一种同种异体皮肤脱细胞的方法

技术领域

本发明实施例涉及生物医用材料制备技术领域，具体涉及一种同种异体皮肤脱细胞的方法。

背景技术

人类供体捐献的皮肤经过脱细胞处理，能够除去异体组织的免疫原性和特异性，移植后不会发生免疫排斥现象。其中，人体生物敷料为经过去脂肪和脱细胞处理后保留有表皮层和近表皮真皮层的同种异体皮肤，用于烧(创)伤的表面覆盖，起到阻菌、减少创面水分蒸发和促进创伤修复等作用，在治疗体表大面积烧伤时效果显著。因此，同种异体皮肤的脱细胞技术对人体生物敷料的生产和应用起着重要的作用。

公开号CN 104940982A公开的一种敷料皮的制备方法，异种皮料依次用NaCl溶液浸泡、无菌水清洗、37℃的质量分数为0.2～0.5％的中性蛋白酶溶液浸泡，得到异种皮。该脱细胞方法存在以下缺陷：高渗溶液长时间的浸泡(浸泡时间12-24h)会使表皮层与真皮层分离；中性蛋白酶难清洗，残留会产生免疫原性。

公开号CN 106267346A公开了一种同时处理多种生物组织的方法，其中脱细胞处理是先采用高压物理方法破碎细胞再通过DNA酶浸泡及α-Gal酶溶液浸泡去除细胞碎片及抗原。该方法存在以下缺陷：高压破碎细胞可操作性差；使用的酶难清洗；处理时长超过24h。

公开号CN 111437443A公开了一种新型真皮基质脱细胞方法，该方法包括以下步骤：脱细胞前结构稳定剂的浸泡；脱细胞过程；等渗清洗。其中，结构稳定剂为丝素蛋白、甘露醇、甘氨酸、精氨酸、蔗糖中的两种或三种，脱细胞试剂为酶类或表面活性剂，酶类脱细胞试剂选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、无花果蛋白酶、磷脂酶A2、核酸酶、Dispase中的一种或多种，表面活性剂为Triton X-100、CHAPS、SDS、DCA中的两种或三种。该方法应用的试剂种类繁多，并且脱细胞时间较长。

公开号CN 102631706 A公开了低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其中采用核酸酶以及TritonX-100共同脱细胞，其存在处理时间长的缺陷(时长为48h)。

综上所述，现有皮肤脱细胞处理存在处理过程过于繁琐；处理时间较长；使用的酶复杂不易清洗导致残留的问题。

同种异体皮肤在进行脱细胞时，皮肤经过反复冻融、长时间的低渗或高渗溶液浸泡导致表皮与真皮分离，结构被破坏，而且表皮对脱细胞试剂有一定的阻碍作用，使得脱细胞较为艰难。同种异体皮肤理想的脱细胞处理是在短时间内实现细胞脱除而不致使表皮与真皮分离以有利于人体生物敷料的生产转化和应用。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种同种异体皮肤脱细胞的方法，以解决现有脱细胞方法存在的工艺复杂，用时长，效率低，表皮与真皮分离，结构被破坏的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供一种同种异体皮肤脱细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一、破坏细胞对细胞外基质(ECM)的黏附，使细胞与细胞外基质脱离；

步骤二、破坏细胞膜和核膜，使细胞内的DNA暴露在细胞外基质中；

步骤三、去除暴露的DNA，使细胞失去免疫及遗传特性。

具体而言，步骤一中，破坏细胞对ECM的黏附，即破坏细胞膜与ECM之间的蛋白质。作为优选，将同种异体皮肤浸泡于乙二胺四乙酸水溶液中。乙二胺四乙酸(EDTA)是一种有机化合物，能够与Mg

