录物的5'或3'端或任何其它位置；d)使各种蛋白质稳定化或去稳定化序列在蛋白质中的任何位置连接。

所述方法举工业微生物体为例说明于本发明中，但适用于可在基因突变体群体中鉴别出所期望性状的任何生物体。举例来说，这可以用于改良CHO细胞、酵母、昆虫细胞、藻类以及多细胞生物体(如植物)的性能。

SNP交换

在一个实施例中，本文所提供的方法和系统用于SNP交换，以便产生包含具有个别SNP或SNP组合的丝状真菌的丝状真菌库。SNP交换不是改进微生物菌株的随机诱变方法，而是涉及系统性引入或去除跨越菌株的个别小核多态性核苷酸突变(即SNP)(因此称为“SNP交换”)。SNP或组合SNP可以各自处于已经展示或疑似控制或影响丝状真菌形态的基因中。

通过此方法进行工程改造的所得微生物形成HTP形态基因设计库。HTP基因设计库可以指通过此方法形成的真实实体微生物菌株集合，其中每个成员菌株代表了所指定SNP在原本相同遗传背景下的存在或不存在，所述库称为“SNP交换微生物菌株库”。在丝状真菌(例如黑曲霉)的特定背景下，库可以称为“SNP交换丝状真菌菌株库”或“SNP交换黑曲霉菌株库”，但是可以同义地使用术语，因为丝状真菌是微生物或多核体生物体的特定实例。

此外，HTP基因设计库可以指基因干扰的集合，在此情况下，指定的SNP存在或指定的SNP不存在，所述集合称为“SNP交换库”。用于本文所提供的方法的SNP交换库可以是表3或表4的SNP库。

表3.含有可能参与黑曲霉中柠檬酸生产的基因的SNP。

表4.表3中含有SNP的基因的亚组的基因描述/推测功能，其中SNP位于编码域内。

在一些实施例中，SNP交换涉及重新构筑具有目标SNP“构建区块”与已鉴别的有益性能作用的最佳组合的宿主生物体。在一个实施例中，SNP交换需要重构具有形态靶基因的最佳组合的丝状真菌宿主细胞(例如黑曲霉)，所述形态靶基因具有所定义的培养条件(例如浸没式培养物)中真菌形态的所鉴别的有益作用。因此，在一些实施例中，SNP交换涉及将多个有益突变合并到单一菌株背景中，以迭代过程一次一个进行；或作为多个变化在单个步骤中进行。多个变化可以是一组特定的成分确定的变化或突变的部分随机化的组合库。

在其它实施例中，SNP交换还涉及从菌株中去除鉴别为有害的多个突变，以迭代过程一次一个进行；或作为多个变化在单个步骤中进行。在一个实施例中，SNP交换涉及去除形态靶基因中的多个突变，所述多个突变被鉴别为对形成所需形态(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)的菌株是不利的。多个变化可以是一组特定的成分确定的变化或突变的部分随机化的组合库。在一些实施例中，本发明的SNP交换方法包括添加有益SNP和去除不利的和/或中性突变。

SNP交换是鉴别和利用菌株谱系中的有益突变和不利的突变的有力工具，所述菌株谱系经历诱变和选择以获得改进的目标性状(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)。SNP交换是利用高通量基因组工程技术系统地确定诱变谱系中的个别突变的影响。确定跨具有已知性能改进的诱变谱系中的一或多代的菌株的基因组序列。接着使用高通量基因组工程系统地重现早期谱系菌株中已改良的菌株的突变，和/或使后期菌株中的突变恢复为早期菌株序列。然后评估这些菌株的性能，并且可以确定每个个别突变对所关注的改良表型(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)的影响。如前所述，对此方法所得的微生物菌株进行分析/表征且形成SNP交换基因设计库的基础，所述库可以告知微生物菌株跨宿主菌株的改良。

不利突变的去除可以提供直接的性能改进，并且在未经受诱变负荷的菌株背景中合并有益突变可以快速且极大地改进菌株性能。经由SNP交换方法所产生的各种微生物菌株形成了HTP基因设计SNP交换库，其是包含各种所添加/缺失/或合并SNP的微生物菌株，但具有原本相同的遗传背景。

如先前所论述，供性能改进用的随机诱变和后续筛选是一种用于工业菌株改良的常用技术，并且当前用于大规模制造的许多菌株已经使用此方法在多年，有时数十年内反复开发。产生基因组突变(如暴露于UV辐射或化学诱变剂(如甲磺酸乙酯))的随机方法是用于工业菌株改良的优选方法，原因是：1)工业生物体可能在遗传或代谢上具有不良的特征，使得定向改进方法的目标选择变得困难或不可能；2)即使在表征相对良好的系统中，也难以预测引起工业性能改进的变化且可能需要扰动无已知功能的基因；以及3)在指定工业生物体中产生定向基因组突变的遗传工具可能无法获得或非常缓慢和/或难以使用。

然而，尽管此方法存在前述益处，但也存在许多已知的缺点。有益突变是相对罕见的事件，并且为了在固定的筛选能力下发现这些突变，突变率必须足够的高。这通常引起非所需的中性突变和部分不利的突变连同有益变化一起并入菌株中。随着时间推移，此‘诱变负荷’积累，产生在总体稳定性和关键性状如生长速率上具有缺陷的菌株。最终，‘诱变负荷’性能越来越难以或不可能通过随机诱变获得进一步改进。在没有合适的工具的情况下，不可能将菌株谱系的离散和并联分支中所发现的有益突变合并。

SNP交换是一种克服这些限制的方法，其通过系统地重现或恢复当比较诱变谱系内的菌株时所观测到的一些或所有突变来实现。以此方式，可以鉴别和合并有益(‘致病’)突变，和/或可以鉴别和去除不利的突变。此允许快速改进无法通过进一步随机诱变或靶向基因工程实现的菌株性能。

去除基因负荷或将有益变化合并到无基因负荷的菌株中还向能够实现进一步改进的额外随机诱变提供新颖、稳固的起点。

另外，因为跨突变诱发菌株谱系的各种离散分支鉴别了正交有益变化，因此能够将其快速地合并到性能更佳的菌株中。还可以将这些突变合并到不是诱变谱系一部分的菌株中，如通过定向基因工程获得改良的菌株。

存在将诱变谱系内的菌株之间的突变随机重组的其它方法和技术。这些包括促进跨突变型菌株的基因组重组的技术，如原生质体融合和全基因组改组。对于一些工业微生物(如酵母和丝状真菌)来说，还可以利用天然配对循环进行成对基因组重组。以此方式，可以通过与亲本菌株产生‘回交’突变体且合并有益突变来去除不利的突变。然而，这些方法受到使用本发明的SNP交换方法规避的许多限制。

例如，因为这些方法依赖于相对较少数目的随机重组交叉事件来交换突变，因此可能采取许多循环的重组和筛选来优化菌株性能。另外，虽然天然重组事件基本上是随机的，但是其也受基因组位置偏差的影响且一些突变可能难以解决。在不使用额外基因组测序和分析的情况下，这些方法也几乎没有提供关于个别突变的影响的信息。SNP交换克服了这些基本限制，因为其不是随机方法，而是系统性地引入或去除整个菌株中的个别突变。

在一些实施例中，本发明的SNP交换方法包含以下步骤：将在突变型菌株中鉴别的一或多个SNP引入参考菌株或野生型菌株(“向上波动”)。此步骤可以进行以便确定特定SNP和/或含有所述特定SNP的基因是否对显示所需性状(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)的菌株有贡献。

在其它实施例中，本发明的SNP交换方法包含将在突变型菌株(“向下波动”)中所鉴别的一或多个SNP去除的步骤。此步骤可以进行以便确定特定SNP和/或含有所述特定SNP的基因是否对显示所需性状(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)的菌株有贡献。

在一些实施例中，在本发明的一或多个准则(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)下培养和分析包含一或多个SNP变化(引入或去除)的每一所产生的菌株。来自每种所分析宿主菌株的数据与存在于宿主菌株中的特定SNP或SNP群组关联或相关，且记录下来供未来使用。因此，本发明能够创建大量且高度注释的HTP基因设计微生物菌株库，其能够鉴别给定SNP对任何数目的目标微生物遗传或表型性状(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)的影响。储存于这些HTP基因设计库中的信息告知HTP基因组工程平台的机器学习算法，并且引导所述程序的未来迭代，最终导致具有高度所需特性/性状的进化微生物。

在另一个实施例中，使包含丝状真菌细胞的菌株的HTP基因设计微生物菌株库与如本文所提供的遗传控制元件库进行交换方法，所述丝状真菌细胞的菌株包含使用本文所提供的SNP交换方法产生的形态靶基因的一或多个SNP。遗传控制元件可以是启动子或终止子。启动子或终止子可以是启动子或终止子库的一部分。在一个实施例中，使包含丝状真菌细胞的菌株的HTP基因设计微生物菌株库经历本文所提供的使用启动子库的启动子交换方法，所述丝状真菌细胞的菌株包含使用本文所提供的SNP交换方法产生的形态靶基因的一或多个SNP。启动子库可以是表2的启动子库。此外，对于此实施例，对包含丝状真菌细胞的菌株的HTP基因设计微生物菌株库进行的启动子交换方法产生新的HTP基因设计微生物菌株库，所述丝状真菌细胞的菌株包含使用本文所提供的SNP交换方法产生的形态靶基因的一或多个SNP，所述新的HTP基因设计微生物菌株库可以针对所需性状(例如，在生产培养基的浸没式培养物中的球粒形态)的表达来筛选。

原生质体产生方法

在一个实施例中，本文所提供的产生具有所需球粒形态的丝状真菌宿主细胞或菌株的方法和系统需要由丝状真菌细胞产生原生质体。适用于制备原生质体的程序可以是所述领域中已知的任何程序，包括(例如)EP 238,023和耶尔顿(Yelton)等人(1984，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》81：1470-1474)中所描述的那些程序。在一个实施例中，原生质体是通过使用一或多种裂解酶或其混合物处理丝状真菌细胞培养物来产生。裂解酶可以是β-葡聚糖酶和/或聚半乳糖醛酸酶。在一个实施例中，用于产生原生质体的酶混合物是VinoTaste浓缩物。许多用于预培养多核体生物体(例如丝状真菌细胞)的培养物并随后产生和利用其原生质体以用于本文所提供的的方法和组合物的参数可以不同。例如，可以改变接种物大小、接种方法、预培养培养基、预培养时间、预培养温度、混合条件、洗涤缓冲液组成、稀释比率、裂解酶处理期间的缓冲液组成、所用裂解酶的类型和/或浓度、与裂解酶一起培育的时间、原生质体洗涤程序和/或缓冲液、原生质体和/或聚核苷酸和/或转化试剂在实际转化期间的浓度、转化期间的物理参数、转化至所得转化体之后的程序。在一些情况下，可以利用这些变化来优化原生质体的数目和转化效率。在一个实施例中，多核体生物体是如本文所提供的丝状真菌细胞(例如黑曲霉)。此外，对于此实施例，预培养培养基可以是YPD或完整培养基。预培养培养基的体积可以是至少、至多或约50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、650ml、700ml、750ml、800ml、850ml、900ml、950ml或1000ml。预培养培养基的体积可以是约50ml至约100ml、约100ml至约150ml、约150ml至约200ml、约200ml至约250ml、约250ml至约300ml、约300ml至约350ml、约350ml至约400ml、约400ml至约450ml、约450ml至约500ml、约500ml至约550ml、约550ml至约600ml、约600ml至约650ml、约650ml至约700ml、约700ml至约750ml、约750ml至约800ml、约800ml至约850ml、约850ml至约900ml、约900ml至约950ml或约950ml至约1000ml。在一些情况下，培养多个培养物并且随后进行原生质体产生。所述多个培养物可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、300、400、500或更多。在一个实施例中，通过用10

在如上文所描述的分离之后，多核体生物体(例如丝状真菌细胞，如黑曲霉)可以再悬浮于原生质体产生缓冲液中，以使得原生质体产生缓冲液包含一个或如本文所提供的用于产生原生质体的酶(例如，VinoTaste pro浓缩物(诺维信))。在一个实施例中，原生质体产生缓冲液具有高浓度的渗透质(例如大于或等于1M的渗透质，如MgSO

在一个实施例中，向所提供的原生质体产生缓冲液中添加NHEJ路径的一或多种化学抑制剂。所述一或多种化学抑制剂可以选自W7、氯丙嗪、香兰素、Nu7026、Nu7441、味淋、SCR7、AG14361或其任何组合。将一或多种化学抑制剂添加到原生质体产生缓冲液可以在原生质体产生程序期间的任何时间点进行。在一个实施例中，用一或多种化学抑制剂处理的持续时间贯穿整个原生质体产生程序。在单独实施例中，用一或多种化学抑制剂处理的持续时间短于整个原生质体产生程序。用一或多种化学抑制剂处理可以持续约1、5、10、15、20、30、45、60、90、120、150、180、210、240、270或300分钟。在一个实施例中，用W-7处理多核体细胞(例如丝状真菌细胞)。在另一实施例中，用SCR-7处理多核体细胞(例如丝状真菌细胞)。

在酶处理之后，可以使用所属领域中已知的方法分离原生质体。在原生质体分离之前，可以通过经由多孔障壁(如神奇滤布)过滤混合物来去除未消化的菌丝片段，在所述多孔障壁中，孔大小在20-100微米范围内，以便产生经过滤的原生质体的滤液。在一个实施例中，接着将经过滤的原生质体在适度水平的向心力下离心，以使得原生质体在离心管的底部形成球粒。向心力可为约500-1500×g。在优选实施例中，所使用的向心力一般低于1000×g(例如，800×g持续5分钟)。在单独实施例中，在包含高浓度渗透质的原生质体产生缓冲液中产生原生质体之后，将具有基本上较低渗透强度的缓冲液平缓地施加到原生质体(例如，经过滤的原生质体)的表面。基本上渗透强度较低的缓冲液的实例包括包含1M山梨醇、1M NaCl、0.6M硫酸铵或1M KCl的缓冲液(例如Tris缓冲液)。在一个实施例中，本文所提供的方法中使用的渗透强度较低的缓冲液为包含0.4M山梨醇并且pH值为8的山梨醇-Tris(ST)缓冲液。接着可以将此分层制剂离心，这可以致使原生质体累积在管中的一层处，在所述层中它们是中性漂浮的。随后可以将原生质体从此层分离以用于进一步处理(例如储存和/或转化)。在又一实施例中，将在包含高浓度渗透质(例如，100mM包含1.2M MgSO

在原生质体分离之后，剩余的含有酶的缓冲液可以通过将原生质体再悬浮于渗透缓冲液(例如使用10mM TRIS缓冲的1M山梨醇，pH为8)中并且通过离心再收集来去除。此步骤可重复。在充分去除含有酶的缓冲液之后，可以在也含有氯化钙的渗透稳定的缓冲液(例如使用10mM TRIS缓冲的1M山梨醇，pH为8，50mM CaCl

在分离和洗涤之后，可以将原生质体再悬浮于渗透稳定的缓冲液中。此类缓冲液的组成可以根据菌种、应用和需要而改变。然而，这些缓冲液典型地含有0.5与2M之间的有机组分，如蔗糖、柠檬酸盐、甘露醇或山梨醇。更优选0.75与1.5M之间；最优选为1M。否则，这些缓冲液含有浓度在0.1与1.5M之间的无机渗透稳定的组分，如KCl、(NH

在一个实施例中，在产生和后续分离及洗涤之后，将原生质体与一或多种低温保护剂混合。低温保护剂可以是二醇、二甲亚砜(DMSO)、多元醇、糖、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素、C连接的防冻糖蛋白(C-AFGP)或其组合。在本文所提供的方法和系统中用作低温保护剂的二醇可以选自乙二醇、丙二醇、聚丙二醇(PEG)、甘油或其组合。在本文所提供的方法和系统中用作低温保护剂的多元醇可以选自丙-1,2-二醇、丙-1,3-二醇、1,1,1-三-(羟基甲基)乙烷(THME)和2-乙基-2-(羟基甲基)-丙-1,3-二醇(EHMP)或其组合。在本文所提供的方法和系统中用作低温保护剂的糖可以选自海藻糖、蔗糖、葡萄糖、棉子糖、右旋糖或其组合。在一个实施例中，将原生质体与DMSO混合。DMSO可以按至少、至多、小于、大于、等于或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％w/v或v/v的最终浓度与原生质体混合。可以在储存前将原生质体/低温保护剂(例如DMSO)混合物分布到微量滴定板中。可以将原生质体/低温保护剂(例如DMSO)混合物在本文所提供的任何温度(例如-20℃或-80℃)下储存如本文所提供的长期储存时间(例如数小时、数日、数周、数月、数年)。在一个实施例中，将额外的低温保护剂(例如PEG)添加到原生质体/DMSO混合物中。在又一实施例中，在储存之前将额外的低温保护剂(例如PEG)添加到原生质体/DMSO混合物中。PEG可以是本文所提供的任何PEG且可以以如本文所提供的任何浓度(例如w/v或v/v)添加。在一个实施例中，PEG溶液以在STC缓冲液中的40％w/v来制备。接着可将此40％PEG-STC的20％v/v添加到原生质体中。举例来说，800微升1.25×10

本文所提供的任何预培养、培养和/或原生质体产生协议可以以高通量方式进行。例如，预培养、培养和原生质体可以作为工作流程的一部分来进行，使得所述工作流程表示如2017年6月6日提交的62/515,907中所描述的高通量(HTP)协议的一部分。对于任何和/或所有步骤，高通量协议可以利用自动化液体处理。

转化方法

在一些实施例中，本发明的载体或构筑体可使用多种技术中的任一种引入到宿主细胞(例如，由其衍生的丝状真菌细胞或原生质体)中，所述技术包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti介导的基因转移(参见克里斯蒂,P.J.(Christie,P.J.)和戈登,J.E.(Gordon,J.E.),2014《农杆菌Ti质粒(The Agrobacterium Ti Plasmids)MicrobiolSPectr》2014；2(6)；10.1128)。特定方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔(戴维斯,L.(Davis,L.)、迪布纳,M.(Dibner,M.)、巴特,I.(Battey,I.)，1986《分子生物学中的基本方法(Methods in Molecular Biology)》)。其它转化方法包括(例如)乙酸锂转化和电穿孔，参见例如杰兹(Gietz)等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》27：69-74(1992)；伊藤(Ito)等人，《细菌学杂志(J.Bacterol.)》153：163-168(1983)；以及贝克尔(Becker)和加伦特(Guarente)，《酶学方法(Methods in Enzymology)》194：182-187(1991)。在一些实施例中，转化的宿主细胞称为重组宿主菌株。

在一些实施例中，本发明教示使用96孔板机器人平台和液体处置机(如2017年6月6日提交的62/515,907中所描述的机器)的细胞的高通量转化。

在一个实施例中，本文所提供的方法和系统需要将核酸(例如异源启动子-目标形态基因融合或SNP，如来自表3或表4)转移到衍生自如本文所描述的丝状真菌细胞的原生质体。在另一实施例中，本文所提供的方法和系统中所利用的转化本质上是高通量的和/或如本文所描述是部分或完全自动化的。部分或完全自动化的方法可能需要使用如本文所提供的自动化液体处理一或多种液体处理步骤。进一步对于此实施例，通过将如本文所描述的构筑体或表达构筑体添加到微量滴定板的孔中，随后将通过本文所提供的方法产生的原生质体等分到微量滴定板的每个孔中来进行转化。适用于原生质体的转化/转染的程序可以是所属领域中已知的任何程序，包括例如以下文献中所述的那些程序：国际专利申请PCT/NL99/00618、PCT/EP99/202516；芬科斯坦(Finkelstein)和波耳(Ball)(编)，《丝状真菌的生物技术(Biotechnology of filamentous fungi)》、《技术和产物(technology andproducts)》，巴特沃斯-海涅曼(Butterworth-Heinemann)(1992)、班尼特(Bennett)和那苏尔(Lasure)(编)《对真菌的更多基因操控(More Gene Manipulations in fungi)》，学术出版社(Academic Press)(1991)，特纳(Turner)，于：普勒(Puhler)(编)，《生物技术(Biotechnology)》，第二完整修订版，VHC(1992)；如EP635574B中所描述的原生质体融合以及Ca-PEG介导的原生质体转化。或者，丝状真菌宿主细胞或来源于其的原生质体的转化还能够利用以下方式执行：电穿孔，例如查克拉波提(Chakraborty)和卡普尔(Kapoor)，《核酸研究》18：6737(1990)中所述的电穿孔；《根癌农杆菌介导的转化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation)》、《DNA的基因枪引入(biolistic introductionof DNA)》，例如如克里斯丁森(Christiansen)等人，《当代遗传学(Curr.Genet.)》29：100102(1995)；杜兰德(Durand)等人，《当代遗传学》31：158 161(1997)；和巴塞罗斯(Barcellos)等人，《加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)》44：1137 1141(1998)中所描述；或《细胞的“磁敏-基因枪”转染(“magneto-biolistic”transfection of cells)》，例如美国专利第5,516,670号和第5,753,477号中所描述。在一个实施例中，本文所提供的方法和系统中所用的转化程序是可修正成如本文所提供的高通量和/或自动化的一种转化程序，例如PEG介导的转化。

使用本文所描述的方法产生的原生质体的转化可以通过使用所属领域中已知的任何转化试剂来促进。合适的转化试剂可以选自聚乙二醇(PEG)、

选定序列的环出

在一些实施例中，本发明教示了将DNA的选定区域从宿主生物体中环出的方法。环出方法可以如中岛(Nakashima)等人，2014《通过基因组编辑和基因静默进行的细菌细胞工程改造(Bacterial Cellular Engineering by Genome Editing and Gene Silencing)》，国际分子科学杂志(Int.J.Mol.Sci.)15(2)，2773-2793中所描述。在一些实施例中，本发明教示从正转化体环出选择标记物。环出缺失技术在所属领域中已知，并且描述于(替尔(Tear)等人，2014“不稳定人工基因特异性反向重复序列的切除介导大肠杆菌中的无痕基因缺失(Excision of Unstable Artificial Gene-Specific inverted RepeatsMediates Scar-Free Gene Deletions in Escherichia coli)”，应用生物化学和生物技术(Appl.Biochem.Biotech)175：1858-1867)中。本文所提供的方法中所使用的环出方法可以使用单一交叉同源重组或双重交叉同源重组进行。在一个实施例中，如本文所描述的选定区域的环出可能需要使用如本文所描述的单一交叉同源重组。

第一，将环出构筑体插入宿主生物体基因组内的选定目标区域中(例如经由同源重组、CRISPR或其它基因编辑技术)。在一个实施例中，在一或多个构筑体和宿主细胞基因组之间使用双重交叉同源重组，以便整合一或多个构筑体，如图6所描绘。所插入的一或多个构筑体可以设计成具有这样的序列：所述序列是现有或引入的邻近宿主序列的直接重复序列的序列，以使得所述直接重复序列侧接预定环出和缺失的DNA区域。在一个实施例中，用于环出方法的构筑体包含基因的突变形式，所述突变形式展示出或疑似在控制或影响形态中起作用且在侧接可选标记基因(例如图6中的pyrG基因)的直接重复序列之间分裂。在另一实施例中，用于环出方法的构筑体包含基因，所述基因展示出或疑似在控制或影响形态中起作用且可操作地连接于在侧接可选标记基因(例如图6中的pyrG基因)的直接重复序列之间分裂的异源启动子。在又一实施例中，用于环出方法的构筑体包含基因的突变形式，所述突变形式展示出或疑似在控制或影响形态中起作用且可操作地连接于在侧接可选标记基因(例如图6中的pyrG基因)的直接重复序列之间分裂的异源启动子。在实施例中的每一个中，如图6所示，直接重复序列可以通过促进所述序列整合到宿主细胞基因组中的特定基因座(例如，展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的基因的基因座)中的序列来侧接。展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的基因可以是本文所提供的任何此类基因，例如，酿酒酵母SLN1基因、粗糙脉孢菌nik1基因或其直系同源物(例如酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物)。在一个实施例中，SLN1/nik1基因或其直系同源物可以包含基因干扰。基因干扰可以是突变，例如单核苷酸多态性(SNP)。在一个实施例中，此基因的突变形式可以是具有FungiSNP_18(即，SEQ ID NO:7)的核酸序列的酿酒酵母或粗糙脉孢菌基因的黑曲霉直系同源物。在另一实施例中，展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的基因或多个基因中的每一个可以是来自丝状真菌宿主细胞的渗透反应路径的任何基因或多个基因，如来自表7中所列出的酵母渗透反应路径的一或多个基因的一或多个直系同源物。展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的基因的其它实例可以是具有SEQ ID NO:5、6或8的核酸序列(例如核酸SEQ ID NO.77、78或79)的黑曲霉基因的野生型形式或其直系同源物。异源启动子可以是本文所提供的任何启动子。在一个实施例中，异源启动子选自表2。一旦插入，就可以对含有环出的一或多个构筑体的细胞进行反向选择以用于缺失选择区(例如，参见图7；缺乏对可选标记基因的抗性)。

所属领域中的技术人员将认识到，环出程序的描述仅表示用于从基因组缺失非所需区域的一种说明性方法。实际上本发明的方法与用于缺失基因组的任何方法兼容，包括但不限于经由CRISPR、TALENS、FOK或其它核酸内切酶进行的基因编辑。所属领域的技术人员还将认识到能够经由同源重组技术替换基因组的非所需区域。

用于转化的构筑体

在一个实施例中，本文所提供的方法和系统需要用至少一种核酸转化或转染丝状真菌细胞或由其衍生的原生质体。转化或转染可以使用本文所描述的方法和试剂。可以使用本文所提供的方法中的任一种进行原生质体的产生。如本文所提供，原生质体产生和/或转化可以是高通量和/或自动化的。核酸可以是DNA、RNA或cDNA。核酸可以是聚核苷酸。用于使用本文所提供的方法和系统转化丝状真菌细胞或由其衍生的原生质体的核酸或聚核苷酸可以是相对于变异体菌株和/或亲本菌株的内源基因或异源基因。内源基因或异源基因可以包含突变和/或处于一或多个遗传控制或调节元件的控制下或可操作地连接到一或多个遗传控制或调节元件。如本文所提供，内源基因或异源基因可以编码已经展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的蛋白质。例如，所述基因可以是酿酒酵母SLN1基因、粗糙脉孢菌nik1基因或其直系同源物(例如酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物)和/或相同路径内的任何基因(例如选自表7中发现的渗透反应路径基因的任何基因或其直系同源物)。突变可以是本文所提供的任何突变，例如插入、缺失、取代和/或单核苷酸多态性(SNP)。一或多个遗传控制或调节元件可以是启动子序列和/或终止子序列。内源基因或异源基因可以存在于一个表达构筑体上或跨越多个表达构筑体分裂。当跨越多个表达构筑体分裂时，内源基因或异源基因的每一部分可以包含突变和/或处于一或多个遗传控制或调节元件的控制下或可操作地连接到一或多个遗传控制或调节元件。在一个实施例中，内源基因或异源基因是二分的，其中将所述内源基因或异源基因分裂成两个部分，使得所述两个部分中的每一个存在于分开的构筑体上。在一个实施例中，基因是FungiSNP_9(SEQ ID NO:5)、FungiSNP_12(SEQ ID NO:6)、FungiSNP_18(SEQ ID NO:7)或FungiSNP_40(SEQ ID NO:8)。在另一实施例中，基因是融合到或可操作地连接到来自表2的启动子中的任一种的FungiSNP_9(SEQ ID NO:5)、FungiSNP_12(SEQ ID NO:6)、FungiSNP_18(SEQ IDNO:7)或FungiSNP_40(SEQ ID NO:8)。在一个实施例中，基因是FungiSNP_18(SEQ ID NO:7)。在另一实施例中，基因是融合到或可操作地连接到来自表2的man8p或amy8p启动子的FungiSNP_18(SEQ ID NO:7)。在另一实施例中，基因是wt或非SNP FungiSNP_9(SEQ ID NO:77)、wt或非SNP FungiSNP_12(SEQ ID NO:78)、wt或非SNP FungiSNP_18(SEQ ID NO:76)或wt或非SNP FungiSNP_40(SEQ ID NO:79)。在另一实施例中，基因是融合到或可操作地连接到来自表2的启动子中的任一种的wt或非SNP FungiSNP_9(SEQ ID NO:77)、wt或非SNPFungiSNP_12(SEQ ID NO:78)、wt或非SNP FungiSNP_18(SEQ ID NO:76)或wt或非SNPFungiSNP_40(SEQ ID NO:79)。在一个实施例中，基因是wt或非SNP FungiSNP_18(SEQ IDNO:14或76)。在另一实施例中，基因是融合到或可操作地连接到来自表2的man8p或amy8p启动子的FungiSNP_18(SEQ ID NO:14或76)。

在一个实施例中，由丝状真菌细胞产生的原生质体与两个或更多个核酸或聚核苷酸共转化。此外，对于此实施例，两个或更多个聚核苷酸中的至少一个是相对于产生原生质体的丝状真菌菌株的内源基因或异源基因，并且两个或更多个聚核苷酸中的至少一个是可选标记物的基因。如本文所提供，内源基因或异源基因可以编码已经展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的蛋白质。例如，所述基因可以是酿酒酵母SLN1基因、粗糙脉孢菌nik1基因或其直系同源物(例如酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物)和/或相同路径内的任何基因(例如选自表7中发现的渗透反应路径基因的任何基因或其直系同源物)。可选标记基因可以是如本文所提供的任何可选标记物。如本文所描述，两个或更多个核酸或聚核苷酸中的每一个可以分裂成分开的部分，使得每一分开的部分存在于分开的构筑体上。

在一个实施例中，用于转化或转染丝状真菌细胞或由其衍生的原生质体的每一核酸或聚核苷酸包含序列，其与在核酸或聚核苷酸的5'、3'或5'及3'末端上待转化的存在于丝状真菌细胞或由其衍生的原生质体的基因组的预定靶基因座中的DNA序列同源。核酸或聚核苷酸可以是相对于用于转化的丝状真菌细胞的内源基因或异源基因，或可选标记基因，使得与丝状真菌宿主细胞基因组中的预定基因座同源的序列侧接内源、异源或可选标记基因。如本文所提供，内源基因或异源基因可以编码已经展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的蛋白质。例如，所述基因可以是酿酒酵母SLN1基因、粗糙脉孢菌nik1基因或其直系同源物(例如酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物)和/或相同路径内的任何基因(例如选自表7中发现的渗透反应路径基因的任何基因或其直系同源物)。在一个实施例中，使用所属领域中已知的任何方法将每一核酸或聚核苷酸克隆到克隆载体中，所述克隆载体例如

理论上，可以选择丝状真菌基因组中的所有基因座以用于靶向整合包含本文所提供的核酸或聚核苷酸的表达盒。优选地，其中将发生靶向的基因座使得当存在于此基因座的野生型基因已被包含于表达盒中的基因替换时，所获得的突变体将呈现可通过给定分析法检测到的变化，所述分析法例如如本文所描述的选择/反选方案。在一个实施例中，由如本文所描述的丝状真菌细胞产生的原生质体用第一构筑体或表达盒和第二构筑体或表达盒共转化，使得第一构筑体或表达盒经设计以整合到原生质体基因组的第一基因座中，而第二构筑体或表达盒经设计以整合到原生质体基因组的第二基因座中。为了促进整合到第一基因座和第二基因座中，第一构筑体或表达盒侧接与第一基因座同源的序列，而第二构筑体或表达盒侧接与第二基因座同源的序列。在一个实施例中，第一构筑体或表达盒包含内源基因的序列，而第二构筑体包含可选标记基因的序列。此外，对于此实施例，第二基因座含有存在于本文所提供的方法和系统中所使用的原生质体基因组中的额外可选标记基因的序列，而第一基因座含有存在于本文所提供的方法和系统中所使用的原生质体基因组中的内源靶基因的序列。在单独实施例中，第一构筑体或表达盒包含内源基因或异源基因的序列，而第二构筑体包含第一可选标记基因的序列。此外，对于此单独实施例，第二基因座含有存在于本文所提供的方法和系统中所使用的原生质体基因组中的第二可选标记基因的序列，而第一基因座含有存在于本文所提供的方法和系统中所使用的原生质体基因组中的第三可选标记基因的序列。在上述实施例中的每一个中，内源基因和/或异源基因可以包含如本文所提供的突变(例如，SNP)和/或遗传控制或调节元件。如本文所提供，内源基因或异源基因可以编码已经展示出或疑似在控制或影响形态中起作用的蛋白质。例如，所述基因可以是酿酒酵母SLN1基因、粗糙脉孢菌nik1基因或其直系同源物(例如酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物)和/或相同路径内的任何基因(例如选自表7中发现的渗透反应路径基因的任何基因或其直系同源物)。

同核体原生质体的纯化

如所属领域的技术人员将了解，衍生自丝状真菌的原生质体通常可以含有超过一个核，使得用如本文所提供的构筑体(例如插入DNA片段)进行的后续转化可以产生异核体的原生质体，使得构筑体(例如插入DNA片段)仅并入到存在于原生质体中的多个核的亚组中。为了减少在转化之后的异核体原生质体的数目或百分比，可以采用策略以增加在转化之前衍生自丝状真菌宿主细胞的原生质体群体中的单核原生质体百分比，例如使用朗西罗(Roncero)等人,1984,《突变研究(Mutat.Res.)》125：195中描述的方法，其内容以全文引用的方式并入本文中。

除了在转化之前采用策略以增加单核原生质体的数目或百分比之外，可以采用策略以驱动原生质体(和在所述原生质体再生之后由其衍生的菌落)在转化后为同核体，而不管其是单核或多核。如本文所提供，增加对于所需或目的基因(例如，目标形态基因)为同核体的原生质体(和由其衍生的菌落)的数目或百分比，可能需要使衍生自经转化的原生质体或经转化的原生质体群体的菌落经受基于存在和/或不存在一或多种可选标记物的选择和/或反选。一或多种可选标记物可以是如本文所提供的任何可选标记物或可选标记物的组合，并且选择和/或反选方案可以是如本文所提供的任何此类方案。

同核体转化体的鉴别

通过本文中所提供的方法产生的同核体转化体可以通过使用表型筛选、基于序列的筛选或其组合来鉴别。换句话说，表型筛选、基于序列的筛选或其组合可以用于检测在用构筑体(例如插入DNA片段)转化所述原生质体之后衍生自原生质体的菌落中存在或不存在亲本基因型。根据一或多种可选标记基因的引入和/或损失，可以在对所述转化体进行如本文所提供的选择和/或反选方案之前和/或之后，进行同核体转化体的鉴别或检测。表型筛选可以用于鉴别具有可辨别表型(生长的变化和/或比色变化)的转化体，而基于序列的筛选可以用于鉴别在如本文所提供的一或多个构筑体的转化和整合之后具有或不具有可辨别表型的转化体。

基于序列的筛选

如本文所描述，基于序列的筛选可以用于确定在转化体中存在或不存在所需或目标构筑体。以此方式，基于序列的定序可以用于评估所需基因或构筑体的整合是否已经在特定转化体中发生。基于序列的筛选可以用于确定含有所需基因、突变或构筑体的多核细胞或多核细胞群体中的核的百分比。此外，基于序列的筛选可以用于确定已经经历所需目标整合的转化体群体的百分比。构筑体可以是如本文所描述的任何构筑体或多个构筑体。在一些情况下，如果包含所需基因、突变或构筑体的核与不具有所述所需基因、突变或构筑体的核的百分比或比率低于某一阈值，那么基于序列的筛选的结果可以用于选择纯化方案(例如，同核体纯化)。

一般而言，基于序列的筛选可能需要分离可能含有所需突变或构筑体的转化体。每一转化体可含有一或多个核，使得所述核中的一个或每个含有在转化期间引入的核酸的片段(例如包含突变的一或多个构筑体或基因)。所述转化可以是具有如本文所提供的DNA的特定片段(例如，一或多种包含突变的构筑体或基因)的原生质体的靶向转化。

在一些情况下，在分离之后，基于序列的筛选需要使含有核与目标基因(引入的构筑体)和野生型或亲本基因两者的混合物的转化体在影响靶基因的纯度(即选择性培养基)或可能对于任何特定表型或性状完全无选择性的培养基上繁殖，由此产生衍生自转化体的菌落。在一个实施例中，将每一分离的转化体或由其衍生的菌落的一部分转移到或放置在微量滴定板(例如包含琼脂的Omnitray)的孔中，其中转化体或由其衍生的菌落的一部分产孢。微量滴定板可以是96孔、384孔或1536孔微量滴定板。

在单独或与繁殖组合的分离之后，可以从转化体或由其衍生的菌落或孢子提取核酸(例如DNA)。可以从衍生自转化体的孢子分离核酸，并且可以以微量滴定板形式进行，并且可以利用自动化液体处理。核酸的提取可以使用所属领域中已知的任何已知核酸提取方法和/或市售试剂盒(例如Prepman

在核酸提取后，可以进行基于序列的筛选以评估包含所引入的靶基因或构筑体的目标或突变体核与亲本核(即，非转型核)的百分比或比率。基于序列的筛选可以是所属领域中已知的可以用于测定或检测核酸的序列的任何方法。用于进行基于序列的筛选的方法可以选自核酸定序方法或基于杂交的分析法或方法。本文中所提供的方法利用的核酸定序分析法或技术可以是下一代定序(NGS)系统或分析法。用于检测特定核酸序列的基于杂交的分析法可能需要使用微阵列或nCounter系统(Nanostring)。在进行基于序列的筛选之前，可以使用具有被引导到靶基因的引物对的PCR扩增所提取的核酸。

在使用核酸定序方法的实施例中，PCR中使用的引物对可以包含可随后使用经编码的标引引物在二级扩增中使用的衔接子序列。通过二级扩增反应产生的扩增子随后可以使用多重定序来定序，其中定序引物被引导到经编码的标引引物。定序可以使用所属领域中已知的任何类型的定序进行。在一个实施例中，定序是下一代定序(NGS)。NGS可以是所属领域中已知的任何已知NGS方法，例如启迪公司(Illumina)NGS。来自多重定序反应的数据随后可以用于确定靶向核的存在或不存在。在一些情况下，来自多重定序反应的数据还可以用于测定目标孔内的转化体的亲本核与突变体核的比率。此外，对于此实施例，可以产生标准曲线以便定量亲本与突变体核的百分比或比率。标准曲线可以通过扩增和定序从含有已知比率的亲本与突变体核的菌株分离的核酸，且随后使用出现在已知比率中的亲本与突变体扩增子的比率来测定测试样品的纯度的近似值来产生。用于产生标准曲线的菌株可以在与测试样品相同的一组盘中处理(例如分离、繁殖和提取)。

在一个实施例中，基于序列的定序在选择和/或反选之后使用，以便评估或确定每个转化体的同核体状态。选择和/或反选后的基于序列的定序可以使用如本文所描述的多重定序并且可以自动化的或半自动化的。选择和/或反选后的基于序列的定序还可以利用如本文所描述的标准曲线的产生作为确定转化体为异核体的存在和/或量(例如，比率)的手段。

使用基于序列的筛选来确定转化体的纯度

如本文所论述，本文所提供的方法、系统和工作流程中由多核体宿主细胞(例如，丝状真菌宿主细胞)产生的原生质体可以是多核的。随后，用一或多个构筑体(如本文所提供的那些构筑体)转化的原生质体可以仅含有其多个核的一部分或一定百分比，其中将一或多个特定构筑体整合到其基因组中。取决于经转化的构筑体的本质，由于存在于菌落中的核的混合群体的存在，衍生自经转化的原生质体的菌落可能不会产生可辨别的表型。因此，对于测定在核的混合群体中，含有一或多个所需构筑体的核相对于不含有一或多个所需构筑体的那些核的百分比，使用基于序列的筛选可能是必不可少的。在一个实施例中，使用基于NGS的筛选以鉴别含有所需百分比的具有所引入的一或多个构筑体的核的转化体或由其衍生的菌株。所需百分比可以是阈值百分比，由此在所述阈值百分比处或高于所述阈值百分比的由其衍生的转化体或菌株产生所需性状(例如，球粒形态)。所需百分比可以是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。百分比可以通过利用如本文所描述的标准曲线来确定。

表型筛选

如本文所描述，表型筛选可以与基于序列的筛选或转化体组合使用。在一些情况下，基于序列的筛选的结果可以用于确定纯化方案以便确保同核体转化体的分离。此外，可以在表型筛选/纯化之后使用基于序列的筛选，以便评估通过表型筛选/纯化获得的分离是否是同核体的。

使用本文所提供的方法、组合物或系统产生的转化体的表型筛选可以采用一或多种可选标记物。可选标记物通常可以编码基因产物，所述基因产物提供对未转化菌株而言为外来的特定类型的抗性。一般而言，此可以是对重金属、抗生素或杀生物剂的抗性。原养型还可以是非抗生素种类的有用可选标记物。营养缺陷型标记物可以在宿主细胞中产生营养不足，并且校正那些不足的基因可以用于选择。

所属领域中使用广泛的选择标记物，并且这些标记物中的任一种或全部可以应用于本文所提供的方法和系统。本文中使用的可选标记基因可以是营养缺陷型标记物、原养型标记物、显性标记物、隐性标记物、抗生素抗性标记物、分解代谢标记物、酶标记物、荧光标记物、发光标记物或其组合。这些标记物的实例包括(但不限于)：amdS(乙酰胺/氟乙酰胺)、ble(博来霉素(belomycin)-腐草霉素(phleomycin)抗性)、hyg(潮霉素R(hygromycinR))、nat(诺尔斯菌素R(nourseotricin R))、pyrG(尿嘧啶/5FOA)、niaD(硝酸盐/氯酸盐)、sutB(硫酸盐/硒酸盐)、eGFP(绿色荧光蛋白)和所有不同颜色变异体、aygA(比色标记物)、met3(甲硫氨酸/硒酸盐)、pyrE(乳清酸P-核糖基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦乙酰基转移酶)、突变乙酰乳酸合成酶(磺酰脲抗性)和新霉素(neomycin)磷酸转移酶(氨基糖苷抗性)。

本发明的另一实施例需要使用在丝状真菌中具有活性的两种或更多种选择标记物。可以使用广泛的选择标记物的组合，并且其全部可以应用于本文所提供的选择/反选方案中。例如，选择/反选方案可以使用营养缺陷型标记物、原养型标记物、显性标记物、隐性标记物、抗生素抗性标记物、分解代谢标记物、酶标记物、荧光标记物和发光标记物的组合。第一标记物可以用于在正向模式(即如果已发生主动整合)中选择，而额外标记物可以用于在反向模式(即如果已发生在合宜的基因座处的主动整合)中选择。选择/反选可以通过共转化进行，使得选择标记物可以在分开的载体上或可以在与如本文所描述的内源或异源基因相同的核酸片段或载体中。

在一个实施例中，本发明的同核体原生质体纯化方案需要用包含内源形态基因或异源形态基因的序列的第一构筑体和包含第一选择标记基因的序列的第二构筑体共转化从丝状真菌宿主细胞产生的原生质体，使得所述第一构筑体被引导到所述原生质体基因组的第一基因座，所述第一基因座包含待去除或失活的靶基因的序列，而所述第二构筑体被引导到所述原生质体基因组的第二基因座，所述第二基因座包含第二选择标记基因的序列。在一个实施例中，第一构筑体包含内源基因或异源基因的序列，并且待去除或失活的靶基因是针对第三可选标记基因。在单独实施例中，第一构筑体包含内源基因的序列，并且待去除或失活的靶基因是在转化之前存在于原生质体的基因组中的内源基因的复本。如本文所描述，第一构筑体的内源基因或异源基因可以包含突变(例如SNP)和/或基因调节或控制元件(例如启动子和/或终止子)。第一、第二和/或第三可选标记物可以是所属领域中已知和/或本文中所描述的任何营养缺陷型标记物、原养型标记物、显性标记物、隐性标记物、抗生素抗性标记物、分解代谢标记物、酶标记物、荧光标记物、发光标记物。为了被引导到特定基因座，构筑体中的每一种侧接与如本文所描述的原生质体基因组中的所需基因座同源的核苷酸。