步骤二中，破坏细胞膜和核膜，即破坏磷脂双分子层和膜蛋白。作为优选，将经步骤一处理的同种异体皮肤浸泡于十二烷基硫酸钠水溶液中。大量研究表明，十二烷基硫酸钠(SDS)能够结合细胞膜蛋白，实现短时间内破坏细胞膜和核膜，从而使细胞质DNA及染色体DNA暴露在ECM中。进一步优选，所述十二烷基硫酸钠水溶液的浓度为0.5-2％，浸泡时间为2-4h。

虽有文献报道单独的SDS处理也可脱细胞，但是无法短时间内实现。在细胞膜和核膜被破坏后，DNA暴露到ECM中，使用核酸酶能将暴露的DNA去除，但是核酸酶是外源性蛋白质，难以从组织中去除，可能引起免疫反应，同时长时间的清洗也易导致表皮与真皮分离，因此不是理想的试剂。

步骤三中，将经步骤二处理的同种异体皮肤浸泡于碱性水溶液中。进一步优选，所述碱性水溶液的pH值为11.5-12.6，浸泡时间为30min-2h。使用强碱性溶液使DNA变性，即在pH值较高的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。此外，碱液能够通过水洗去除，不会造成人体生物敷料污染。

根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供上述的方法在制备人体生物敷料中的应用。

本发明实施例具有如下优点：

本发明同种异体皮肤脱细胞的方法包括“细胞脱离”-“DNA暴露”-“DNA去除”三个步骤，这三个步骤从脱细胞原理出发，并非简单的单个化学处理的叠加，该方法能够短时高效的脱去皮肤组织中真皮层细胞，且不会导致表皮与真皮分离，完整的保留了真皮和表皮微观结构，同时，整个处理过程均在水溶液中进行，可操作性强，使其临床实用性得到保证，为人体生物敷料的生产制备提供新的途径，也能够为其它软组织的脱细胞处理提供新的思路，促进行业发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例1-3的同种异体皮肤在脱细胞处理前后的外观图片，其中，A1.同种异体皮肤在脱细胞处理前的表皮面；A2.同种异体皮肤在脱细胞处理前的真皮面；B1.同种异体皮肤在脱细胞处理后的表皮面；B2.同种异体皮肤在脱细胞处理后的真皮面。

图2为本发明实施例1的同种异体皮肤在脱细胞处理前后的H&E染色图片，其中，A1.同种异体皮肤在脱细胞处理前的H&E染色图片200×；A2.同种异体皮肤在脱细胞处理前的H&E染色图片400×；B1.同种异体皮肤在脱细胞处理后的H&E染色图片200×；B2.同种异体皮肤在脱细胞处理后的H&E染色图片400×。

图3为本发明实施例2的同种异体皮肤在脱细胞处理前后的真皮层DNA含量。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中的同种异体皮肤来源于上海亚朋生物技术有限公司，批号19004；如无特殊说明，以下实施例中的％均指质量百分浓度g/mL。

实施例1

选择规格为10cm

首先，将同种异体皮肤浸泡于浓度为0.1％、pH值为8.0的EDTA水溶液中，摇床震荡2h后，取出，用纯化水冲洗3遍；然后，将同种异体皮肤浸泡于浓度为1.2％的SDS水溶液中，摇床震荡2.5h后，取出，用纯化水冲洗3遍；最后，将同种异体皮肤浸泡于pH值为11.5的NaOH水溶液中，摇床震荡30min后，取出，用纯化水冲洗3遍。需要说明的是，摇床震荡的目的是为了让溶液更加高效地渗入到组织内部；在化学处理过程中，料液比为0.5cm

实施例2

选择规格为20cm

首先，将人体生物敷料浸泡于浓度为0.5％、pH值为9.0的EDTA水溶液中，摇床震荡1.5h后，取出，用纯化水冲洗3遍；然后，将同种异体皮肤浸泡于浓度为0.5％的SDS水溶液中，摇床震荡4h后，取出，用纯化水冲洗3遍；最后，将同种异体皮肤浸泡于pH值为111.8的NaOH水溶液中，摇床震荡1h后，取出，用纯化水冲洗3遍。