在一个实施例中，第二构筑体包含编码可再循环或可逆标记物的表达盒。可再循环或可逆标记物可以是破坏neo-pyrG-neo表达盒。可以将neo-pyrG-neo构筑体与如以上实施例中所描述的第一构筑体在丝状真菌宿主细胞(例如黑曲霉)的ura-菌株中共转化，并且同核体转化体可以通过涂在尿嘧啶不足的培养基上和选择如上文所描述的纯黄色尿嘧啶原养型来选择。随后，pyrG选择的使用可以通过以下来再生：将所述同核体转化体涂在含5-FOA培养基上，并且选择生长在所述5-FOA培养基上的转化体，其表明所述转化体已经经历导致pyrG基因切除的neo重复序列之间的染色体内重组。

在另一实施例中，代替使用如本文所提供的共转化，本发明的同核体原生质体纯化方案需要用包含特定基因的序列的缺失构筑体转化从丝状真菌宿主细胞产生的原生质体，使得所述构筑体被引导到包含待去除或失活的靶基因的序列的原生质体基因组的所需基因座。为了被引导到特定基因座，构筑体侧接与如本文所描述的原生质体基因组中所需基因座同源的核苷酸。所需基因座可以是来自如本文所提供的形态靶基因或其突变体(例如酿酒酵母SLN1的黑曲霉直系同源物或其突变体，例如FungiSNP_18或酿酒酵母SLN1的任何直系同源物)的基因座。此类型的构筑体/转化的使用可以用于提供关于特定基因在经转化的宿主细胞或菌株的形态中起作用的信息。在一个实施例中，通过使用例如下一代定序(NGS)对原生质体的基因组定序来证实将缺失构筑体正确整合到原生质体基因组中。所使用的NGS系统或方法可以是所属领域中已知的任何NGS系统或方法，例如启迪公司NGS。在一种情况下，丝状真菌宿主细胞是pyrG阴性的，并且缺失构筑体包含可选标记基因，而靶基因是如本文所提供的形态靶基因或其突变体(例如酿酒酵母SLN1的黑曲霉直系同源物或其突变体，例如FungiSNP_18或酿酒酵母SLN1的任何直系同源物)。因此，同核体原生质体转化体的纯化需要使所述转化体在不具有尿嘧啶的基本培养基上生长。在另一情况下，丝状真菌宿主细胞是pyrG阳性的，并且缺失构筑体包含SNP(在来自表2的启动子与来自表3或表4的SNP之间的融合的来自表3或表4的SNP)，而靶基因是可选标记基因。因此，同核体原生质体转化体的纯化需要使所述转化体在包含FOA的基本培养基上生长。

在又一实施例中，将突变形态的靶基因(例如来自表3或表4的SNP)经由转化和突变基因的多个部分的整合整合到多核体生物体(例如丝状真菌，如黑曲霉)的基因组中的目标基因座(例如来自形态靶基因的基因座)中，使得突变基因的多个部分中的每一个存在于单独的构筑体上。多个构筑体中的每一个可以包含突变基因的独特部分加突变基因的重叠部分，所述重叠部分也存在于其它多个构筑体中的一个上，以便促进多个构筑体的重组以产生生物体基因组中突变基因的功能性复本。为了促进突变基因的每一部分整合到生物体的所需基因座中，多个构筑体中的每一个还可以包含与侧接构筑体中的突变基因的部分的生物体基因组中的所需基因座同源的核苷酸。在一些情况下，将突变基因跨越两个构筑体分裂并且经由两个构筑体的二分转化引入到生物体中。在图6中描绘此概念的一个实例。如图6所示，将pyrG标记基因分裂成两个构筑体，使得所述构筑体中的每一个包含pyrG的独特部分和与另一构筑体重叠的部分。此外，每个构筑体还包含与宿主生物体基因组中的aygA标记基因同源的序列，所述序列侧接终止子重复序列(例如直接重复序列(DR))，所述终止子重复序列包含侧接pyrG标记基因的独特部分的目标形态基因的序列。目标形态基因可以是突变体形式(例如包含SNP)或野生型形式。目标形态基因可以是可以与异源启动子(例如来自表2的启动子)融合的突变体形式(例如包含SNP)或野生型形式。在使用本文所提供的方法中的任一种转化之后，两个构筑体的重组造成包含两个DR的整个pyrG标记基因的插入。可以经由如本文所描述的选择/反选来检测含有完全整合的pyrG标记基因的转化体和通过环出丢失pyrG标记基因(如图7中所示)的转化体。确切地说，可以通过在具有FOA的培养基上生长转化体来选择环出。

如所属领域的技术人员可以理解，图6和7中所描绘的概念可以用于将突变(例如SNP)的组合引入到靶基因中并且随后测试所述组合的表型效应。表型效应可以是产生具有所需形态表型的菌株或宿主细胞。所需形态表型可以是所述菌株或宿主细胞在浸没式培养条件下在生产培养基中生长时显示非菌丝体球粒形态。当生长于固体培养基上时，所述菌株或宿主细胞可以生长且通常产孢。此外，如本文所描述，经考虑可以使用类似技术引入其它突变以便建构含有特定突变组合的菌株。

在其它实施例中，进行真菌(例如黑曲霉)中的组合SNPSWP，通过将两个单独构筑体整合到亲本基因中，从而将靶基因的多个突变以与诱导型启动子的各种组合引入到原生质体基因组中，所述两个单独构筑体各自包含在单一转化中融合到诱导型启动子的突变和分裂标记基因(发散pyrG基因)的一部分。在含有构筑体的对应的pyrG基因的重叠部分之间和在构筑体与宿主基因组中的靶基因的同源部分之间成功重组后，整个pyrG基因中的每一个的表达可以通过葡萄糖的分解代谢物抑制来控制。因此，可以通过在葡萄糖上生长转化体来选择转化体，使得其中出现所需重组和整合事件的转化体的生长是受到青睐的。此外，可以通过在具有FOA的培养基上生长转化体来促进环出。

另一实施例需要使用环入单一交叉事件将靶基因(例如aygA)中的突变(例如SNP)与包含具有突变和一或多个可选标记物(例如抗生素抗性基因(amp

HTP自动化系统

在一些实施例中，本文所提供的用于在浸没式培养条件下产生具有所需球粒形态的丝状真菌菌株或宿主细胞的方法和系统包含自动化步骤。例如，如本文所描述的原生质体的产生、原生质体的转化和/或经由选择/反选纯化同核体原生质体可以是自动化的。如本文所描述，方法和系统可以含有筛选经纯化的同核体转化体以在浸没式培养条件下展示所需球粒形态的另一步骤。本发明的自动化方法可以包含机器人系统。本文概述的系统通常可以涉及96孔或384孔微量滴定板的使用，但是如所属领域的技术人员将了解，可使用任何数目的不同盘或配置。另外，本文所概述的步骤中的任一个或所有可以自动进行；因此，例如，系统可完全或部分自动化。自动化方法和系统可以是高通量的。出于本发明的目的，高通量筛选可以指能够每天评价约1,000个或更多转化体的任何部分或完全自动化方法，并且尤其指能够每天评价5,000个或更多转化体的那些方法，并且最尤其指能够每天评价10,000个或更多转化体的方法。

如本文所描述，本文所提供的方法和系统可以包含筛选步骤，使得在浸没式培养物中筛选或测试如本文所描述产生和纯化的转化体的所需球粒形态。所产生的包含所需球粒形态的菌株或宿主细胞可以随后用于产生目的产物。目的产物可以是本文所提供的任何目的产物，例如醇、药品、代谢物、蛋白质、酶、氨基酸或酸(例如柠檬酸)。因此，本文所提供的方法和系统还可以包含在允许表达和分泌目的产物的条件下培养包含根据本发明的方法纯化的所需球粒形态的克隆菌落或培养物，并且回收随后产生的目的产物。如本文所述，目的产物可以是外源和/或异源蛋白质，或由外源和或异源蛋白质的表达产生的代谢物。

在一些实施例中，本发明的自动化系统包含一或多个工作模块。例如，在一些实施例中，本发明的自动化系统包含DNA合成模块、载体克隆模块、菌株转化模块、筛选模块和定序模块。

如所属领域的技术人员将了解，自动化系统可以包括广泛多种组件，包括(但不限于)：液体处理器；一或多个机器人臂；用于放置微量盘的盘处理器；盘密封件、盘穿孔机、用于去除和替换非交叉污染盘上的孔盖的自动化盖处理器；用一次性吸头进行样品分配的一次性吸头组合件；用于样品分配的可洗吸头组合件；96孔加载块；集成式热循环仪；经冷却的试剂架；微量滴定板移液管位置(任选地经冷却)；用于盘和吸头的堆叠塔；磁珠处理站；过滤系统；盘振荡器；条形码阅读器和施加器；和计算机系统。

在一些实施例中，本发明的机器人系统包括实现了高通量移液的自动化液体和颗粒处理，以进行基因靶向和重组应用过程中的所有步骤。此包括液体和颗粒操控，如抽吸、分配、混合、稀释、洗涤、精确体积转移；收回和丢弃移液管吸头；以及反复对相同体积进行移液，以从单一样品抽吸进行多次递送。这些操控是无交叉污染的液体、颗粒、细胞和生物体转移。仪器进行微量盘样品到过滤器、膜和/或子培养盘的自动化复制、高密度转移、全盘连续稀释以及高容量操作。

自动化系统可以是所属领域中已知的任何已知自动化高通量系统。例如，自动化系统可以是在日本专利申请公开第11-304666号中描述的自动化微生物处理工具。此装置能够转移含有个别细胞的微液滴，并且预期本发明的真菌菌株由于其形态而将适合于用此装置对个别克隆进行微操控。用于本发明的方法和系统的自动化系统的额外实例是贝登(Beydon)等人，《生物分子筛选杂志(J.Biomol.Screening)》5：13 21(2000)中描述的自动化微生物高通量筛选系统。本文中使用的自动化系统可以是定制自动化液体处理系统。在一些实施例中，本发明的定制自动化液体处理系统是TECAN机器(例如定制的TECANFreedom Evo)。

在一些实施例中，本发明的自动化系统与用于多孔板、深孔板、方孔板、试剂槽、试管、微型管、微型融合管、冷冻管、过滤器、微阵列芯片、光纤、珠粒、琼脂糖和丙烯酰胺凝胶的平台兼容，并且其它固相基质或平台容纳于可升级的模块化层板上。在一些实施例中，本发明的自动化系统含有用于多位置工作表面的至少一个模块化层板，用于放置源样品和输出样品、试剂、样品和试剂稀释液、分析盘、样品和试剂储集器、移液管吸头和活动的吸头洗涤台。

在一些实施例中，本发明的自动化系统包括用于转化原生质体的高通量电穿孔系统。在一些实施例中，高通量电穿孔系统能够在96孔或384孔盘中转化细胞。在一些实施例中，高通量电穿孔系统包括

在一些实施例中，自动化系统包含经整合的热循环仪和/或热调节器，其用于稳定如受控块或平台等热交换器的温度以提供从0℃到100℃的培育样品的精确温度控制。

在一些实施例中，本发明的自动化系统与能够以机器人方式操控液体、颗粒、细胞和多细胞生物体的可更换机器头(单或多通道)兼容，所述机器头具有单个或多个磁性探针、亲和探针、复制器或移液器。多孔或多管式磁性分离器和过滤台按单个或多个样品形式操控液体、颗粒、细胞和生物体。

在一些实施例中，本发明的自动化系统与相机视觉和/或光谱仪系统兼容。因此，在一些实施例中，本发明的自动化系统能够检测和记录进行中的细胞培养物中的颜色和吸收变化。

在一些实施例中，产生具有所需球粒形态的丝状真菌宿主细胞或菌株的本发明的自动化系统被设计为柔性的且可适用于多个硬件附件，以允许系统进行多个应用。本文所提供的方法中使用的自动化系统可以包含软件程序模块。软件程序模块可以允许方法的创建、修改和运行。所述系统还可以包含诊断模块。诊断模块可以允许设置、仪器对准和电动机运行。所述系统仍还可以包含定制的工具、实验室器具、液体和颗粒转移模式和/或数据库。定制的工具、实验室器具以及液体和颗粒转移模式可以允许不同应用被编程和执行。数据库可以允许方法和参数储存。此外，存在于系统中的机器人和计算机接口可以允许仪器之间的通信。

所属领域的技术人员将认识到能够进行本发明的HTP方法以产生具有所需球粒形态的丝状真菌宿主细胞或菌株的各种机器人平台。

计算机系统硬件

图10说明了根据本发明实施例的计算机系统800的实例，所述计算机系统800可用于执行非瞬时性计算机可读介质(例如存储器)中所存储的程序代码。计算机系统包括输入/输出子系统802，其可根据应用用于连接人类用户和/或其它计算机系统。I/O子系统802可包括例如键盘、鼠标、图形用户界面、触摸屏，或用于输入的其它界面，以及例如LED或其它平面屏幕显示器，或用于输出的其它界面，包括应用程序界面(API)。本发明的实施例的其它元件，如LIMS系统的组件，可用计算机系统(如计算机系统800)来实施。

程序代码可以存储于非瞬时性介质中，如辅助存储器810或主存储器808或这两者中的永久性存储器中。主存储器808可包括易失性存储器，如随机存取存储器(RAM)或非易失性存储器，如只读存储器(ROM)，以及用于对指令和数据的较快存取的不同层级的高速缓冲存储器。辅助存储器可包括永久性存储器，如固态驱动器、硬盘驱动器或光盘。一或多个处理器804从一或多个非瞬时性介质中读取程序代码且执行所述代码以使计算机系统能够实现本文实施例所进行的方法。所属领域的技术人员将了解，处理器可摄取源码，并且将源码解释或编译成在处理器804的硬件门级处可理解的机器代码。一或多个处理器804可包括用于处理计算密集型任务的图形处理单元(GPU)。尤其是在机器学习中，一或多个CPU 804可将大量数据的处理分流到一或多个GPU 804。

处理器804可经由一或多个通信接口807(如，网络接口卡、WiFi收发器等)与外部网络通信。总线805以通信方式耦合I/O子系统802、处理器804、外围装置806、通信接口807、存储器808和永久性存储器810。本发明的实施例不限于此代表性架构。替代实施例可采用不同的配置和组件类型，例如用于输入-输出组件和存储器子系统的单独总线。

所属领域的技术人员将了解，本发明的实施例中的一些或全部元件和其伴随操作可完全或部分地通过一或多个计算机系统来实施，所述计算机系统包括一或多个处理器和一或多个存储器系统，如计算机系统800的那些。确切地说，本文所描述的任何机器人和其它自动化系统或装置可为计算机实施的。一些元件和功能可在本地实施，并且其它元件和功能可按通过不同服务器的网络分布方式，例如按客户端-服务器方式实施。确切地说，服务器侧操作可作为服务(SaaS)方式在软件中对多个客户端可用。

术语组件在此背景中广泛地指软件、硬件或固件(或其任何组合)组件。组件典型地是可以使用指定的一或多个输入来产生有用数据或其它输出的功能组件。组件可为独立的或可为非独立的。应用程序(也称为“应用”)可包括一或多个组件，或组件可以包括一或多个应用程序。

一些实施例包括所述组件中的一些、全部或悉缺以及其它模块或应用组件。再者，各种实施例可将这些组件中的两个或更多个并入到单个模块中和/或使这些组件中的一或多个的功能的一部分与不同组件相关联。

术语“存储器”可以是用于存储信息的任何装置或机构。根据本发明的一些实施例，存储器打算涵盖(但不限于)：易失性存储器、非易失性存储器和动态存储器中的任何类型。例如，存储器可以是随机存取存储器、存储器存储装置、光学存储器装置、磁性介质、软盘、磁带、硬盘驱动器、SIMM、SDRAM、DIMM、RDRAM、DDR RAM、SODIMMS、可擦除可编程只读存储器(EPROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、光盘、DVD和/或类似存储器。根据一些实施例，存储器可包括一或多个磁盘驱动器、闪存驱动器、数据库、本地高速缓冲存储器、处理器高速缓冲存储器、关系数据库、平面数据库、服务器、基于云端的平台和/或类似存储器。另外，所属领域的技术人员将了解，可以使用用于存储信息的许多其它装置和技术作为存储器。

存储器可用于存储用于在处理器上运行一或多个应用或模块的指令。例如，在一些实施例中可以使用存储器来容纳执行本申请中所公开的模块和/或应用中的一或多个的功能所需的全部或一些指令。

细胞培养和发酵

本发明的细胞可以在常规营养培养基中培养，所述常规营养培养基经适当修饰以用于任何所需生物合成反应或选择。在一些实施例中，本发明教示了在用于活化启动子的诱导型培养基中培养。在一些实施例中，本发明教示了具有选择剂的培养基，所述选择剂包括转化体的选择剂(例如抗生素)，或适合于在抑制条件(例如高乙醇条件)下生长的生物体的选择剂。在一些实施例中，本发明教示了使细胞培养物在优化用于细胞生长的培养基中生长。在其它实施例中，本发明教示了使细胞培养物在优化用于产物产量的培养基中生长。在一些实施例中，本发明教示了使培养物在能够诱导细胞生长的培养基中生长，并且还含有最终产物生产所必需的前体(例如，用于乙醇生产的高含量的糖)。

培养条件(如温度、pH等)是适合与所选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于所属领域的技术人员将显而易见。如所提及，对于许多细胞，包括细菌、植物、动物(包括哺乳动物)和古细菌来源的细胞的培养和产生的许多参考文献是可获得的。参见例如萨布鲁克(Sambrook)、奥斯贝(Ausubel)(所有均见上文)以及伯杰(Berger)，《分子克隆技术指南，酶学方法(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology)》，第152卷，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥；以及弗瑞旭尼(Freshney)(1994)，《动物细胞的培养：基本技术手册(Culture ofAnimal Cells,a Manual of Basic Technique)》，第三版，威立-利斯(Wiley-Liss)，纽约和其中引用的参考文献；多伊尔(Doyle)和格里菲思(Griffiths)(1997)，《哺乳动物细胞培养：基本技术(Mammalian Cell Culture:Essential Techniques)》，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，纽约；忽玛逊(Humason)(1979)，《动物组织技术(AnimalTissue Techniques)》，第四版，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)；以及里奇埃德尔(Ricciardelle)等人，(1989)，《活体外细胞发育生物学(In Vitro CellDev.Biol.)》，25：1016-1024，所有文献以引用的方式并入本文中。关于植物细胞培养和再生，参见派恩(Payne)等人(1992)，《液体系统中的植物细胞和组织培养(Plant Cell andTissue Culture in Liquid Systems)》，约翰·威利父子公司，纽约州纽约市；冈堡(Gamborg)和菲利浦(Phillips)(编)(1995)，《植物细胞、组织和器官培养：基本方法施普林格实验室手册(Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods SpringerLab Manual)》，施普林格出版社(Springer-Verlag)(柏林海德堡，纽约)；琼斯(Jones)编(1984)，《植物基因转移和表达方案(Plant Gene Transfer and ExpressionProtocols)》，胡马纳出版社(Humana Press)，新泽西州特图瓦市(Totowa,N.J.)，以及《植物分子生物学(Plant Molecular Biology)》(1993)R.R.D.克洛(R.R.D.Croy)编，生物科学出版社(Bios Scientific Publishers)，英国牛津(Oxford,U.K.)ISBN 0 12 198370 6，所有文献均以引用的方式并入本文中。细胞培养基一般阐述于阿特拉斯(Atlas)和帕克斯(Parks)(编)，《微生物培养基手册(The Handbook of Microbiological Media)》(1993)CRC出版社，佛罗里达州波卡拉顿(Boca Raton,Fla.)，所述文献以引用的方式并入本文中。用于细胞培养的其它信息见于可获得的商业文献中，如得自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Inc)(密苏里州圣路易(St Louis,Mo.))的《生命科学研究细胞培养目录(LifeScience Research Cell Culture Catalogue)》(“西格马-LSRCCC”)以及例如也得自西格玛-奥德里奇公司(密苏里州圣路易)的《植物培养目录和增刊(The Plant CultureCatalogue and supplement)》(“西格马-PCCS”)，所述文献均以引用的方式并入本文中。

待用的培养基必须以合适的方式满足对应的菌株的需求。用于各种微生物的培养基的描述存在于美国细菌学学会(American Society for Bacteriology)(美国华盛顿哥伦比亚特区，1981)的《通用细菌学方法手册(Manual of Methods for GeneralBacteriology)》中。

本发明另外提供一种用于目的产物的发酵制备的方法，包含以下步骤：a)将根据本发明的微生物在合适的培养基中培养，从而产生发酵液；和b)将a)和/或在微生物细胞中的发酵液中的目的产物浓缩。

在一些实施例中，本发明教示，出于产生所需有机化合物的目的，所产生的微生物体可如例如WO 05/021772中所描述连续地培养，或用分批法(分批培育)或分批进料或重复分批进料法不连续地培养。关于已知培育方法的通用性质的概述可获得于Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik.1:Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren和periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))。

在一些实施例中，本发明的细胞是在分批或连续发酵条件下生长。

经典的分批发酵是一种封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成且在发酵期间不进行人工改变。分批系统的变化形式是分批进料发酵，其也可用于本发明中。在这种变化形式中，随着发酵的进行，按增量添加底物。当代谢物抑制可能会抑制细胞代谢时且在期望培养基中的底物的量有限的情况下，分批进料系统是适用的。分批和分批进料发酵是所属领域中常见且众所周知的。

连续发酵是一种系统，其中将成分确定的发酵培养基连续地添加到生物反应器中且同时去除等量的改良性培养基以供处理，并且收获所需目的生物分子产物。在一些实施例中，连续发酵通常使培养物维持在恒定的高密度下，其中细胞主要处于对数生长期。在一些实施例中，连续发酵通常使培养物维持在停滞或对数后/停滞生长期。连续发酵系统力求维持稳定状态生长条件。

连续发酵过程中用于调节营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率达到最大的技术是在工业微生物学领域中众所周知的。

例如，本发明的培养物的碳源的非限制性列表包括糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来自甜菜或甘蔗加工的含蔗糖溶液、淀粉、淀粉水解产物和纤维素；油和脂肪，例如大豆油、葵花油、花生油和椰子脂肪；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，例如甘油、甲醇和乙醇；以及有机酸，例如乙酸或乳酸。

用于本发明的培养物的氮源的非限制性清单包括含有机氮的化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素；或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以个别地使用或作为混合物使用。

用于本发明的培养物的可能磷源的非限制性清单包括磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相对应的含钠盐。

培养基可另外包含生长所需的盐，例如呈氯化物形式的盐，或金属(例如钠、钾、镁、钙和铁)硫酸盐，例如硫酸镁或硫酸铁。

最后，除上述物质之外，可使用基本生长因子，如氨基酸，例如高丝氨酸和维生素，例如硫胺、生物素或泛酸。

在一些实施例中，培养物的pH可以通过任何酸或碱或缓冲盐(包括(但不限于)氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)；或酸性化合物(如磷酸或硫酸)以合适的方式来控制。在一些实施例中，通常将pH调节到6.0至8.5的值，优选6.5至8。

在一些实施例中，本发明的培养物可包括消泡剂，例如脂肪酸聚二醇酯。在一些实施例中，本发明的培养物通过添加合适的选择性物质(例如抗生素)来修饰以使培养物中的质粒稳定化。

在一些实施例中，在好氧条件下进行培养。为了维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物(例如空气)引入到培养物中。同样可以使用富含过氧化氢的液体。适当时，在高压下，例如在0.03至0.2MPa的高压下进行发酵。培养物的温度通常是20℃至45℃且优选25℃至40℃，特别优选30℃至37℃。在分批或分批进料方法中，优选持续培养直到已经形成足以回收的量的所需目的产物(例如有机化合物)为止。此目标通常可以在10小时至160小时内实现。在连续方法中，较长培育时间是可能的。微生物的活性使得目的产物在发酵培养基中和/或在所述微生物的细胞中浓缩(积累)。

在一些实施例中，在厌氧条件下进行培养。

在一些实施例中，本文提供一种用于生长使用本文所提供的方法产生的丝状真菌菌株或宿主细胞的发酵培养基，其包含锰并且基本上不含(在所属领域中已知的用于产生目的产物(例如柠檬酸)的发酵培养基中所发现的螯合剂的量或浓度的小于5％、4％、3％、2％或1％)或不含螯合剂，使得所述丝状真菌菌株或宿主细胞在所述发酵培养基中生长时维持非菌丝体球粒形态。发酵培养基可以是柠檬酸生产培养基。锰可以以约14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、250、500、750或1000ppb存在。锰可以以大于13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、250、500、750或1000ppb存在。发酵培养基可以不包含螯合剂。发酵培养基可以包含比正常发酵培养基少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的螯合剂。螯合剂可以是锰螯合剂。丝状真菌菌株或宿主细胞可以包含一或多种遗传改变的目标形态基因。目标形态基因可以是本文所提供的任何形态相关基因。在一个实施例中，目标形态基因是黑曲霉二组分组氨酸激酶基因(例如黑曲霉nikA基因；SEQ ID NO:14)。遗传变异可以是目标形态相关基因的突变体形式和/或用异源启动子或终止子取代原生启动子或终止子。在一个实施例中，目标形态基因的突变体形式是FungiSNP_9(SEQ ID NO:5)、FungiSNP_12(SEQ ID NO:6)、FungiSNP_18(SEQ ID NO:7)或FungiSNP_40(SEQ ID NO:8)。在另一实施例中，目标形态基因的突变体形式是融合到或可操作地连接到来自表2的启动子中的任一个的FungiSNP_9(SEQ ID NO:5)、FungiSNP_12(SEQ ID NO:6)、FungiSNP_18(SEQ ID NO:7)或FungiSNP_40(SEQ ID NO:8)。在一个实施例中，目标形态基因是酿酒酵母SLN 1蛋白质或由SEQ ID NO:7编码的粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物的突变体形式。此外，对于此实施例，将用于酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的突变体形式的基因融合到man8p或amy8p启动子。man8p启动子或amy8p启动子可以来自表2。

出于说明本发明的各种实施例的目的给出以下实例，并且并不意图以任何方式限制本发明。所属领域的技术人员将认识到涵盖于如由权利要求书范围限定的本发明的精神内的其中变化和其它用途。

下文仅出于辅助读者的目的提供简短的导航(即表5)。此导航中没有任何内容意图限制本申请的实例或公开内容的范围。

表5-实例章节的导航

实例1：丝状真菌的HTP基因组工程改造：鉴别影响丝状真菌形态的基因

此实例表明SNP交换库在丝状真菌黑曲霉的SNPSWAP方法中的用途，以便鉴别在控制真菌细胞形态中起作用的基因。确切地说，此实例描述了在黑曲霉突变菌株中赋予非菌丝体成型、球粒样形态表型的一组基因的鉴别，其中所述细胞在浸没式培养物中生长时维持与具有多个吸头的每个细胞更紧密、较不细长的表型。此类型的生长有利于搅拌槽发酵。

黑曲霉是用于通过发酵大规模生产柠檬酸的一种丝状真菌。此菌种的多种菌株已被分离出且已展示具有生产柠檬酸和其它有机酸的不同能力。A.黑曲霉菌株ATCC 1015在早期二十世纪中被鉴别为柠檬酸的产生者。随后发现命名为ATCC 11414的此菌株的分离株展示的柠檬酸产量相对于其亲本增加。例如，黑曲霉菌株ATCC 1015在含有硝酸铵、但缺乏铁和锰阳离子的培养基中利用140克葡萄糖平均产生7克柠檬酸。另一方面，分离株菌株ATCC 11414在相同条件下展现10倍的产量增加(70克柠檬酸)。此外，菌株ATCC 11414孢子在柠檬酸生产培养基中的发芽和生长比菌株1015的孢子更佳。

为了鉴别这些表型差异的潜在基因来源，对ATCC 1015与ATCC 11414菌株的基因组进行了定序和分析。所得分析结果鉴别出43种区别1015和11414菌株的SNP(参见表3)。在这些43个SNP中，发现18种存在于其对应的基因的编码域中(参见表4)。

为了鉴别在不同培养条件下在控制丝状真菌的形态/生长中起潜在作用的基因，来自表3的43个SNP用于如本文所描述的SNP交换过程，以便将来自表3的每个个别SNP系统地引入到基础1015菌株中，并且从形态角度来检验来自所得亲本菌株与突变菌株之间的表型差异。相反地，在11414生产菌株中进行相同类型的过程，其中用每个基因的野生型形式系统性地替换已经存在于11414基因组中的来自表3的SNP中的每一个，并且注意亲本菌株与突变菌株之间的任何所得形态上的差异。

用于转化原生质体的构筑体

在此实例中，用两个构筑体(“分裂-标记物构筑体”)将每个菌株(即1015和11414)共转化，其中两个构筑体中的每一个含有可选标记物(即，图4和5中的pyrG)的重叠部分，并且通过如图4和5中所示的直接重复序列侧接。使用融合PCR产生分裂-标记物构筑体，并且使用如图5中所示的片段分析仪进行质量控制(QC'd)。此外，这些构筑体中的每一个还包含侧接每个构筑体的直接重复序列部分的序列，以便引导在来自表3的每个SNP的对应的靶基因处的宿主细胞基因组中的整合。对于1015基础菌株原生质体，分裂构筑体中的直接重复序列包含来自表3(参见图6)的SNP中的一种。相比之下，对于11414生产菌株原生质体，直接重复序列不包含来自表3的SNP。

培养黑曲霉基础菌株1015和生产菌株11414，将其转换成原生质体，如2017年6月6日提交的62/515,907中所描述进行转化和筛选。综上所述，这些步骤中的每一步如下：

原生质体的产生

对于黑曲霉1015基础菌株和黑曲霉11414生产菌株，以10

两种菌株的菌丝体的酶消化通过首先在原生质体产生缓冲液(1.2M硫酸镁，50mM磷酸盐缓冲液，pH为5)中制备50ml的60mg/ml的VTP来进行。溶解VTP之后，将缓冲液置于干净的Oakridge管中并且在15,000x g下旋转持续15分钟。然后在离心之后将溶液过滤灭菌。一旦制得，将所收集的菌丝体中的一些添加到VTP溶液中，并且将菌丝体在30℃下以80rpm消化约2-4小时。在VTP消化期间的不同时间间隔下，在400x放大倍数下检验小份样品中原生质体(即较大圆形细胞，其大于分生孢子并且对渗透裂解敏感)的存在。当每个菌株的大部分或所有菌丝体被消化时，经由无菌Miracloth过滤来自每个菌株的培养物，并且将滤液收集在刻度量筒中。将经过滤的原生质体转移到刻度量筒，并且温和地叠加具有较低渗透质浓度(5ml 0.4M ST缓冲液(0.4M山梨醇，100mM Tris，pH为8)的缓冲液。接着在800×g下在4℃下将叠加样品旋转持续15分钟，并且接着用移液管去除原生质体，并且与25ml ST溶液(1.0M山梨醇，50mM Tris，Ph为8.0)温和地混合并且在800×g下再旋转持续10分钟。原生质体应该在管的底部处形成球粒。接着将来自每个菌株的原生质体各自分别地再悬浮于25ml ST溶液中，并且通过在800×g下离心持续10分钟来收集。

原生质体的转化

离心之后，来自两种菌株的原生质体最终再悬浮于含有氯化钙的缓冲液中。随后，使用自动化液体处理器对来自两种菌株的原生质体进行传统PEG钙介导的转化，所述自动化液体处理器将来自上文所描述的分裂构筑体的DNA与96孔中的原生质体-PEG混合物组合。

筛选转化体

如上文所描述，在此实例中使用的分裂标记物构筑体含有侧接pyrG标记基因的直接重复序列，所述直接重复序列随后用于循环出标记基因。结果，含有环出构筑体的菌株由于选择区域的缺失而被反选(例如，参见图4和图7；不存在pyrG基因)。通过如本文所描述的基于序列的筛选进一步评估正确整合。此外，使用NGS筛选突变菌株以便评估如本文所提供的转化体的同核体本质。将同核体或基本上同核体的突变菌株涂在含有(参见图13和14)或不含(参见图15)各种补充剂的基本培养基上，以便评估所述菌株在低pH(图13)或渗透应激(图14)下生长或产孢(图15)的能力。另外，突变菌株在CAP培养基中作为浸没式培养物生长以便评估其在浸没式生产培养基中的表型。

结果

表3和4之间共有的4个SNP单独整合到基础黑曲霉菌株1015中，其产生形态表型。确切地说，将FungiSNP_9(SEQ ID NO:5)、FungiSNP_12(SEQ ID NO:6)、FungiSNP_18(SEQID NO:7)或FungiSNP_40(SEQ ID NO:8)整合到1015基因组产生的突变菌株中，在CAP培养基中作为浸没式培养物生长时产生非菌丝体球粒形态。

在向下波动实验中进一步表明含有4个SNP的基因在影响真菌形态方面的作用，由此去除这些4个SNP中的每一个修复了所观察到的形态表型。4个SNP的序列可以见于所附序列表中，而其推定的或已知蛋白质功能可以见于表4中。

如图13中所示，含有基础SNP18的菌株在低pH值培养基上生长得更快。基础菌株(即图13中的基础snp18

如图14中所示，含有基础SNP18(即FungiSNP_18的野生型形式)的菌株在提供渗透应激的培养基上生长得更快。基础菌株(即图14中的基础snp18

有趣的是，当不在浸没式培养物(例如在盘上)中生长时，含有FungiSNP_9、FungiSNP_12或FungiSNP_40中的每一个的基础菌株正常生长且正常产孢。如图15中所示，基础菌株(即1015)中的表达FungiSNP_18的确展示对径向生长速率(减少)和孢子形成的影响。

实例2：丝状真菌的HTP基因组工程改造：证实所鉴别的基因在所鉴别的形态控制基因的丝状真菌形态缺失中起作用

此实例证实了在实例1中鉴别的4个基因在真菌形态中起作用。确切地说，此实例描述使用如本文所描述的HTP方法在黑曲霉菌株1015和11414中敲除或缺失4个基因中的每一个。

如实例1中所描述，培养黑曲霉基础菌株1015和生产菌株11414，将其转换成原生质体，进行转化和筛选。

用于转化原生质体的构筑体

在此实例中，用一系列单一构筑体转化来自每个菌株(即1015和11414)的原生质体，其中所述系列中的每个构筑体含有侧接与侧接实例1中所鉴别的4个目的基因中的一个的基因组序列互补的序列的可选标记基因(即pyrG)，以便引导标记基因整合到宿主细胞基因组中。如图8中所示，将标记基因整合到4个基因中的一个(1015菌株中的4个野生型基因中的一个和11414菌株中的4个SNP中的一个)的基因座中基本上用于从对应的菌株的基因座去除所述野生型基因或含有SNP的基因。

生长之后，使用NGS筛选突变菌株以便评估如本文所提供的转化体的同核体本质。将同核体或基本上同核体的突变菌株涂在培养基上，以便评估所述菌株在CAP培养基中作为浸没式培养物产孢或生长的能力，以便评估其在浸没式生产培养基中的表型。

结果

从基础1015菌株以及11414生产菌株去除4个基因中的每一个证实了来自实例1的结果，因为所述4个基因中的每一个在影响真菌形态方面明显起作用。确切地说，如在实例1中，在1015菌株中去除含有FungiSNP_18的基因的不含SNP形式或在11414菌株中去除含有FungiSNP_18的基因产生最显著的表型，其中在浸没式培养条件下，所述菌株具有球粒样形态。此外，如图16中所示，在所有条件下，缺失FungiSNP18和FungiSNP40基因导致紧密的形态。此数据可能指示SNP不是功能缺失突变，前提是缺失表型比SNP本身更显著(对形态的影响更强)。因此，似乎改变这些基因的表达可以对于在发酵槽中生长合乎需要的方式来影响形态。

有趣的是，1015菌株中含有FungiSNP_18的基因的不含SNP形式的缺失在所得变体1015菌株中产生负孢子形成表型，使得所述变体1015菌株失去产孢的能力(参见图17)。在其中去除FungiSNP_18基因的11414菌株中未观察到孢子形成的损失。鉴于11414和1015菌株的遗传背景除存在于表3和4中的SNP以外是相同的，此表明在11414遗传背景中来自表3或4的SNP的一个、全部或一些组合的存在足以修复在去除FungiSNP_18时产生的负孢子形成表型。换句话说，存在其它突变(SNP)，其针对在不存在SNP18活性的情况下以上位方式起作用而维持生产菌株中的孢子形成。

应注意的是，在分别通过去除FungiSNP_9、FungiSNP_12或FungiSNP_40或其不含SNP形式而产生的变体11414或1015菌株中未观察到孢子形成的损失。

应进一步注意的是，对于4个基因中的每一个，在浸没式培养条件下所观察到的形态表型比在实例1中更显著，这可能归因于实验设计，其中成功的转化体基本上显示缺失表型。此外，11414菌株中的表型也更显著，这可能归因于此菌株相对于1015基础菌株中所存在的其它SNP中的一或多个对表型的贡献。

实例3：丝状真菌的HTP基因组工程改造：通过改变基因表达来改变丝状真菌细胞形态

此实例表明在丝状真菌细胞中使用自动化HTP PROSWP方法，以便测试调节实例1和2中所鉴别的FungiSNP_9、FungiSNP_12、FungiSNP_18和FungiSNP_40基因的表达的作用，所述基因被认为在控制丝状真菌形态中起作用。

在此实例中，通过使用本文所描述的PROSWP方法用来自表2的四个启动子中的一个替换标注原生启动子，在黑曲霉1015基础菌株和黑曲霉11414生产菌株中调节实例1和2中所鉴别的FungiSNP_18基因(即SEQ ID NO:7)的表达。更具体地，对于每个FungiSNP的每个菌株(即，1015亲本菌株或11414亲本菌株)，产生一组(4)变体或突变菌株，其中第1变体菌株表达第一构筑体，所述构筑体包含在表2中所描述的srp8p启动子的控制下的所述候选FungiSNP(FungiSNP_9(SEQ ID NO:5)；_12(SEQ ID NO:6)；_18(SEQ ID NO:7)；_40(SEQ IDNO:8))基因，第2变体菌株具有在表2中所描述的amy8p启动子的控制下的所述候选FungiSNP基因，第3变体菌株具有在表2中所描述的man8p启动子的控制下的所述候选FungiSNP基因，并且第4变体菌株具有在表2中所描述的mbfAp启动子的控制下的所述候选FungiSNP基因。用于产生变体的构筑体中的每一个还包含侧接候选FungiSNP基因的序列和用以引导构筑体整合到对应的候选FungiSNP的基因座中的启动子。在此实例中使用的二分构筑体设计和整合方案的一般描述在图18中展示。

在其产生之后，将用于产生(4)变体菌株的每个候选FungiSNP的每个构筑体单独转化为产生黑曲霉1015基础菌株以及黑曲霉11414生产菌株这两种菌株的原生质体。培养两种菌株的原生质体，将其转换成原生质体，进行转化和筛选，以使用如上文实例中所描述的表型和/或基于序列的筛选来选择基本上同核体的原生质体。因此，如一般在图3中所描绘，每个单独构筑体的转化导致每种候选FungiSNP的亲本菌株中的每一种产生4个变体或突变菌株。然后观察这些菌株中的每一种的形态表型，并且将其与包含在所述基因的原生启动子的控制下所鉴别的基因的突变菌株的形态表型进行比较。接着测定所鉴别的基因中的每一个的理想表达水平。

结果

总的来说，用来自表2的不同启动子对每个形态控制基因目标(即，FungiSNP_9、_12、_18和_40)进行启动子交换揭露了控制这些基因的表达影响形态(参见图19)。在弱manB启动子下含有SNP18的菌株具有比含有其它启动子组合的菌株更紧密的菌落形态。在渗透应激下，SNP18控制的影响比在低pH值下更显著。此外，在弱manB启动子下含有SNP40的菌株与在所测试的所有生长条件下含有其它启动子组合的菌株相比对菌落形态具有强烈影响。

如图20中所示，用来自表2的不同启动子对形态控制基因目标12(FungiSNP_12；SEQ ID NO:6)进行启动子交换揭露了强度较低的启动子在菌丝中产生黄色色素和在菌落边缘观察到的一些形态改变。黄色色素的存在指示变体或突变菌株正在经历代谢应激。

此外，用来自表2的不同启动子对形态控制基因目标18(FungiSNP_18；SEQ ID NO:7)进行启动子交换揭露了用两个较弱的启动子控制此基因的表达影响形态(参见图9、11和21)。例如，含有manB融合体和amyB融合体的菌株保留了多个顶端球粒表型，而具有较高表达srpB和mbfA的菌株缺乏多个顶端表型而显示异常隆起(参见图9)。图11中的图像是在30℃下在柠檬酸生产培养基中生长24小时的菌株的图像。图9中的图像是在30℃下在柠檬酸生产培养基中生长48小时的亲本11414菌株以及表达各种非原生启动子-FungiSNP_18融合体的11414菌株。当使其培育168小时时，具有较高表达启动子的菌株以及亲本菌株对照都含有丝状菌丝。使具有来自启动子融合体amyB和manB的较低表达水平的菌株保持粒状。应注意的是，如图21中所示，当通过较弱启动子驱动时，SNP_18在基础菌株中具有比在生产菌株中更严重的形态表型。

类似于来自实例2的缺失实验的结果，降低1015菌株中的FungiSNP_18基因的表达导致细胞经历如图12中所示的孢子形成的损失。在11414突变菌株中未观察到孢子形成的损失。鉴于11414和1015菌株的遗传背景除存在于表3和4中的SNP以外是相同的，此表明在11414遗传背景中来自表3或4的SNP的一个、全部或一些组合的存在足以修复在减少FungiSNP_18的表达时产生的负孢子形成表型。

实例4：检验不具有螯合剂的浸没式培养物中的形态突变体丝状真菌菌株的生长

此实例表明表达FungiSNP_18基因的黑曲霉菌株在较低表达启动子(即，man8p启动子)的控制下，在浸没式培养条件下在包含不同含量的锰和缺乏螯合剂的CAP培养基中以球粒形态生长的能力。

黑曲霉的柠檬酸生产菌株的形态对多种因素敏感，包括锰(Mn

因此，在此实例中，在man8p启动子(SEQ ID NO:1)以及黑曲霉11414和1015亲本菌株的控制下，包含FungiSNP_18基因的黑曲霉11414和1015突变菌株在浸没式培养条件下在含有不同含量Mn2+并且缺乏螯合剂的培养基中生长，以便确定man8p-FungiSNP_18融合体是否赋予所得菌株在存在Mn2+的情况下维持球粒形态的能力。

如以上实例中所描述产生包含man8p-FungiSNP_18融合体基因的突变体11414和1015菌株。此外，使突变菌株以及亲本菌株在不补充Mn

实例5：丝状真菌的HTP基因组工程改造：影响丝状真菌形态的基因的确认

此实例表明SNPSWAP方法在丝状真菌黑曲霉中的用途，以便证实曲霉nikA基因在渗透反应路径中起作用，并且可能影响真菌细胞形态以及有助于柠檬酸产生。另外，此实例用于确认表4中的FungiSNP_18是曲霉nikA，其为粗糙脉孢菌nik1的黑曲霉直系同源物。