实施例3

选择规格为30cm

首先，将同种异体皮肤浸泡于浓度为1％、pH值为10.0的EDTA水溶液中，摇床震荡1h后，取出，用纯化水冲洗3遍；然后，将同种异体皮肤浸泡于浓度为2％的SDS水溶液中，摇床震荡2h后，取出，用纯化水冲洗3遍；最后，将同种异体皮肤浸泡于pH值为12.6的NaOH水溶液中，摇床震荡30min后，取出，用纯化水冲洗3遍。

测试例1

为了说明本发明方法能够短时高效的脱去皮肤组织中的细胞，且不会导致表皮层与真皮层分离，对同种异体皮肤在采用本发明方法处理的前后进行外观检测和脱细胞程度检测。

外观检测：通过肉眼观察同种异体皮肤的表皮层是否与真皮层分离。

脱细胞程度检测：该检测分为以下两个部分，a.苏木精-伊红(H&E)染色，细胞核被苏木精染成蓝色，ECM被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色。脱细胞处理后的同种异体皮肤的H&E染色结果应当为真皮层无肉眼可见细胞(无蓝色)。b.DNA含量：通过Quant-IT DNA分析试剂盒用于微量DNA的定量检测。脱细胞处理后的真皮层样品中的DNA含量应不大于50ng/mg。

图1为实施例1-3中的同种异体皮肤在脱细胞处理前后的外观图片(左侧为实施例1，中间为实施例2，右侧为实施例3)。其中，A1和A2分别为实施例1-3的同种异体皮肤在处理前的表皮面和真皮面。从图中可以看出，同种异体皮肤表皮无破损，真皮无破损。B1和B2分别为实施例1-3的同种异体皮肤在处理后的表皮面和真皮面，从图中可以看出，处理后，实施例1-3的同种异体皮肤的表皮未与真皮层分离。说明本发明脱细胞方法未造成同种异体皮肤的表皮与真皮层分离。

图2为实施例1的同种异体皮肤在脱细胞处理前后的H&E染色图片。其中，A1和A2分别为同种异体皮肤在脱细胞处理前的200倍和400倍H&E染色图片，从图中可以看出，同种异体皮肤在处理前表皮层和真皮层存在大量细胞，表皮层与真皮层未分离，细胞外基质结构完整。B1和B2分别为同种异体皮肤在脱细胞处理后的200倍和400倍H&E染色图片，从图中可以看出，脱细胞处理后，同种异体皮肤的表皮层与真皮层之间存在明细的界限且未分离，真皮层与表皮层均无肉眼可见细胞核，真皮层结构较处理前未有明显变化。实施例2和3的同种异体皮肤的H&E染色结果与实施例1无显著差异。说明本发明脱细胞方法未破坏同种异体皮肤的微观结构，表皮未分离，且满足人体生物敷料脱细胞中的染色结果要求。

图3为实施例2的同种异体皮肤在脱细胞处理前后的真皮层DNA含量。从图中可以看出，脱细胞处理前，同种异体皮肤的真皮层细胞含量为575.33±57.55；脱细胞处理后，同种异体皮肤的真皮层细胞含量为23.78±1.37。按照规定，DNA含量应不大于50ng/mg为脱细胞合格。实施例1和3的同种异体皮肤的真皮层DNA含量检测结果与实施例2无显著差异。说明本发明脱细胞方法能够实现同种异体皮肤脱细胞。

以上结果表明：1、本发明方法能够短时高效(处理时间为2.5-9h)的脱去皮肤组织中真皮层细胞，且不会导致表皮与真皮分离，完整的保留了真皮和表皮微观结构。2、本发明整个过程均在溶液中进行，溶液浸入到组织内部是从其表面渗入，面积对其影响不大，因此，本发明方法适用于同种异体皮肤所有面积的脱细胞处理。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。