方法

在此实例中，产生、转化来自黑曲霉基础菌株(即，ATCC 1015)和生产菌株(即，ATCC11414)的原生质体，并且使其经历如实例1和2018年6月6日提交的2018/226900中所描述的SNPSWP，其以引用的方式并入本文中。综上所述，将由基础菌株产生的原生质体用单一构筑体转化，所述单一构筑体含有由与侧接基础菌株中的nikA基因的基因组序列互补的序列侧接的可选标记基因(即，pyrG)，以便引导标记基因整合到基础菌株基因组中，或用如实例1中所描述的两个构筑体(“分裂-标记物构筑体”)共转化。如实例1中所描述，两个构筑体中的每一个含有可选标记物(即，图4和5中的pyrG)的重叠部分，并且由如图4和5中所示的含有SNP18点突变(即，图22中的nikA

此外，为了检验生产菌株基因组背景中野生型nikA的影响(参见图23A-B)，使用具有不包含侧接直接重复序列部分的SNP18点突变和序列的直接重复序列的分裂标记物构筑体将野生型nikA基因引入到由生产菌株(即，黑曲霉ATCC 11414)产生的原生质体，以便引导在nikA基因座处的生产菌株基因组中的整合。

柠檬酸生产

野生型ATCC 1015菌株、具有SNP18突变(即，nikA

渗透应激反应

对于显微镜检查，将野生型ATCC 1015菌株、具有SNP18突变(即，nikA

为了检查对培养盘、野生型ATCC 1015菌株、具有SNP18突变(即，nikA

结果

关于渗透应激响应，如图22所示，经由显微术，nikA基因的突变导致菌丝顶端细胞增加，其中nikA的缺失导致最大增加。在含有具有pH染料指示剂的基本培养基的培养盘上检验的菌株出人意料地显示，在所测试的条件下，缺失菌株产生最多的柠檬酸，所述pH染料指示剂使对应于柠檬酸产生的pH下降可视化。此最有可能归因于这些菌株中所观察到的菌丝顶端细胞的增加。相比之下，当所测试的菌株经历渗透应激时(图22的右侧)，缺失菌株形成较小的菌落，并且不再观察到柠檬酸产生的增加。有趣的是，点突变导致nikA活性降低，同时维持对渗透应激起反应的能力。此显示降低nikA的活性(通过降低基因表达或突变)引起所需形态变化，同时维持对渗透应激起反应的能力。然而，此数据还显示，nikA的缺失可改进不使细胞处于渗透应激下的发酵。

关于柠檬酸生产，如图23A-B所示，基础菌株中的nikA/sln1基因(即，SNP18；SEQID NO:7)的点突变足以在发酵过程中导致柠檬酸效价增加33％。此增加似乎是形态变化的结果，产生较大数目的菌丝顶端细胞。

本发明的其它编号实施例

本发明涵盖的其它主题在以下编号实施例中进行陈述：

1.一种衍生自亲本菌株的丝状真菌的变异菌株，其中所述变异菌株的细胞当在浸没培养物中生长时，与所述亲本菌株的细胞相比，具有非菌丝体成球粒表型，这是由于所述变异菌株具有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae/S.cerevisiae)SLN1基因或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa/N.crassa)nik1基因的黑曲霉(Aspergillus niger/A.niger)直系同源物中的遗传变异，使得所述变异菌株的细胞当在浸没培养条件下生长时，与所述亲本菌株的细胞相比，产生酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的功能黑曲霉直系同源物的量减少，和/或其较弱活性形式。

2.根据实施例1所述的变异菌株，其中所述变异菌株当在非浸没生长条件下生长时，与所述亲本菌株相比，正常产孢。

3.根据实施例1或2所述的变异菌株，其中所述遗传变异包含：用与原生启动子相比更弱地表达酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物的基因的启动子，置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的原生启动子。

4.根据实施例3所述的变异菌株，其中更弱地表达酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物的基因的启动子选自amyB启动子或manB启动子。

5.根据实施例3或4所述的变异菌株，其中更弱地表达酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物的基因的启动子选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的启动子。

6.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其中所述遗传变异包含：用酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的突变黑曲霉直系同源物置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的原生形式，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的所述突变黑曲霉直系同源物编码酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的突变黑曲霉直系同源物。

7.根据实施例6所述的变异菌株，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的所述突变黑曲霉直系同源物包含单核苷酸多态性。

8.根据实施例6或7所述的变异菌株，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的所述突变黑曲霉直系同源物包含SEQ ID NO:7的核序列。

9.根据实施例1或2所述的变异菌株，其中所述遗传变异包含：用可选标记基因置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的原生形式，从而从变异菌株的基因组去除酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的原生形式。

10.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其进一步包含破坏其中酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物为一组分的信号传导级联内的一或多个基因。

11.根据实施例10所述的变异菌株，其中所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。

12.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其进一步包含破坏选自具有SEQID NO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的基因的不含SNP的形式的一或多个基因。

13.根据实施例10-12中任一项所述的变异体，其中所述破坏选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。

14.根据实施例13所述的变异体，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。

15.根据实施例13或14所述的变异菌株，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的启动子。

16.根据实施例13所述的变异体，其中所述一或多个基因的突变形式选自核酸序列SEQ ID NO:5、6或8。

17.根据以上实施例中任一项所述的变异体，其中所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

18.根据实施例17所述的变异体，其中所述比色标记基因为aygA基因。

19.根据实施例17所述的变异体，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。

20.根据实施例17所述的变异体，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。

21.根据实施例17所述的变异体，其中所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。

22.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

23.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

24.一种丝状真菌宿主细胞，其包含可操作地连接于调节所述宿主细胞的形态的基因的启动子，其中所述启动子与所述基因异源，其中所述启动子具有选自由SEQ IDNO.1-4组成的群组的核序列。

25.根据实施例24所述的丝状真菌宿主细胞，其中与不具有可操作地连接到调节所述宿主细胞的形态的所述基因的所述启动子的参考丝状真菌宿主细胞相比，所述丝状真菌宿主细胞在发酵培养基中在浸没培养条件下生长时具有非菌丝体球粒形态。

26.根据实施例25所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述发酵培养基包含至少14ppb的锰。

27.根据实施例25或26所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述发酵培养基不含螯合剂。

28.根据实施例24-27中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞产生的所关注产物的量至少等于由不具有可操作地连接到调节所述宿主细胞的形态的所述基因的所述启动子的所述参考丝状真菌宿主细胞产生的量。

29.根据实施例24-28中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中调节形态的所述基因选自酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物、具有核酸序列SEQID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。

30.根据实施例24-29中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中调节形态的所述基因为所述基因的野生型或突变形式。

31.根据实施例24-30中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中调节形态的所述基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物，并且所述启动子选自SEQ ID NO:1或2。

32.根据实施例24-30中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中调节形态的所述基因为SEQ ID NO:7。

33.根据实施例24-32中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

34.根据实施例24-33中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

35.一种发酵培养液，其包含至少14ppb的锰和包含非菌丝体球粒表型的丝状真菌细胞，其中所述培养液不含螯合剂，并且其中所述丝状真菌包含酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的遗传变异黑曲霉直系同源物。

36.根据实施例35所述的发酵培养液，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的遗传变异黑曲霉直系同源物包含可操作地连接于酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的异源启动子。

37.根据实施例36所述的发酵培养液，其中所述异源启动子选自SEQ ID NO:1或2。

38.根据实施例35-37中任一项所述的发酵培养液，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的遗传变异黑曲霉直系同源物包含突变。

39.根据实施例38所述的发酵培养液，其中SNP中的突变。

40.根据实施例38或39所述的发酵培养液，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物具有SEQ ID NO:7的核酸序列。

41.根据实施例35-40中任一项所述的发酵培养液，其进一步包含破坏其中酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物为一组分的信号传导级联内的一或多个基因，其中所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。

42.根据实施例35-40中任一项所述的发酵培养液，其进一步包含破坏选自由具有SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的基因的不含SNP的形式组成的群组的一或多个基因。

43.根据实施例35-42中任一项所述的发酵培养液，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

44.根据实施例35-43中任一项所述的发酵培养液，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

45.一种用于产生启动子交换丝状真菌菌株库的方法，其包含以下步骤：

a.提供在形态上对基础丝状真菌菌株起作用的一或多个靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基础丝状真菌菌株中展现出不同表达谱的多种启动子；以及

b.对所述基础丝状真菌菌株的基因组进行工程改造，借此创建包含多种个别丝状真菌菌株的初始启动子交换丝状真菌菌株库，所述多种个别丝状真菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含来自所述启动子梯的可操作地连接到在形态上对所述基础丝状真菌菌株起作用的所述一或多个靶基因中的一个的启动子中的一或多个。

46.根据实施例45所述的方法，其中所述启动子梯包含见于表2中的启动子。

47.根据实施例45或46所述的方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因包含破坏。

48.根据实施例47所述的方法，其中所述破坏为单核苷酸多态性(SNP)、错义突变、无义突变、缺失和/或插入。

49.根据实施例45-48中任一项所述的方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因选自酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。

50.根据实施例45-49中任一项所述的方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。

51.根据实施例45-50中任一项所述的方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因为由SEQ ID NO:7表示的基因。

52.根据实施例45-51中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌菌株选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

53.根据实施例45-52中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌菌株为黑曲霉菌株。

54.一种用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其包含以下步骤：

a.提供在形态上对基础丝状真菌菌株起作用的多个靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基础丝状真菌菌株中展现出不同表达谱的多种启动子；

b.对所述基础丝状真菌菌株的基因组进行工程改造，借此创建包含多种个别丝状真菌菌株的初始启动子交换丝状真菌菌株库，所述多种个别丝状真菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含来自所述启动子梯的可操作地连接到在形态上对所述基础丝状真菌菌株起作用的靶基因中的一个的启动子中的一或多个；

c.针对优于参考丝状真菌菌株的形态表型改良来筛选和选择所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的个别丝状真菌菌株，借此鉴别赋予形态表型改良的独特基因变异；

d.提供各自包含来自基因变异的独特基因变异组合的后续多种丝状真菌微生物，所述基因变异存在于先前步骤中筛选的至少两种个别丝状真菌菌株中，借此创建后续启动子交换丝状真菌菌株库；

e.针对优于所述参考丝状真菌菌株的形态表型改良来筛选和选择所述后续启动子交换丝状真菌菌株库的个别丝状真菌菌株，借此鉴别赋予额外形态表型改良的独特基因变异组合；以及

f.以线性或非线性方式重复步骤d)-e)一次或多次，直至相较于所述生产丝状真菌菌株的形态表型，丝状真菌菌株的形态表型展现出所期望改良水平，其中每次后续迭代创建了新的微生物菌株的启动子交换丝状真菌菌株库，其中新的库中的每种菌株包含基因变异，所述基因变异为选自先前库的至少两种个别丝状真菌菌株当中的基因变异的组合。

55.根据实施例54所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库是所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库。

56.根据实施例54所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库是所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库的子集。

57.根据实施例54所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库为先前启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库。

58.根据实施例54所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库为先前启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库的子集。

59.根据实施例54-58中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述启动子梯包含见于表2中的启动子。

60.根据实施例54-59中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因包含破坏。

61.根据实施例54-60中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述破坏为SNP、错义突变、无义突变、缺失和/或插入。

62.根据实施例54-60中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因选自酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。

63.根据实施例62所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物包含SEQ ID NO:7的序列。

64.根据实施例54-63中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述丝状真菌菌株选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

65.根据实施例54-64中任一项所述的用于生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述丝状真菌菌株为黑曲霉菌株。

66.根据实施例54-65中任一项所述的用于生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述形态表型改良包含赋予在浸没培养条件下生长时形成非菌丝体球粒形态的能力。

67.根据实施例66所述的用于生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述浸没培养条件包含培养基，其包含至少14ppb的锰并且不含螯合剂。

68.一种丝状真菌宿主细胞，其包含酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的宿主细胞的直系同源物的异源修饰，其中由酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的经修饰的直系同源物编码的蛋白质相对于不具有异源修饰的亲本丝状真菌宿主细胞，具有降低的活性和/或减少的表达。

69.根据实施例68所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞在发酵培养基中在浸没培养条件下生长时具有非菌丝体球粒形态。

70.根据实施例68或69所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述异源修饰包含：用与原生启动子相比更弱地表达酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物的启动子，置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物的原生启动子。

71.根据实施例68-70中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述异源修饰包含：用酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物的突变形式置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物。

72.根据实施例71所述的丝状真菌宿主细胞，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物的突变形式包含单核苷酸多态性(SNP)。

73.根据实施例68或69所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述异源修饰包含：用可选标记基因置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物，从而从丝状真菌宿主细胞的基因组去除酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的原生直系同源物。

74.根据实施例68-73中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其进一步包含异源修饰其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的直系同源物为一组分的生物化学路径内的一或多个基因。

75.根据实施例74所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述一或多个基因选自酿酒酵母Ssk1基因的直系同源物、酿酒酵母Ssk2基因的直系同源物、酿酒酵母Ypd1基因的直系同源物、酿酒酵母Skn7基因的直系同源物或其任何组合。

76.根据实施例68或69所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

77.根据实施例68或69所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

78.根据实施例77所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述异源修饰包含：用与原生启动子相比更弱地表达酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的启动子，置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的原生启动子。

79.根据实施例78所述的丝状真菌宿主细胞，其中更弱地表达酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物的基因的启动子选自amyB启动子或manB启动子。

80.根据实施例78所述的丝状真菌宿主细胞，其中更弱地表达酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的黑曲霉直系同源物的基因的启动子选自SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的启动子。

81.根据实施例77或78所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述异源修饰包含：用酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的突变形式置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。

82.根据实施例81所述的丝状真菌宿主细胞，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物的突变形式包含SNP。

83.根据实施例82所述的丝状真菌宿主细胞，其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的突变黑曲霉直系同源物包含SEQ ID NO:7的序列。

84.根据实施例77所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述异源修饰包含：用可选标记基因置换酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物，从而从丝状真菌宿主细胞的基因组去除酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的原生黑曲霉直系同源物。

85.根据实施例77所述的丝状真菌宿主细胞，其进一步包含异源修饰其中酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物为一组分的生物化学路径内的一或多个基因。

86.根据实施例85所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述一或多个基因选自具有SEQID NO.9的酿酒酵母Ypd1基因的黑曲霉直系同源物、具有SEQ ID NO.10的酿酒酵母Ssk1基因的黑曲霉直系同源物、具有SEQ ID NO.11或12的酿酒酵母Skn7基因的黑曲霉直系同源物、具有SEQ ID NO.13的酿酒酵母Ssk2基因的黑曲霉直系同源物，或其任何组合。

87.根据实施例77所述的丝状真菌宿主细胞，其进一步包含破坏选自具有SEQ IDNO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的基因的不含SNP的形式的一或多个基因。

88.根据实施例87所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述破坏选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。

89.根据实施例88所述的丝状真菌宿主细胞，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。

90.根据实施例88所述的丝状真菌宿主细胞，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的启动子。

91.根据实施例88所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述一或多个基因的突变形式选自SEQ ID NO:5、6或8。

92.根据实施例73、84或88所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

93.根据实施例92所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述比色标记基因为aygA基因。

94.根据实施例92所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。

95.根据实施例92所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。

96.根据实施例92所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。

97.一种衍生自亲本菌株的丝状真菌的变异菌株，其中所述变异菌株的细胞当在浸没培养物中生长时，与所述亲本菌株的细胞相比，具有非菌丝体成球粒表型，这是由于所述变异菌株具有渗透反应路径的一或多个基因中的遗传变异，其使得当在浸没培养条件下生长时，与所述亲本菌株的细胞相比，所述变异菌株的细胞产生减少量的由所述渗透反应路径的所述一或多个基因编码的功能蛋白，和/或其活性较低的形式。

98.根据实施例97所述的变异菌株，其中当在非浸没生长条件下生长时，与所述亲本菌株相比，所述变异菌株正常产孢。

99.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

100.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌为黑曲霉(Aspergillus niger/A.niger)或其有性世代或无性世代。

101.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。

102.根据实施例100所述的变异菌株，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。

103.根据实施例100所述的变异菌株，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。

104.根据实施例100所述的变异菌株，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae/S.cerevisiae)SLN1基因或粗糙脉孢菌(Neurospora crassa/N.crassa)nik1基因的黑曲霉直系同源物。

105.根据实施例104所述的变异体，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。

106.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其中所述遗传变异选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。

107.根据实施例106所述的变异菌株，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。

108.根据实施例106或107所述的变异菌株，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。

109.根据实施例106所述的变异菌株，其中所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

110.根据实施例109所述的变异菌株，其中所述比色标记基因为aygA基因。

111.根据实施例109所述的变异菌株，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。

112.根据实施例109所述的变异菌株，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。

113.根据实施例109所述的变异菌株，其中所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。

114.根据实施例106所述的变异菌株，其中渗透应激反应路径的一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。

115.根据实施例114所述的变异菌株，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因的突变形式为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物的突变形式为SEQID NO.7的核酸序列。

116.根据以上实施例中任一项所述的变异菌株，其进一步包含选自具有SEQ IDNO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的基因的不含SNP的形式的一或多个基因的遗传变异。

117.根据实施例116所述的变异菌株，其中所述遗传变异选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。

118.根据实施例117所述的变异菌株，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。

119.根据实施例117或118所述的变异菌株，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。

120.根据实施例117所述的变异菌株，其中所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

121.根据实施例120所述的变异菌株，其中所述比色标记基因为aygA基因。

122.根据实施例120所述的变异菌株，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。

123.根据实施例120所述的变异菌株，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。

124.根据实施例120所述的变异菌株，其中所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。

125.根据实施例117所述的变异菌株，其中所述一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。

126.根据实施例125所述的变异菌株，其中所述一或多个基因的突变形式为选自SEQ ID NO:5、6或8的核酸序列。

127.一种丝状真菌宿主细胞，其包含可操作地连接于调节所述宿主细胞的形态的基因的启动子，其中所述启动子与所述基因异源，其中所述启动子具有选自由SEQ IDNO.1-4组成的群组的核序列。

128.根据实施例127所述的丝状真菌宿主细胞，其中与不具有可操作地连接到调节所述宿主细胞的形态的所述基因的所述启动子的参考丝状真菌宿主细胞相比，所述丝状真菌宿主细胞在发酵培养基中在浸没培养条件下生长时具有非菌丝体球粒形态。

129.根据实施例128所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述发酵培养基包含至少14ppb的锰。

130.根据实施例127或128所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述发酵培养基不含螯合剂。

131.根据实施例127-130中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞产生的所关注产物的量至少等于由不具有可操作地连接到调节所述宿主细胞的形态的所述基因的所述启动子的所述参考丝状真菌宿主细胞产生的量。

132.根据实施例131所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述所关注产物为柠檬酸或所关注的酶。

133.根据实施例127-132中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中调节形态的所述基因选自渗透反应路径的一或多个基因、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。

134.根据实施例127-133中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中调节形态的所述基因为所述基因的野生型或突变形式。

135.根据实施例127-134中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

136.根据实施例127-135中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

137.根据实施例133-136中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。

138.根据实施例136所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。

139.根据实施例136所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。

140.根据实施例136所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。

141.根据实施例140所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。

142.根据实施例140所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列。

143.根据实施例127-142中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述启动子选自SEQ ID NO:1或2的核酸序列。

144.一种丝状真菌宿主细胞，其包含所述宿主细胞的渗透反应路径的一或多个基因的异源修饰，其中由经修饰的一或多个基因编码的蛋白质相对于不具有所述宿主细胞的渗透反应路径的所述经修饰的一或多个基因的亲本丝状真菌宿主细胞，具有降低的活性和/或减少的表达。

145.根据实施例144所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞在发酵培养基中在浸没培养条件下生长时具有非菌丝体球粒形态。

146.根据实施例144或145所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

147.根据实施例144或145所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

148.根据实施例144-147中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。

149.根据实施例147所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。

150.根据实施例147所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。

151.根据实施例147所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。

152.根据实施例151所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。

153.根据实施例144-152中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述异源修饰选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。

154.根据实施例153所述的丝状真菌宿主细胞，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。

155.根据实施例153或实施例154所述的丝状真菌宿主细胞，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。

156.根据实施例153所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

157.根据实施例156所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述比色标记基因为aygA基因。

158.根据实施例156所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。

159.根据实施例156所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。

160.根据实施例156所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。

161.根据实施例153所述的丝状真菌宿主细胞，其中渗透应激反应路径的一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。

162.根据实施例161所述的丝状真菌宿主细胞，其中渗透应激路径的一或多个基因是所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物的突变形式为SEQID NO.7的核酸序列。

163.根据实施例144-162中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其进一步包含选自具有SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的核酸序列的基因的不含SNP的形式的一或多个基因的遗传变异。

164.根据实施例163所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述遗传变异选自：用与原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的启动子置换所述一或多个基因的所述原生启动子、用所述一或多个基因的突变形式置换所述一或多个基因、用可选标记物置换所述一或多个基因，或其组合。

165.根据实施例164所述的丝状真菌宿主细胞，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子选自amyB启动子或manB启动子。

166.根据实施例164或实施例165所述的丝状真菌宿主细胞，其中与所述原生启动子相比较弱地表达所述一或多个基因的所述启动子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。

167.根据实施例164所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述可选标记物选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因、抗生素抗性基因或定向标记基因。

168.根据实施例167所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述比色标记基因为aygA基因。

169.根据实施例167所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。

170.根据实施例167所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因或硝酸还原酶基因(niaD)。

171.根据实施例167所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述抗生素抗性基因为ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。

172.根据实施例164所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述一或多个基因的突变形式包含单核苷酸多态性。

173.根据实施例172所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述一或多个基因的突变形式为选自SEQ ID NO:5、6或8的核酸序列。

174.一种发酵培养液，其包含至少14ppb的锰和包含非菌丝体球粒表型的丝状真菌细胞，其中所述培养液不含螯合剂，并且其中所述丝状真菌细胞包含来自所述丝状真菌细胞的渗透反应路径的一或多个遗传变异基因。

175.根据实施例174所述的发酵培养液，其中来自所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因可操作地连接到异源启动子。

176.根据实施例175所述的发酵培养液，其中所述异源启动子选自SEQ ID NO:1或2。

177.根据实施例174-176中任一项所述的发酵培养液，其中来自所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因包含突变。

178.根据实施例177所述的发酵培养液，其中SNP中的突变。

179.根据实施例174-178中任一项所述的发酵培养液，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

180.根据实施例174-178中任一项所述的发酵培养液，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

181.根据实施例174-180中任一项所述的发酵培养液，其中所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的遗传变异丝状真菌直系同源物。

182.根据实施例180所述的发酵培养液，其中所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的遗传变异黑曲霉直系同源物。

183.根据实施例180所述的发酵培养液，其中所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为具有选自SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因的遗传变异形式。

184.根据实施例180所述的发酵培养液，其中所述渗透反应路径的所述一或多个遗传变异基因为所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的遗传变异黑曲霉直系同源物。

185.根据实施例184所述的发酵培养液，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述遗传变异黑曲霉直系同源物为具有SEQ ID NO:7的核酸序列的基因。

186.一种用于产生启动子交换丝状真菌菌株库的方法，其包含以下步骤：

a.提供在形态上对基础丝状真菌菌株起作用的一或多个靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基础丝状真菌菌株中展现出不同表达谱的多种启动子；以及

b.对所述基础丝状真菌菌株的基因组进行工程改造，借此创建包含多种个别丝状真菌菌株的初始启动子交换丝状真菌菌株库，所述多种个别丝状真菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含来自所述启动子梯的可操作地连接到在渗透应激反应上对所述基础丝状真菌菌株起作用的所述一或多个靶基因中的一个的启动子中的一或多个。

187.根据实施例186所述的方法，其中所述启动子梯包含见于表2中的启动子。

188.根据实施例186或187所述的方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因包含破坏。

189.根据实施例188所述的方法，其中所述破坏为SNP、错义突变、无义突变、缺失和/或插入。

190.根据实施例186-189中任一项所述的方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因选自渗透反应路径的一或多个基因、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。

191.根据实施例180-190中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

192.根据实施例180-190中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

193.根据实施例190-192中任一项所述的方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。

194.根据实施例192所述的方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。

195.根据实施例192所述的方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。

196.根据实施例192所述的方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。

197.根据实施例196所述的方法，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。

198.根据实施例192所述的方法，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列。

199.一种用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其包含以下步骤：

a.提供在形态上对基础丝状真菌菌株起作用的多个靶基因，和启动子梯，其中所述启动子梯包含在所述基础丝状真菌菌株中展现出不同表达谱的多种启动子；

b.对所述基础丝状真菌菌株的基因组进行工程改造，借此创建包含多种个别丝状真菌菌株的初始启动子交换丝状真菌菌株库，所述多种个别丝状真菌菌株的每种菌株内发现有独特基因变异，其中所述独特基因变异中的每一种包含来自所述启动子梯的可操作地连接到在形态上对所述基础丝状真菌菌株起作用的所述多个靶基因中的一个的启动子中的一或多个；

c.针对优于参考丝状真菌菌株的形态表型改良来筛选和选择所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的个别丝状真菌菌株，借此鉴别赋予形态表型改良的独特基因变异；

d.提供各自包含来自基因变异的独特基因变异组合的后续多种丝状真菌微生物，所述基因变异存在于先前步骤中筛选的至少两种个别丝状真菌菌株中，借此创建后续启动子交换丝状真菌菌株库；

e.针对优于所述参考丝状真菌菌株的形态表型改良来筛选和选择所述后续启动子交换丝状真菌菌株库的个别丝状真菌菌株，借此鉴别赋予额外形态表型改良的独特基因变异组合；以及

f.以线性或非线性方式重复步骤d)-e)一次或多次，直至相较于所述生产丝状真菌菌株的形态表型，丝状真菌菌株的形态表型展现出所期望改良水平，其中每次后续迭代创建了新的微生物菌株的启动子交换丝状真菌菌株库，其中新的库中的每种菌株包含基因变异，所述基因变异为选自先前库的至少两种个别丝状真菌菌株当中的基因变异的组合。

200.根据实施例199所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库是所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库。

201.根据实施例199所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库是所述初始启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库的子集。

202.根据实施例199所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库为先前启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库。

203.根据实施例199所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述后续启动子交换丝状真菌菌株库为先前启动子交换丝状真菌菌株库的完整组合库的子集。

204.根据实施例199-203中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述启动子梯包含见于表2中的启动子。

205.根据实施例199-204中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因包含破坏。

206.根据实施例199-205中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述破坏为SNP、错义突变、无义突变、缺失和/或插入。

207.根据实施例199-205中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中在形态中起作用的所述一或多个靶基因选自渗透反应路径的一或多个基因、具有核酸序列SEQ ID NO:5、6、8或其任何组合的基因的不含SNP的形式。

208.根据实施例199-207中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述丝状真菌宿主细胞选自：棉霉属、枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢霉属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、隐丛赤壳属、隐球酵母属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内斯菌属、镰孢菌属、赤霉属、胶霉属、腐殖菌属、肉座菌属、毁丝菌属(例如嗜热毁丝霉)、白霉菌属、红霉菌属、青霉属、柄孢壳属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、梨胞霉属、根毛霉属、根霉属、裂殖菌属、革节孢属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳霉属、栓菌属、弯颈霉菌属、木霉属、轮枝孢属、小包脚菇属物种，或其有性世代或无性世代，以及其同义词或分类等效物。

209.根据实施例199-207中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述丝状真菌宿主细胞为黑曲霉或其有性世代或无性世代。

210.根据实施例207-209中任一项所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的丝状真菌直系同源物。

211.根据实施例209所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为见于表7中的酵母渗透反应路径基因的黑曲霉直系同源物。

212.根据实施例209所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因选自具有SEQ ID NO:9、10、11、12、13或其任何组合的核酸序列的基因。

213.根据实施例209所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述渗透反应路径的所述一或多个基因为酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌nik1基因的黑曲霉直系同源物。

214.根据实施例213所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列的不含SNP的形式。

215.根据实施例213所述的用于改良生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述酿酒酵母SLN1基因或所述粗糙脉孢菌nik1基因的所述黑曲霉直系同源物为SEQ ID NO:7的核酸序列。

216.根据实施例199-215中任一项所述的用于生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述形态表型改良包含赋予在浸没培养条件下生长时形成非菌丝体球粒形态的能力。

217.根据实施例216所述的用于生产丝状真菌菌株的形态表型的启动子交换方法，其中所述浸没培养条件包含培养基，其包含至少14ppb的锰并且不含螯合剂。

218.根据实施例1-23中任一项所述的变异菌株，其中在浸没培养条件下生长时，相比于由亲本菌株的细胞产生的酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的功能黑曲霉直系同源物的量，由变异菌株产生的酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的功能黑曲霉直系同源物的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

219.根据实施例1-23或218中任一项所述的变异菌株，其中由变异菌株和/或亲本菌株产生的酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的功能黑曲霉直系同源物的量使用定量质谱分析或免疫分析测量，其中所述免疫分析选自Luminex分析、ELISA或定量蛋白质印迹分析。

220.根据实施例1-23中任一项所述的变异菌株，其中在浸没培养条件下生长时，相比于由亲本菌株的细胞产生的酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的功能黑曲霉直系同源物的活性，由变异菌株产生的酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的功能黑曲霉直系同源物的活性减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

221.根据实施例1-23或220中任一项所述的变异菌株，其中由变异菌株和/或亲本菌株产生的酿酒酵母SLN1蛋白质或粗糙脉孢菌Nik1蛋白质的功能黑曲霉直系同源物的活性使用激酶分析测量。

222.根据实施例68到96中任一个的丝状真菌宿主细胞，其中相对于不具有异源修饰的亲本丝状真菌宿主细胞中的酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的直系同源物所编码的蛋白质的表达，酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的经修饰的直系同源物所编码的蛋白质的表达减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

223.根据实施例68到96或222中任一个的丝状真菌宿主细胞，其中丝状真菌宿主细胞和/或不具有异源修饰的亲本丝状真菌宿主细胞中，酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的经修饰的直系同源物，或酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的直系同源物所编码的蛋白质的表达使用定量质谱分析或免疫分析测量，其中所述免疫分析选自Luminex分析、ELISA或定量蛋白质印迹分析。

224.根据实施例68到96中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中相对于不具有异源修饰的亲本丝状真菌宿主细胞中的酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的直系同源物所编码的蛋白质的活性，酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的经修饰的直系同源物所编码的蛋白质的活性减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

225.根据实施例68到96或224中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中丝状真菌宿主细胞和/或不具有异源修饰的亲本丝状真菌宿主细胞中，酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的经修饰的直系同源物，或酿酒酵母SLN1基因或粗糙脉孢菌Nik1基因的直系同源物所编码的蛋白质的活性使用激酶分析测量。

226.根据实施例97-126中任一项所述的变异菌株，其中在浸没培养条件下生长时，相比于由亲本菌株产生的渗透反应路径的一或多个基因所编码的功能蛋白的量，由变异菌株产生的渗透反应路径的一或多个基因所编码的功能蛋白的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

227.根据实施例97-126或226中任一项所述的变异菌株，其中由变异菌株和/或亲本菌株产生的渗透反应路径的一或多个基因所编码的功能蛋白的量使用定量质谱分析或免疫分析测量，其中所述免疫分析选自Luminex分析、ELISA或定量蛋白质印迹分析。

228.根据实施例97-126中任一项所述的变异菌株，其中在浸没培养条件下生长时，相比于由亲本菌株产生的渗透反应路径的一或多个基因所编码的功能蛋白的活性，由变异菌株产生的渗透反应路径的一或多个基因所编码的功能蛋白的活性减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

229.根据实施例97-126或228中任一项所述的变异菌株，其中由变异菌株和/或亲本菌株产生的渗透反应路径的一或多个基因所编码的功能蛋白的活性使用激酶分析测量。

230.根据实施例144到173中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中相对于不具有宿主细胞的渗透反应路径的经修饰的一或多个基因的亲本丝状真菌宿主细胞中的经修饰的一或多个基因所编码的蛋白质的表达，经修饰的一或多个基因所编码的蛋白质的表达减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

231.根据实施例144到173或230中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中丝状真菌宿主细胞和/或不具有宿主细胞的渗透反应路径的经修饰的一或多个基因的亲本丝状真菌宿主细胞中，经修饰的一或多个基因所编码的蛋白质的表达使用定量质谱分析或免疫分析测量，其中所述免疫分析选自Luminex分析、ELISA或定量蛋白质印迹分析。

232.根据实施例144到173中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中相对于不具有宿主细胞的渗透反应路径的经修饰的一或多个基因的亲本丝状真菌宿主细胞中的经修饰的一或多个基因所编码的蛋白质的活性，经修饰的一或多个基因所编码的蛋白质的活性减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

233.根据实施例144到173或232中任一项所述的丝状真菌宿主细胞，其中丝状真菌宿主细胞和/或不具有宿主细胞的渗透反应路径的经修饰的一或多个基因的亲本丝状真菌宿主细胞中，经修饰的一或多个基因所编码的蛋白质的活性使用激酶活性测量。

具有SEQ ID NO识别符的本发明序列

*****

通过引用的方式并入

本文中所引用的所有参考文献、论文、公开、专利、专利公开和专利申请出于所有目的以全文引用的方式并入。

然而，提及本文所引用的任何参考文献、论文、公开、专利、专利公开和专利申请不是并且不应该认为是承认或以任何形式暗示其构成有效现有技术或形成世界上任何国家的公共常识的一部分。

此外，以下特定申请以引用的方式并入本文中：20016年12月30日提交的第15/396,230号美国申请(第US 2017/0159045 A1号美国公开)；2016年12月07日提交的PCT/US2016/065465(WO 2017/100377 A1)；2016年4月27日提交的第15/140,296号美国申请(US2017/0316353 A1)；2017年4月26日提交的PCT/US2017/029725(WO 2017/189784 A1)；2016年12月07日提交的PCT/US2016/065464(WO 2017/100376 A2)；2016年12月07日提交的第62/431,409号美国临时申请；2015年12月07日提交的第62/264,232号美国临时申请；和2016年7月29日提交的第62/368,786号美国临时申请。另外，以下特定申请以引用的方式并入本文中：2017年12月29日提交的PCT/US2017/069086(WO 2018/12607)；2018年6月6日提交的PCT/US2018/036360(WO 2018/226900)；2016年12月30日提交的第62/441,040号美国临时申请和2017年6月6日提交的第62/515,907号美国临时申请。

序列表

<110> 齐默尔根公司(Zymergen Inc.)

K•S•布鲁诺(Bruno, Kenneth S.)

E•谢夫奇克(Szewczyk, Edyta)

S•贾殷(Jain, Sachin)

B•普凡嫩施蒂尔(Pfannenstiel, Brandon)

<120> 操纵涉及信号转导的基因以控制发酵和生产期间的真菌形态

<130> ZYMR-015/01WO 327574-2126

<150> US 62/681,604

<151> 2018-06-06

<160> 79

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 504

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 1

ctgtctccat ccgtattccc cccttcactc tcgtttactc tccgttcctg ctggtcagtc 60

tcttccttga ccgtgtccct cgcttccaac actcgtttcc ttcaatttcc tccccccttt 120

tctctcgttg cccccctcct cccgctccct cccgccatgc gtctcgttcg agattgcctg 180

tatggggggt tattccttaa cacggcgctc ttctcccagc tctcccacgc catcgatatc 240

gatatcagca gtaccagtat gccttccccc cacttcttca atctctttcc cattatatac 300

accactgtct cggcccttgc tttattccgt catccttctc ctctcctaca tacttggacg 360

cagttgcgcc actatatcta agactccatg ccttccattc caacgacata cataaatacc 420

atgaattgac aactgataca catttttatt gtccgtatag gttcaattaa agatgccgcc 480

agtaagacgg cctacgggtc catg 504

<210> 2

<211> 620

<212> DNA

<213> 米曲霉

<400> 2

gaattcatgg tgttttgatc attttaaatt tttatatggc gggtggtggg caactcgctt 60

gcgcgggcaa ctcgcttacc gattacgtta gggctgatat ttacgtaaaa atcgtcaagg 120

gatgcaagac caaagtagta aaaccccgga gtcaacagca tccaagccca agtccttcac 180

ggagaaaccc cagcgtccac atcacgagcg aaggaccacc tctaggcatc ggacgcacca 240

tccaattaga agcagcaaag cgaaacagcc caagaaaaag gtcggcccgt cggccttttc 300

tgcaacgctg atcacgggca gcgatccaac caacaccctc cagagtgact aggggcggaa 360

atttaaaggg attaatttcc actcaaccac aaatcacagt cgtccccggt attgtcctgc 420

agaatgcaat ttaaactctt ctgcgaatcg cttggattcc ccgcccctgg ccgtagagct 480

taaagtatgt cccttgtcga tgcgatgtat cacaacatat aaatactagc aagggatgcc 540

atgcttggag gatagcaacc gacaacatca catcaagctc tcccttctct gaacaataaa 600

ccccacagaa ggcatttatg 620

<210> 3

<211> 1503

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 3

gcttccatgg ttggcagggt cacgtagccg taattatttt cggggaaggt tggaatgcaa 60

tggaaggaga tttccgtagc tagggctttg atcgatgcgg ggagcactgc cggtaggagg 120

tctggggtga atggggtgat atgcaggcgc ttcgtatcgg acggtgtggt cgtcatttgc 180

ccaatagata gttagataga tacctgagta cggtagcagt gcaggtgacg gctaagaagt 240

cggagggaaa aaggtgcagt cacaagcgca ttcagcctaa caagtgtctt tgatactcgg 300

tgagaaacaa acttgagtag aataagacag aaagttcttg tgaatggtca caatgggctt 360

ccaacgaagc atcaagcaga ccctgttgca atagatattc caagaccgaa aaattaatga 420

taggatcagt tattggccga gggattttcc gggccgccaa gaccgggtta tggagatgtg 480

gcgcaggcat gccatcctca gccacaggtt tctgtgacat cccaaaagca ttgatcgaag 540

ttggtataag tttcattcta tctaccatgg tgacaaggaa gtacgggtgt agaaaagaaa 600

aatctggtag gaatagctca gcaacaaatg gcggaatgat tgatgtaaga ctcgatgtat 660

ccactggaac gagatgcaag ttgcaacagc aataaatgga tttcagcctc cattacaatg 720

taacagtcgg gccgatactc agccggagca ggatttggcg ggtgaatagt ggatccggag 780

agaaacgatc aggtaatctt tcgtacggga ccagacccga cccggcctgc tttttagtta 840

ccagctgtta cttgtgtaat ccccgtaaaa cgatcagtaa ctgccattga tcttcctgct 900

cttttccctt attccctttt ccccctttga aacttatttt cttcttcctc ttcatcgctt 960

aactacttaa gtactaggat tctcactcgc cactcttccc caatatctaa aagtagtctt 1020

gctacgaaga tcccttcccc ctacattact cctcctcctt caacacaccc acccccccct 1080

gatccggccc cataccagtc ttcccgcggc taactaaagc ccgcacgtct gatctcatcg 1140

ccgcttccag cttcgacctc agtcgctcac atggccactc ggattcctta gcatcatctc 1200

tttttttccc atcccctccc cgccctacca actgagggtc ctctgaagtg tgctccacat 1260

ttccttccct tcacttattt tggatcctca ttttctttct tcctctgttt cggggcgttc 1320

ttcaacatcg ctacttagtc acttctctcc tctcattacc ggacgggaac ttcgctccct 1380

tctccgcttt cttatccgga ccgcctcttg ccaatctcac catcgatcct aacccgtcat 1440

aatccagtca ctcaacccta ctattgtcga catacacgtc ggttcccatt ctcgttcgag 1500

atg 1503

<210> 4

<211> 1503

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 4

acagtggcca tgaaatccaa tcatttcctt ctggccgccc tcgggcaaga gatagtgccg 60

cagaggtctc tcacagcatc tacatctgcg accgcaacag ccaccaagcg aggcgcacat 120

gagcttgtcc tcctcccatg ccaaagtttg gccctcttcg tttctgtgat gctgaaggaa 180

gtcaaactcg tcgatgatag gaccagatgg tttgtcaagg gtcaacgctt tccatgcctt 240

ctggcaccgg tagtaatgct cttctgcaag ggagacttga cgtttcggat ccgcgggccc 300

cgggacatgc tggaagggat tttctggctc aataccacgt ctgtatttga ccctttccag 360

acagttaatc cgctgcagga gggcgaactg tagctcctcg ttctccttgt agcgcttgat 420

ccagtctttt tggatgttgc acttgcttgg cctatgcttc tcatataatc ttgccctgtc 480

atagagacga cgtctgagat tgtagcgttc gtctttgatc acccggagcc agataggcct 540

gagtatatct gacattagat caaagggtct gtggatagtc tccttcagca tcagcgacgc 600

atgtgactcg catgtcggag agagcttgtg ggtggtcatc tttgatggcg tcctctgctt 660

tcccttgatt ttcgttgatt gtttttcgaa agttaagtct ggaagtcaag agaatccttc 720

tgccagacat tatatttacg tatactgacg tagtagaaac agcgtcagga tgaggacatg 780

gtgtgtgctg gaccacggaa tcatagttca tcagtatatt gggttggaca aataacgctg 840

agcatgtata tgtctttaca cactataaaa gccagcgaac gccaataaaa tagggcatat 900

tgatgtgaaa atatgacacc agttaaaagc agtgtattga ttttatctct cttcacctcg 960

gacctatact accgtataca agactcaact tacttccaga tatagtaata tacaccctat 1020

ggacgaacca gcacaataat tacagccaaa caacaccacc caaatggcat attcctaatc 1080

agcactaagc acaaatacca ctgtcatcac agcataatca ataagaatcc cagacaaccg 1140

actcactctg actcacctta cacaaacccc caagcaaagc gcagcccaga acctcagcca 1200

acaatcgggc aacgtacggg gaaagattgg ccgatccatg atgtcagcag ccctaaccca 1260

aagcggacta gcgcataccg cccctctgac tccgccatcc cagggctcga gaagcttccg 1320

tggcgtcgat ataaattcag cgggccttga acatccctcc ttacgacaca cctcacgcga 1380

tcgattttga cactcacaca ccgccaccct cacatcctcc acccacacca caccccttaa 1440

tcaacccacc atcaccgcta gaacgtctat ctcatcaccg acttctcatc catcttcaaa 1500

atg 1503

<210> 5

<211> 1206

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 5

atgagcttcc gtcaagccct cagacccttc cgtcgcacca tgtccggtga aaagatctac 60

gaaggcgtat tcgccgtcca caaaccccaa ggcgtctcct ccgccgacgt cgtccgcacc 120

ctccaaacgc acttcaaccc ctccacgctc ttcgccccct ggctcgctga cgagcgcgcc 180

cgtcgcgccc gcgaaagcac ctaccagcgc aagcgccgcc gcacccagcg tctcgacgtg 240

aagatcggcc acggaggcac cctcgacccc ctcgcgaccg gcattctcgt cgcgggagtc 300

ggcaagggca cgaaacacct gaacgagttc ctaggatgca cgaagcaata tgagaccgtt 360

gtgctgttcg gcgccgagac agatacctat gatcggctgg ggaaggtggt gcgcaaggcg 420

ccctacgagc atgtgacaag ggagatggtg gagaaggcac tggagcagtt ccgtgggaag 480

attatgcaga ggccgccaat tttctcggcg ctgaaggtga atggcaagaa gctttatgag 540

tatgcccgcg agggcaagga gccgccgatt gagatccaga agaggccggt cgaggtgacg 600

gatttgagga ttgtcgagtg gtacgagcct ggaacgcatg agtttaagtg gcctgaggtt 660

gaggcagacg gggaggagaa ggctgttgcg gagaagttgt tggcgtagga ggatgagttg 720

ccgattgtgg agagggaggc ggatggtgaa ggagaggcct ctgcgaagag aaagtccccg 780

cctgcggagg atgctaagga ggagaaggta gagggtggtg atactgagtc tgctccctcg 840

gctaagaagc agaaggttgc tgatggcgag gctgcgcctg ttgcgccggc cgagcaggag 900

gcgtcggatg ctcccaatgc tgaagccgtg gaatcctcgg aatccaagcc ccagtcccag 960

ccccagccgg ctgcggtgaa gatcaccatg acggtgtcat ctggcttcta tgtgcgctcc 1020

ttggcgcacg atctgggcaa ggcggtcgga agctgcgggc tgatgtcctc gctgatccgg 1080

tctcgtcagg ctcagttcga gcttcacccg gacaaggtgc tcgagtataa ggacctcgag 1140

gccggcgagg aggtctgggg ccccaaggtc cagcgattcc tcgaggactg ggaggagaag 1200

cgactg 1206

<210> 6

<211> 3303

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 6

atgactatcc cactgagtcg actatccacc gtggatccgc ggcaaccagg aattagtggc 60

cataatcggg gcctcttgaa cgccgacgtc gtcccgatca acgacaagca gaaagtcttt 120

cttgccggtt ctggccctcc gtcgccaatg catcgcgtac aacctctgga cggatcgcat 180

ggtccgccca gtgctccagc agtctacgag cagccatggc gccctccgta ctcgtcttct 240

tatgacggac atcccgcgga ccagcgtcgc acatcgaatg ctcctcagcc tgcgctccca 300

ccccacggat acccgatgaa cccaaaccgt gagctgccgc agctcccacc agaagtccca 360

tatggccgac agggcagttt gcctggcccc gtgcataccc ctccagaagc ccccactcct 420

catcccagct ttcgtcctat gaatggaact ccccatgagg ccgcccctca ttcagcaccc 480

cccgactatc gctcacggat gtcttttaca cctcaggagc ctcacagcaa tggggacgct 540

ccgctccccg cccacacgtt acccccgact cagtatccca ctccggttcc gcatttgtcg 600

catactccta cgccgtacga ttcaggtctt tacggaaacc aggcgtacgg gatacgccag 660

cagcgaaagg ccgctcgggc gcaacaggcc tgcgatcagt gccgaacgag aaaggccaag 720

tgcgatgaag gccggcctgc ttgtagccat tgcaaggaga acaacttgat atgtgtttat 780

aaagaagttc cccctcacaa gcaagaaaag gcaacacagc ttcttctgga ccgtatctct 840

cagttggaag acggtctcat cgaaaaaatc gatcgcatta atgcactcca ggtcgagcac 900

acgaatcaac tcactcagct gtatcctcgg ttgaaagagg ctaaagcgat aagcaccaag 960

gagacgacag agaagcaagc cattcctcgg atatcgaaag cggatatacc tgatatctta 1020

caaaaaacgg aaaccaaaga agaagacatg aacgcgatcg tcggacagga gcttgaaaga 1080

gccgaagggg aagtgattcc acagggtgaa gacggtgatc tttcaattcc cgttgagcat 1140

accactgcag cccacaagtt gctttcgtgg ccgtctatca aggctcttct cgaaccgaga 1200

gagtacgatg aagattatgt tatgaagctg gaagaggagc gaggattgat tctcgtttac 1260

ggccgcggtg aaggacacga tactagtgaa agcccagcaa tgacattctc atcatcatcg 1320

tcccggtcca actgggatca aagttacagc aatggtgctc ctgctagcgg ccagtggaac 1380

ccaggcgctg tccaaaatgg cactcatctc aaaccactcg gacccagtat tgatgatttc 1440

gggatattca gcactgatgc caaaaccgtt cgtcgttatc atcaaagcta cctgaaccac 1500

atgcataagc ttcatccatt tatcaacctg accgaattga gcgcaagcat cgaatcattc 1560

attcagaaat actgctcacc tgacgtttct gttccggtaa acatcctgaa cagccatacg 1620

cccggcgaca ttccacgcgg tgcgaaaagg aagcgttctt gcgatacgct acatggtggc 1680

ggatgcgaca tccagttttc tcctggtgcc aaacacgaag gctctagcgg acgtcgcgtg 1740

gagaagtcac tggaaaatgc tattgttctc ttggttcttg cacttggcag tatttgtgaa 1800

gttccgggag ccatccctgg tccagttact gacacgcccg tggactttca aaaggagcgg 1860

attcctggac cctctacacg cagcatgcta tcatcggcag atacagaact agttatgcag 1920

tcccagggaa gtttcttctc gcagacaagt aaccattcat tttcatctgc taccgggggg 1980

cagaaggctg cttccgatcg gtcgccatac ccggataata gtcacttaag gaacgtggat 2040

gtcattcctg gcttggcata ttatgcgtac gccgcacaga tcttggggag tttgcaaggc 2100

gcgaacgggc tgtaccatgt tcaagcagcc ttactagcag gactttatgc gggacaatta 2160

gcacatcctt tccagagcca tggatggatc taccaggcgg ccagagcatg ccaagtgctt 2220

gtccgatcga aacggtatga acaaatgaat gacggcccgc tgaaagacct atataacttt 2280

gcgtactgga cctgcctgca gctcgagagc gacatccttg ccgaactaga tcttccggct 2340

agtggtatat ctcgcgcgga agcacggatt gagttgccaa agggccgaac tctctctcta 2400

cctaacgacc ctgctgctcc gaacaccatg atgatgtttt tctactctgc ccagatccat 2460

ttgagaaagg ttctgaaccg tgttcacacc gatctataca aagtcgaaag taagttgatc 2520

ttaggcaggc aggagccctt ggctaatgag aacaggtggt ctgctaacgt acaggagatt 2580

ctgagcatga accttgaact gtggagaagc agcttacctg acataatgag atggaaggac 2640

acggaccctc cacatgagga tattaatgtg gctcggatgc gagctaagta ctacggtgca 2700

cgatacatta tccatcgtcc actccttaac tgggctctgc atcattcaca tcccaccgaa 2760

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gaagactctt ccggcagtgg tagcggcgag ggcttggact cacctgccag tccggtgaca 2640

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<210> 11

<211> 2379

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 11

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ctcaacttct ctatggtaac cacaccaccg gatgatgagg atgatgacga ggtgaaccat 120

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<211> 2022

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 12

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<212> DNA

<213> 黑曲霉

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<212> DNA

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gataacgacg tcaatcagaa gttggctgtg aagatacttg agaaacacaa ccacaacgtt 3540

tccgtcgtca gtaacggtct cgaagccgta gaagccgtaa agcaacggcg ctacgatgtc 3600

attctgatgg atgttcagat gccagtcatg ggtggtttcg aagccacagg caagatccgc 3660

gagtatgaga gggaaagtgg tctcagccgg acaccgatca tcgcgctaac tgcacacgcc 3720

atgctgggcg atcgagagaa gtgtattcaa gcccagatgg atgagtactt gtcgaaaccc 3780

ctgaagcaga accagatgat gcagaccatt ctcaaatgtg ctacattagg tggttctctt 3840

ttggagaaga gcaaggagtc gcgaatctca agtagtggtg aaatgcaccc ggtccatcac 3900

agtgggcctg atggcaagag ccaacagcgt ccggggttgg aacctcgatc cgtcaccgca 3960

accagcacta ttaaccgtgg tggtggcctc gcaagcccaa acgttgaccg agcggatgag 4020

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<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 15

tcaagatcca atccacttcc ataaaatact cagtagttga tctcggtgaa ccggcttacc 60

gatgcaatcg ctcatgccct tggcaatgta gctttcggca tcgccctgca tagcattacc 120

cgtgactgcg ataatcggca tttgtaaccc catgtcgcgg atatgcccgg tggcgacaag 180

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ccagaagaca ctgcctcggc cttcgggatt tggcgaatat cccacttctc cgtccatgag 540

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<212> DNA

<213> 黑曲霉

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tggatgactt ggatgatgaa gcctggcttg cagctagtga gcagaagaaa attgtggagt 960

tgggtagctt gggtgagggc gctggaggtg ccgtcactcg atgcaagctc aaggagggta 1020

agacggtgtt tgcgttgaag gtaggtttca ttggtggttt gcatcgtctg gtgttttggt 1080

atgttaacaa ctttctagat tattactacg gaccccaacc ccgatgtgaa aaagcagatt 1140

gttcgagaac tcaacttcaa taaagattgt gcctcggagc acatctgtcg ctactacggt 1200

gctttcatgg acaagtcaac ggggaccatc tccattgcaa tggaattttg cgaaggtggc 1260

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ctaggcaagg ttgccgaggg tgtcttgaac gggttgacct accttcatag cagaaagatc 1380

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atactacatg gcccctgaac gcatcaccgg ccaatcatac accatcacct ctgacgtgtg 1620

gtcactcggt gtgaccttgc ttgaagtcgc ccaacatcgc ttccccttcc ctgccgacgg 1680

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cctggatgct ggacatgaaa aacaagaagg tcaacatggc caatttcgta aggcaagtct 1980

gggactggaa agactagatt gcctgcatgc agcaactgga tctcggcaat cattcatgca 2040

ccttccggac gaaatgctcc acctctaata cgatcgcaca taacggtctc tcctttgatg 2100

cttacaagtg gctggccctt ggttgacc 2128

<210> 23

<211> 1943

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 23

atggacaacc ggtccgacac gaccgacgac gacctttcac cctccctcgc gacgacacaa 60

tcgtacgctt cagtgccctc cctccgcccg accctcgata aatccggtat tactgcgtcg 120

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gaaggtaatc tttctggagt cgtcatggcg atgaaagaga ttcgcctgga attggacgag 960

agcaagttcg ctcagattat catggaattg gagattcttc accgctgcgt gtccccattc 1020

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catcgcgatg tcaagcccac aaacatcctc gtcaactccc gcggacaagt caagatctgc 1260

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gtaagtcatt gttttcatta catcttgcac gtcattgaag atactaaccg tccacaaagg 1560

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cgtgggtcaa ggaacagcta gaccgtcgcc agcgcggctt ggttcaagac gcaagcaagc 1860

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ccactatttc cgctcaatgt taa 1943

<210> 24

<211> 2623

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 24

caccgagcaa gaacacttgt tcacctctct ctttctctat ttatcgtgat cgctattgtt 60

gttcgtgtta ttgatgacat acctttgcta ctcatctccc tcatcatctt tcatctctcc 120

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<211> 2350

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 25

gcctgacaga cgccattcct cgtgaattga ctggttctgt accttcaacc cgccgagctt 60

gtctggagag aagtgacaaa gagaaaataa aaagggagaa aaagcaacct cagccggagc 120

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ttattattat acccattccg attattgctc cgagcctcga gtctgacgtg aaagtggctt 780

agatcacttg cttgtatgac atggacattc cccgcccgga caacttcaac gaaacgtacc 840

tgtacgaggg tgaggcttcc ttcggtaccc gcgggctact agttcctgat gctaacacca 900

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gagcttccag agctacacga aagccagtat gtgtctctca tcctcccctg ccccggcgct 1260

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ggtggtcggc ccttcttcaa gggccgtgac tatgtcgacc agcttaacca gatcctccac 1380

tatctgggta ctcctaacga ggagactctg agccgcattg gctcacctcg tgcccaggag 1440

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aatcccgatg ccctcgatct gctcgatcgc atgcttgcat tcgacccgac atcgcgtatc 1560

tcggttgagg aggcccttga gcatccttac ttgcacatct ggcacgacgc ctcggatgag 1620

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gaagtcgcgg gcgtttcctg gactacctac cgctgttata cgatatcatc catatcgcta 2100

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cttgaaatgc aaacgtacgc tcttggtcgg ctgctgtcct ctcattggat gaggttttgt 2220

cattgatttt cccccatgaa agaaagaact ggttttactc gcatcccgga agtgtctttg 2280

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<210> 26

<211> 1746

<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 26

cagatctcct gagaaagagc ttccgaggct cccacttccc ccctctttga gtgcggtgta 60

ccgtcatcct tgctccaaaa tggcggaatt cgtgcgtgcc cagatcttcg gcacaacctt 120

cgaaattaca agcaggtgcg actctttttg acgatttaaa gaagatcagt atgatctatc 180

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tgactatgag cagataatca gtctcagtga tatcttcatt tctccgctcg aagatatgta 600

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ggactaaaat atgtccactc ggccggtgtc gttcatcgcg atcttaagcc gagcaacatc 900

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tggcaaaaat acgatgtgga agtcgatatc tggagtgcgg cctgcatctt tgcggagatg 1080

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<212> DNA

<213> 黑曲霉

<400> 27

atggaggaca gccatatact gggtgacgac ctgccactcc caccggcacg ccttttcgag 60

aggttgggac atttgcctgg atatacatgg gatcagacta ttgagccgtt tcattcgaca 120

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gaacttctac actacggcct caaaacggtc catggcgaaa tccgcgggga tgccttccat 720

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gataatattc tgagcgaagg ctggtcatcc ctctcaaaag agcttggtgt caagaataaa 840

ctacaattca tcgctccgga acaaacagga agaatgccta cggagccgga tagtcgaact 900

gacatttatg ccttgggcgt gcttttctgg acgatgttgg ttggtaaacc agccttcacg 960

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acatttttgg agatcctgcg gacgctatcc cagtacaggt tgatatgcgc atgtgtggac 2220

gatttgcatt atgccgatga cgagaccctg gagttgatta tgaacatcgt gaaagctaaa 2280

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cctcttttcg aatctgagaa tcccagcgtg acgcgcgtgg tactcaagcc tcttggagag 2400

gaagagatta tgcaaatcgt ggccgctaca atgcatcagg aacccaaccc gatgttaacc 2460

ccgctcgccg ctgtcataca agagaagagt atgggcaacc cgttctttgt ccggatgatg 2520

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ttgtcgttga cggagggacg gaacgtggaa aaaatgcact tcatcatatc ccaagcaatg 3060

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tgcatcactt tccttcaaga caatccttgg gatgacaata acgctgatgt gtactaccgg 3300

gagactctgc gtctgcatat tgctacggct gaaatgtcat ggtcccaagg gcataacacg 3360

gaagctctgg acttgcttga taaagtcttc gaacatggaa agagtgccgt gtgcaaatca 3420

cgagcttgga tcgttaaagc caagatctac gctcagatgg gtaaccacct ccggtcgatg 3480

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ag 2462

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<213> 黑曲霉

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tgcctacttt ggacacttcc ggggcaagaa gatgattgcc gacgctctgg aggacgagga 1380

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cgcttcgaac tttcagtctg cgttgtggaa aagcaagaca aaaatagtcc agagggccgc 60

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accggtggtg ccatcgccgt cgcctgcccc aacggctact cctgcggcca cacccgcagc 5460

tacgcctgca gctgcacccc aggcccagcc tgtggagcct gcagcagcat ccacagccga 5520

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acaacctgcg cctgaacagg ccgcacaaca acaagctgca cctgcgacgg ctcagccagc 5640

taccaatgct cctccaaacc cattcggtca gagccagaac aagcagccct cgtcgttgcc 5700

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aaaccaaaat gtacagccca cgaatgccgc tcagcaagga caggctagcc caggtcgctc 6000

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<210> 50

<211> 3663

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 50

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actcaactaa cggcactagt tagtatagtg gctttgggct cactgattat tctggctgta 120

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agcgagaaga agcaatacaa agaagtgtat atcaaaaaag ggacagaagt aaccgaaaat 2220

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ttagaatcca gcgctacttc cctaggaagt aatagagaca cttcgacaat tcaggaagag 2340

ataacaaaaa gaaatactgt tgcgaatgaa agtatctata agaaagtgaa tgacagggaa 2400

aaagcttcga atgatgatgt atcttctata gtatcaacaa ctaccagctc gtatgataac 2460

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ctaggaagac ctatcgaaaa ccccaaaacg tgggttattt ctattgaagt ggaagacact 2580

gggcctggta ttgacccttc cttacaagaa tctgtatttc atccatttgt tcaaggtgat 2640

caaacattgt ccaggcaata tggtggtact ggcttaggtc tatcaatctg tagacagtta 2700

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attaaagaat gtttggaatc aggaatgaac ggatttttat cgaaaccaat caaaagacca 3600

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tga 3663

<210> 51

<211> 2154

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 51

atggaacaga cacaaacagc agagggcact gacttactaa ttggtgacga aaagaccaac 60

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ttccagagag ataaacggat tgaacaggtg aatagattga aaaacctgat ggaaaaagta 300

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agcgaattta tttctaccaa tttggccgga tattttcctc atacagacat gaagcggttg 900

caaaagacga tgagagagtc atttcgccat tcagcaaggc taagcattgc tcaaagaaga 960

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aggcaaatac tgattggggt tgcgtatttg cataagaaga acattattca cagagatatc 1740

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tcaaaaaaat tatcaccttt gaataaaaaa caaaataaga gagcttcttt gcaaggttcc 1860

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 52

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tcagaatctg cattgagccc aacaaaatcg ggcccttcca agaccgatga aaagaatttt 840

ttacattcta cttcaacaca ccaaaaaacc aaaagcgcaa gttcactata cagaagaagt 900

tttatatccc taagaggctc atcatcgagc aatgcttcct cagcaaaatc accttcaaac 960

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gaccaaaaat tttatcctct gaagaaaaca gggttaaatg atagtgagaa taaatatatt 1680

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tccagtttca aagaatctgc tctcacaaaa ttgggaatca atcacaaaaa tgtcactttc 1800

catatgacag actttgattg cgatattggt gctgcaattc cagatgatac tttggaattt 1860

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gggcgcaggt acccccaaac cccgagttat tactatgaca gagtttccaa tactaatcca 2160

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ttaaatattc ctacccccat aacagaaaat gaaagcaaga gtagttttca agtgctaaga 2340

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aaaatggaga gaaagatgac ctttagacca tctccggagg tcgtttatca aaatttagag 3120

aaattcttcc caagggctaa cttagataag ccaatcactg aaggaatagc ttcaccaaca 3180

tctccgaaat ccttagacag cctactttca ccaaagaatg tggcttcatc gagaactgag 3240

ccaagcactc cttcccgtcc cgtccctcct gatagctcat acgagttcat acaggatgga 3300

cttaacggta aaaataaacc attgaatcaa gctaagacac ctaaaagaac aaaaaccata 3360

agaaccattg cacatgaagc tagtttagca agaaaaaact ctgtaaaact aaaaagacag 3420

aacaccaaaa tgtggggtac aagaatggtc gaagtgaccg aaaaccatat ggtgtcaatt 3480

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atggccgtta agcaggttga ggtccccaag tatagctcac aaaatgaagc cattctaagt 3660

accgtggaag cattaagatc tgaagtgtcc acgttaaaag atttagatca tcttaatatt 3720

gttcaatact taggttttga gaataaaaac aatatttaca gtttgttttt agaatatgtt 3780

gctggtggct ccgtgggatc cttgattaga atgtatggaa gattcgatga accgttgatc 3840

aaacatttaa caacacaagt attaaaagga ttggcatacc tacactcgaa aggtattctc 3900

cacagggata tgaaggcaga caacttactt ttggatcaag atggtatctg caaaatcagt 3960

gacttcggaa tttcaagaaa atcaaaggac atatactcta attcggatat gaccatgcga 4020

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gttgatatat ggtctctggg atgcatcgtt ctggaaatgt ttgctggtaa gcgcccgtgg 4140

tccaacttag aagtcgtcgc agccatgttc aaaattggaa agtcaaaatc ggcaccacca 4200

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ttcgagataa atccagagaa aaggccaacc gctaacgagc ttctttctca tccttttagt 4320

gaagtaaatg aaacattcaa tttcaaatct accagactcg cgaagtttat aaagtcaaat 4380

gataagttaa actcttcaaa attaaggata acctctcagg agaataaaac tgaatag 4437

<210> 53

<211> 4740

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 53

atgtcgcatt cagactactt caattataag ccttacggcg attccacgga aaagcccagc 60

agctccaaga tgaggcagtc atcttcatca tcttcatcta gactaaggtc ggaaagttta 120

gggcgaaatt ccaatactac gcaggctcga gtagcgtcat cgcccatcag cccagggctg 180

cattctaccc agtactttag atcaccaaac gctgtttaca gccctggaga gtctccatta 240

aatacagtac agctattcaa tcgtcttccg ggtatacctc aaggtcagtt ttttcatcaa 300

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cccgtgaata gtaatcaaga tccattattg acgaccccaa cgttagtgat atcaccagaa 540

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caaacttcga acaaacacat tcccaccaga tcgcaaccaa atgggtcaac aagttcctcc 660

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ctaaagggca aattggattg gttgagggat gtgaacaatg atcaaccgtg tgaaatagaa 1080

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tttttcttct tgaaatacca aaaaacttgg aatgaattga atctatctta tttggatcaa 1860

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aatgactggt tttttaaagt gaaaatcgat cccgaatttg atcataccgt tgttgaagga 2100

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tataatctat ccgataacaa aacaattaaa ccagagggat tgaacttgaa agtaattcct 3000

aattcaatag atttgatgtg ccaaggatcc agttatgcct tagaatacca atgtgacagg 3060

ttccaacaga tatctggtag ctcagtttct ttcttggaaa aaaaatcttc ctcagaaacg 3120

gttaaaaaca acttacaaag gataaataaa gcatatttca gatgcacgta cagtgttctg 3180

aagaactata caaagattgt gaccacgttc aagaaggtaa gtcctgtcaa tgatttattg 3240

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aagttcttag ctgaagactg tgatccgact gatcaaaggg tatttaggtg gtgtgtcacg 3420

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aacgtttcta tgagatggca aaagaggaac tttattggtg gcggtacttt tggaagggta 3840

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aacatcttta tggaatattg tgaaggcggt tccctagcag ctcttttgga gcatggtcgt 4080

attgaagatg aaatggtcac tcaagtctac actttacaat tgctagaagg acttgcatat 4140

ttgcatgaat ccggcattgt tcaccgtgat gttaaacccg aaaacatcct actagatttt 4200

aatggtgtta ttaagtatgt tgattttggt gctgctaaaa aaattgctaa taatggaact 4260

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gtttctgatt caaaggcagt gaaaaataac gaaaatgctc tattagacat gatgggaact 4380

cctatgtaca tggctccaga atccatcact ggatctacca ccaaaggcaa acttggggca 4440

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<210> 54

<211> 1548

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 54

atgtttcaac gaaagacttt acagagaagg aacttgaaag ggctcaatct taacctgcac 60

ccagatgtgg gcaataatgg ccaattgcag gaaaagacag agactcacca gggacaatct 120

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attgtcaacg agccttcacc aagattaccc aaagaccgta tctattccaa ggaaatgaca 1320

gattttgtca ataggtgttg tattaagaat gaaagggaaa ggtcatcgat tcatgaattg 1380

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<210> 55

<211> 1521

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 55

atggcttcaa tgttcagacc accagaatcc aataggagtc accaaaagac tccaaaatta 60

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tccactacgt catccatggc ttcaaattcc actttgttgt acaatagatc atctactaca 240

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<210> 56

<211> 2007

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

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agcaaagttg ttgaagggaa aagatcgaat ccgggttctt tgataaatgg tgtgcaaagc 840

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tcctctaaag gaatagattt cagcaatggt tctagttcga gaattacatt ggacgaacta 1080

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tataccgtac agtcagacat ctggtcttta ggtttaagca ttctggaaat ggcactaggt 1680

agatatccgt atccaccaga aacatacgac aacattttct ctcaattgag cgctattgtt 1740

gatgggccgc caccgagatt accttcagat aaattcagtt ctgacgcaca agattttgtt 1800

tctttatgtc tacaaaagat tccggaaaga agacctacat acgcagcttt aacagagcat 1860

ccttggttag taaaatacag aaaccaggat gtccacatga gtgagtatat cactgaacga 1920

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ccggcattac atatgggtgg tttatag 2007

<210> 57

<211> 1539

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 57

atggtagcaa caataatgca gacgacaaca actgtgctga cgacagtcgc cgcaatgtct 60

actaccttag catcaaatta catatcttcg caagctagtt cctcgacgag tgtaacaaca 120

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gcggctcagc caaaatcatc ttcagcaagc acaattgggc tttcaatcgg acttcccatc 240

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atcacatctt atcgcaacaa taacatcgat ctaatcacgg caagacccca ttcagtgata 1080

tacggtacta ctgcacaaca aactttggaa accaacttca atgatcatca tgactgcaat 1140

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tatacagtta ttcaggatta cgagcctaga ttgacagacg aaataagaat ctcgctgggt 1380

gaaaaagtta aaattctggc cactcatacc gatggatggt gtctggtaga aaagtgtaat 1440

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<210> 58

<211> 1455

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 58

atggctgata agatagagag gcatactttc aaggtcttca atcaagattt cagtgtagat 60

aagaggtttc aacttatcaa agaaataggg catggagcat acggcatagt gtgttcagcg 120

cggtttgcag aagctgccga agataccaca gttgccatca agaaagtgac aaacgttttt 180

tcgaagacct tactatgtaa aagatcccta cgtgagctaa agcttttgag acatttcaga 240

ggccacaaaa atattacatg tctttatgat atggatattg ttttttatcc agacgggtct 300

atcaatggac tatatcttta tgaggaactt atggaatgtg atatgcacca aatcatcaaa 360

tccggtcaac ctttgacgga tgctcactat caaagtttca cataccaaat attatgtggt 420

ttaaagtata ttcattctgc agatgtcttg catcgtgatt tgaagcccgg caatttgctt 480

gtcaatgcag attgtcaatt gaaaatctgt gattttgggt tagctagagg ttattcggag 540

aatcctgtcg aaaacagtca atttttgacg gagtacgtgg ccactagatg gtatagagct 600

ccggaaataa tgttgagtta ccaaggatat accaaggcga ttgacgtatg gtcagctggc 660

tgtattttag cggagtttct tggtggaaag ccaatcttca aaggaaagga ttacgttaat 720

caattgaatc aaatattaca agttttaggg acacccccag acgaaacttt aagaaggatt 780

ggttctaaaa atgttcagga ctacatacat caattaggtt tcattccaaa agtacctttt 840

gtcaatttat acccaaatgc caattcacaa gcattagact tattggagca aatgctcgcg 900

tttgaccctc aaaagagaat taccgtggat gaggccctgg agcatcctta cttgtctata 960

tggcatgatc cagctgacga acctgtgtgt agtgaaaaat tcgaatttag ttttgaatcg 1020

gttaatgata tggaggactt aaaacaaatg gttatacaag aagtgcaaga tttcaggctg 1080

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<210> 59

<211> 1308

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 59

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gactacggta accaggccat acagtacgct aatgagttcc aacagtaa 1308

<210> 60

<211> 7416

<212> DNA

<213> 白色念珠菌

<400> 60

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aaaattttga gaagcttgga attaaataat catttaagat tagctgaatt tgaatttgat 5220

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ttggatactg ttactacctg gcaacaacag aacatgcccg ataaggtatc tccatgcaat 5340

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cttttgcaaa tggaactagc aaaaatggca gcagaagacg ccactgatga aaaagccagt 6000

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attcaagtaa gtggggaaac aattttgaat gaccagattg agttggtgtt ttgtaacaat 6300

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cgaaaaatta cggacgacag atttgagatc aatgtgtcag ttgaggattc aggaattgga 6480

atttccaaaa aatctcaaaa taaagtgttt ggagcatttt ctcaagtaga tggttccgca 6540

agacgagaat atggtggctc tggattaggt ttagctatat caaagaaatt gactgaacta 6600

atgggtggca caattagatt tgaaagtgag gaagggattg gcacaacgtt ttatgttagc 6660

gtcattatgg acgcaaaaga atactcatcc ccgccattta gtttaaataa aaaatgtttg 6720

atttacagcc agcattgtct tactgccaag tcaatttcaa atatgcttaa ttattttgga 6780

tcaacagtta aagtcactaa tcagaagtct gagttttcaa cttccgtgca agccaacgac 6840

atcatttttg ttgatcgcgg aatggaacct gatgttagtt gcaaaaccaa agtcattccc 6900

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ttgcccacca aagtgtttgg aaacaacaaa tctaatttat caaaacaata ccctctaaga 7020

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ctactagaaa aagacgaaaa atatgatgtc atattgatgg atattcaaat gcctcgtaag 7200

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<210> 61

<211> 5020

<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 61

atgaggccac ctgacgatca aatcaacaat aacgttggtt ctaattctca cttggaaaag 60

ttgaaagagg taagtgattt caatacttgg attctccttt tttaaatatg aaataaaatg 120

tgatatctct tgttacttaa ttaatttaaa ttactaacgt ttgaataagg ccatggacca 180

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tggctctgtt cattctccga tacttgaatc tcccaccagt ttaaataggc agcatcgaaa 300

ttcattttct ttcaataatg tatcttctcc ttcactagag gatgagcgac ttattaattt 360

tccccgagta aatccaaatc gattgatgac atccaaacgt cccaatgagt tatttaaaac 420

ctcctcaatg agttcagatt gctattctcc tcaaaaatct agggaatcac taaattcatt 480

atgccattca cctgctccat ccgtttcttc ttgtggaaat gctttgaaca acgataatac 540

ttctgcttcg cactcactaa ctgatgagca accatttgaa acagattcat ccgctaactt 600

atttaagcag ttacaggaga agcgtaaccg taccattgga aatgtgtatg aaatggcttg 660

cttattggtc tttaaaaccg gtttgatgaa tttctggaaa aacattattg actttttcgc 720

tcagcagttt ttttccactc aaatatctgt tgtagaaccg cgtgaccttt ctgacatata 780

caatactcct tggcaactca gatgttatta cgatggcggt tcccattatg atccgtatag 840

taaccctata agtgttaatg acaaccttgc tagcagttct tatgttaccg tagttgcttc 900

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tatacctaat gttgatgata ttcgcagcat taagaattca tggaaagttt ttcatgatga 1140

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actttatcca cagaaaaaga gagcatttgt ttcacatttc agtcagaatc gtaaaccgta 1260

ttcccaaagt gacatttcaa aagcacaaag ttcgtctttt tcggaagaac cttcaaacat 1320

ttatgatgag tatgaacaaa atttactttc tccttggtca agatctccag ttgctagtcc 1380

ctccattcaa acagatccta ataggaatcc attcttccaa aattgcttgc aagaatcttc 1440

tttcgctact gaatcgtcaa cagagaagtc tgcttcagag tccgtatcag aaacagctgt 1500

taatgatgat tgtaaaggta tgaatttttc tggtaacagg cgtcaagaag atcatttgaa 1560

cgacttcacc agttttccta ctgaaactgc tgtcagtatt gtacatgttc ctctgatgtt 1620

tccttgttcg gatcaaactt caagccgtgg gagagctcca attgcaattc tttctttcaa 1680

gtccaattta gttccttatc cggaaaattt aatagcctcc atagaacgtt tgataccctt 1740

tattttttct tcatactcaa attctcaatc tgttccgtta cttccttgtc ctacacaaag 1800

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tactgatatt cacgatcata aaatgttgga agaaaagctc caagaatcta acattgaagc 3060

tcaaagaatt gttcggagca aaatgcagta tctttccaat atgtctcatg aaattcgaac 3120

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acagctgagt tatgcacgta ttattcagca atcagctaag tctcttttga ctgttatcaa 3240

tgatattttg gaccttagta aagtcagagc tggaatgatg aagctaacta gccaacgctt 3300

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tatgagaatg aggcaagttg ctttgaatgt gatcggaaat gctattaaat ttacgaatgt 3480

tggtgaagtt tttactcgtt gttccgttga aaagattgat tactcaacca atactgttgt 3540

tttaaagtgg gaatgcattg ataccggtca agggtttaac agagatgatc aattacaaat 3600

gtttaaaccg ttttctcaag tagagagttc tacattacca agacatggtg gctcaggtct 3660

tggattagtt atttcaaaag agcttgttga gctacataat ggtagtatgt cctgtcaaag 3720

tagaagaggc gtgggaacgc gctttatgtg gactgcaacg tttacaatgg ataaaactcc 3780

tctaaaattt gaacccccag atggttgttg tccagtctgt ttttgtccat acgaaaaaag 3840

caaacaaagc acagaagact attattgcgc agacgatgga aacgataaaa gcgcgacgaa 3900

ttttgtaaaa ttggccgtaa ataaagcaga tcccggaaga gaaagcaacc gacgtaaact 3960

tgaatcggac aaaaatgttc aatccaacaa atatgtgaat cctttcgctt ctgaatcgga 4020

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aaacaaacct tctgggatca agttggataa aagtgcttta gccgttgttg tatcacacac 4140

taaatacagt agtgaagcga ttggcaacat gcttcaatca attatcgata taagctcatt 4200

taaagatatc gtaaggtatg gaaataccta tgaagccttt gaagaattgc tagagaatcc 4260

tatgcaatcc aaggtcaccc atattatatt aaatcttccg gacatagaag catatgtttt 4320

atttgtcaaa tcactgcaac tttgtagtct atacaaggat acaaaattta ttttggtgac 4380

ttccactcga caaaaagaat cattatctaa gattttttca gatagcgagg attgtaattc 4440

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<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 62

atgtctacta ttccctcaga aatcatcaat tggaccatct taaatgaaat tatatctatg 60

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gaattggtca acactctgag cgataaatcg attattaatg gaatcaatat tgatgaagat 360

gacgaggaaa taaagataca agtggacgat aaagacgaaa attccatata tctcatcttg 420

atagcaaaag ctttgaacca gtctaggttg gagttcaaac tggcgagaat tgagttatct 480

aaatattaca acacaaacct ataa 504

<210> 63

<211> 888

<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 63

atgagtgtat atcgtgataa catgtatatg aaatacgacc gaaacttcga aaatcgtgtc 60

gcccgaagaa atggacaggc gcgtaacgct agtcttgcta agactcttca cgattctggc 120

atagctgaac gtgcacgctc tccttcaggg tcagcgatcc cccatgctta tcgggttatg 180

aatggttctg gagcgaatga cacttcttta ccactgacct caaatcctgc ttatgttgct 240

ctaacgtcac gtatatcttc gagcaaaagt gaaaacaatc aacaattggc tgctaatgag 300

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gaccatgcga atgccaaaaa tcttcccgct gcttcagtca aagctttggt tggggctggt 420

gtcttgtcgg atgaactttc agtaattgct tacgatatgt catttgagga tgaactcatc 480

caagacaaac agctcattga tcattccgtt tttgaccagt tgcttgagat ggatgatgat 540

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<210> 64

<211> 2139

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 64

atgctcaatt ctgcgttact gtggaaggtt tggctacgaa tagacaactc cactgatgaa 60

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aataaataca caaggccgtt gattagaaaa ggtttaaatt ttaccacaga atcagttaat 720

gattgcactt ataaaatcat ctttgaaccg gatgaattgg ctattaacat atataaggaa 780

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<210> 65

<211> 1569

<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 65

atgcgcattt ggtttaaaaa agttccagat gggattactt cctccgttat attgtctgaa 60

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<210> 66

<211> 2025

<212> DNA

<213> 白色念珠菌

<400> 66

atgaattttc tctataacaa ttcagattat agtagcacat cacatactat gaagtcacca 60

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<210> 67

<211> 1869

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 67

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caactaaaca agtatgactt tcacaaggtt aagagaagtc ccgaggaaag acagagatgt 480

aaatatggcg aacaaagttg ggagtttcag catccagaat ttagagtcca ttacggaaaa 540

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cttttgaatg aatccaccac agagctgttg ttaagcaata ccgtaagtaa agatgcattt 720

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ctatcataa 1869

<210> 68

<211> 2669

<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母

<400> 68

atgccgtctt cgaacggatc ctccgacttt gtatgttggt tcctttttcc gatgaatttt 60

ttataattat aaaatttcac gtttcgtgat aaaactatgt tttctcatac taacgttgtt 120

gaattaggtg cgaaaactct tcaacatgtt ggaagaaccc gaatataggc atatcctgcg 180

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ttgctggatg taaaagagag aagaaaggaa gaatgagtta tcattatatt tatcgccgcc 300

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aggaatcttt tgaggcagca agagattcct atcgcaacaa tcgggttgtt ttattacaaa 540

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atgttacgct gaaaaacgtc cagtttgccc gtaaacctga gtcgtcgaat ttgctttgtt 660

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ttattccttg tcatcatctt ttttgagtaa tagtttttac atctcttaga gaccaatttt 780

atttttaggc cttaccttct ttttaaactt tggcttttga ctagctattc ttctagtctt 840

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tccgcattca aaattccttt ttcccctttc ccctttgttt ccctgagttt atcactaact 960

tactgctttt tagaccaacg agtttacaaa gaccattctg cctcgccact tcaaacatag 1020

taactttgca agttttgtcc gacaactcaa caagtatgag atatttttat ttatttattt 1080

tttttttaca cttgctaatc gtctagatat gattttcaca aagtacggca cgaagaaggc 1140

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cgtccaagcg caatttagct aacgagaaca ctgctccagt tattgaaaac ctaaaacagc 1440

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<212> DNA

<213> 白色念珠菌

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gcatcttcaa gtattcaagc cgcgacccca gcaccattgg cgcaaccagt tgctcaaccg 1020

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ccgccgccac cagcaacagc tacatcccaa attcctagtg cacctccacc tccgacacaa 1140

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tcgacagttg agcacacgaa atatgatttg gttttaatgg atattgttat gccaaaccta 1440

gacggggcaa cggccacaag tgtgattcgt tctttcgata caaaaacccc aatcattgcc 1500

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gatcctaaag aaaataagca agataatgaa cctacggtaa agaaacagaa attgagttaa 1680

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<211> 5313

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 70

atgttcaata gaagtaacac cgcaggcgga tctcaggcta tgaaagaggg acttggcata 60

aacaagctct ccccgatatc atcgaattcg aacccaagct cattgacttc ctccaattat 120

gaaaaatatc tgcagctggc cacagagaag aatccgtgta tgatcttgga gctggaactg 180

gacggcaagg tgcgatatgg ctctccacag tggaacacga tcacaggagt cgccgatgat 240

agtggctctt ctccgacgta cattgcagac cttattctcg gatccgatca agataaaggt 300

gtctttcaaa aggccacaga catgctgctc atgaatgatg acaccagttg cactataacg 360

ttcaagataa aggcagccga ctatgaaggt agcgcaggct gtgacgatga aagtacgata 420

acgaccttgg aagcacgtgg tatcttaatc agggatggcc acacacagtt gccctctcac 480

acgatgtgga tagtcaagcc tcgcacaaac gactggtcag acttttatgc caacgaagac 540

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agaatacgac tggaaatgat aatagacgag ttcaatctac ctctgccaaa aatggaacta 720

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<210> 72

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<212> DNA

<213> 白色念珠菌

<400> 72

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ggagaaaatg aatcatctga ttggttttct gttggagtta taatgtttga atttctttat 3900

ggatatccgc catttcatgc tgatactccg gaaaaagttt tcaataatat tttactgggg 3960

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cctagtgaat ttggttcatt ccatttccga aatttggctg ttttggaaag acaaaataaa 4560

gatgttatta atcgattgaa aacagagcat ttagaacatc gtggtagttt ttctacttct 4620

tcatcatcag aatcaacacc aacaggaaga ctgagaggat tttcatttgg taatgctggt 4680

aatagtggta gttccagtag tggtggaggt ggaggtggag gtggagttgg gacaagtggc 4740

tcaccattta aacgtccaat ttctccacca tcgtttaatg ccaatcaatc aagtggatta 4800

ggactgccag ttataactac atcatcagga gcaatgggaa ttatcaatac aacaaatcca 4860

gtcaacatta ccactactag tagtaatcat aatcatcata atagttttaa tactgttggt 4920

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ttacgagttc aaagaagacg tgaaagttca cgtatgtcaa cagagttatt actgggcact 5340

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<213> 酿酒酵母

<400> 73

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<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母

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<212> DNA

<213> 粟酒裂殖酵母

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<210> 76

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<212> DNA

<213> 黑曲霉

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<212> DNA

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agagagcttg gggataagat ggagggtgca gaagctcgcg agcaggatgc catccgtcaa 1800

caagagcaag aagagttgaa ggacctgaga atccgggtgc agacttaccg tgacgagatc 1860

gctaacctcg tcgctcaaac aaagagctat gttaaggaga gagatacgtt ccggagcatg 1920

cttacccgcc gccgtcagac tgttggcgat gcttctgtct tctcccaatc tcttcctctg 1980

ggcgcagctc ctcccgcttc tgaagagcca gccaaggatg ttccagacta cgctgatctg 2040

ttgcgcaagg tgcaggcaca cttcgacagc ttccgcgagg agtccgccac cgaccatgca 2100

gctttgaagc aacaggtcaa tgagttgtcc aggaagaaca gtgaattgat gagcgaaatt 2160

agccgctcta gcagtcagct tgttgccgcc acacagagag cggagcttct tcagggtaac 2220

ttcgatatgc tcaagaacga aaacgcagaa atgcagaaac gctacgctac cctcctggag 2280

aacgctaacc ggcaggatat caggactcag caagctgccg aagatctggt ggagacgaag 2340

ggcctcgttg agagccttca acgggaaaat gccaacctca aggcagaaaa ggatctctgg 2400

aagaatatcg agaagagact catcgaggat aacgagacac tacgtaacga gagaggtcga 2460

cttgattctc ttaacgcgaa cctccaaacc attctcaatg agcgggaaca taccgatgct 2520

gagagtcgcc gtcgtttgca aagcagtgtg gagtctctcg aatcggagct tcaatccacc 2580

aagcggaagc ttaacgatga ggttgaggaa ggaaagaagg catcgctgcg tagggaatac 2640

gaacatgagc aaagtcagaa gcgaattgac gacttggtga cgagcttggg cgcagctcgg 2700

gaggagttag tggctgcgaa gacgacaaga gatcacttgc aatcgagagt cgatgaactc 2760

actgtcgagc tgcgtagcgc cgaagagcgc ctccaggtcg tgcagactaa gcccagtgtg 2820

tctgctgctc ctactgaagc gcctgcggtt ccggaggaag gccaggagag tggcctgaca 2880

cgcgagcagg aacttggtat tgaagtttcc gagctccgtc gtgatttgga gttgacaaag 2940

aatgagcttc agcacgctga agagcgggtg gaggattata aggctatcag tcagcagagc 3000

gaagagcgtc tgcagtctgt cactgagacc caggaacagt atcgggagga aacggagcgt 3060

ctcatcgaag agaaggataa gaagattcag gacctcgaaa agcgcatcga agaaatttcc 3120

gccgagcttt cgactacgaa cggcgaactt accaaattgc gtgacgagca aggggaggct 3180

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gagaatgaaa ggcagatcgc ttctgcccaa ttccaccagg aagatctcaa ggcacaagct 3300

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gagatcaagg ataggtatga gagcgagctt acggaactgc aaaagcgccg cgaggaagtt 3540

ctccaccaga actctttgtt gcatacccaa ctcgagaata ttacaaacca gatcgcagcc 3600

ctccagcgtg accgggctaa cattcctgag ggagatgagg acggagaggc cggcgcgccc 3660

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gagaagtcct ctcgcatcga agaacttgtt cagcaaatac agccgctaga gactagaatc 4020

agggaactgg agaacactgt agagacaaag gatggagagc tgaagttgct acaggatgat 4080

agggaccggt ggcagcaacg tacgcagaat atcctgcaga agtacgaccg ggtagatccc 4140

gcggaaatgg aaggtctgaa ggagaagctc gagactttgg aaaaggagcg ggatgaggcc 4200

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tccaaggaca ctgggctgcc tgaactgaca gatgcgcaag ccagggagct cgttgccaag 4920

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tttaacgaag agagagaagc gttgaagaag gcccacgaag agggtgtgga ggagaagatc 5100

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cggtaccgga cagcccaggc caagatcgat gtggttcaga aggctgctac ggagacgcct 5220

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caagctccta gccagcgcgg ctctggtcta ccccggggtc gtggcggacg cggaggccat 5880

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ccaggtcgct cgctgaatgc cggtgctcgc cagttcgtcc ctcagggcaa caagcgtgct 6000

cgcgaggatg gagaagctgg aggcgaagga gcaaccagtg gaggaaagcg catgagggga 6060

ggaggtcata cccgggggtc atag 6084