富含花青苷浓度的茄科植物
文献发布时间:2023-06-19 09:35:27
描述
本发明涉及用于产生富含花青苷(anthocyanins)浓度的果实的茄科(Solanaceae)植物,其中所述植物包含突变的褪色基因。此外,本发明涉及一种提供用于产生富含花青苷浓度的果实的茄科植物的方法。本发明的植物能够产生花青苷浓度高的成熟果实。植物和由本发明的植物产生的果实在果实的发育和成熟期间花青苷的降解减少。
花青苷属于一类被称为类黄酮的分子,其在细胞质中合成后被隔离在植物细胞的液泡中。在结构上,花青苷是花青素(anthocyanidin)的糖苷和酰基糖苷,并且是水溶性分子,取决于其环境和pH,它们可能呈现红色、紫色或蓝色。花青苷存在于开花植物的大多数花中,但它们也可以存在于其他植物组织诸如叶、茎和根中。在茄科作物物种,诸如辣椒(pepper)、番茄(tomato)和茄子(eggplant)中,花青苷也可以存在于果实的果皮和/或果肉中,赋予果实深紫色外观。取决于作物,花青苷的生物合成起始于果实成熟的开始,并且通常持续整个成熟阶段。然而,花青苷在果实成熟的最后步骤期间消失,并且真正的果实颜色出现,并且真正的果实颜色是由于其他分子诸如类胡萝卜素和番茄红素的生物合成。例如,在某些辣椒品种中,例如红辣椒,在成熟开始时,在未成熟阶段,高水平的花青苷在果实的果皮中积累,赋予果实紫色外观,而在果实成熟期间,花青苷消失并且成熟的红色果实颜色出现。
花青苷的生物合成通过类黄酮途径发生,以苯丙氨酸作为前体开始,并且花青苷分子的产生进一步沿着由MYB、bHLH和WD40蛋白组成的保守蛋白复合物调节的途径进行。一种或更多种(功能性)蛋白质的缺乏导致花青苷合成的减少或缺乏。一旦花青苷分子产生,它们可以进一步被酶修饰,包括多种酶,诸如F3’H、F3’5’H或糖基转移酶,导致由于花青苷分子的化学结构的多种颜色。
花青苷非常易于(物理)化学降解,诸如高pH、温度、光、氧气、金属离子,影响花青苷的颜色和稳定性。完全取代的花青苷对褪色敏感,而具有简单3-糖苷修饰的花青苷的植物不太敏感。花青苷的降解(一种恢复到褪色的过程)发生在许多植物物种和多种器官中,诸如花、花瓣和果实中。然而,关于这种褪色过程的生化或遗传机制已知的很少。
花青苷产生对植物是重要的,因为它们参与植物中许多重要的生物功能,诸如吸引传粉者、抗氧化能力、保护免受由非生物胁迫引起的活性氧、针对UV照射/DNA损伤以及病原体攻击的保护作用和植物免疫。此外,大量研究已经表明,水果和蔬菜中存在的花青苷由于抗氧化、抗炎、抗癌和抗微生物活性是对健康有益的,并且可以预防人类的心血管疾病和糖尿病。由于这些潜在的(健康)益处,理解与花青苷生物合成和花青苷稳定性相关的机制是当前活跃的基础研究领域以及作物开发中非常重要的方面。这种理解将用于开发具有较高花青苷含量的新型作物品种。
考虑到以上情况,本领域中需要具有增加的花青苷含量的新型作物品种和果实,其中避免了花青苷分解(花青苷的褪色)并且花青苷含量在所述作物或果实的成熟期间保持稳定。此外,本领域中需要一种开发受花青苷降解影响较小、产生具有高花青苷含量的果实的新型作物的方法。
除了其他目的之外,本发明的一个目的是解决本领域的以上需求。除了其他目的之外,本发明的这个目的通过本发明如所附权利要求中概述的来实现。
具体地,根据第一方面,除了其他目的之外,以上目的由本发明通过用于产生富含花青苷浓度的果实的茄科植物来实现,其中所述植物包含编码褪色蛋白(FA蛋白)的褪色基因(FA基因),其中FA蛋白与SEQ ID No.2具有至少70%氨基酸序列同一性,并且其中所述FA基因包含这样的突变:与其中不存在这样的突变的茄科植物相比,所述突变导致FA蛋白的表达水平降低或活性降低。
其中不存在这样的突变的茄科植物可以是野生型茄科植物或亲本植物。降低的FA蛋白表达水平可以导致FA蛋白的缺乏。FA基因的突变导致FA基因表达的降低和/或降低的FA蛋白/mRNA水平,并且花青苷在果实/花的成熟期间不发生褪色。果实(或花)中的花青苷水平仍然高。这种高花青苷含量对于植物及其果实和/或花是有益的,因为花青苷对于吸引传粉者、抗氧化能力、保护免受由非生物胁迫引起的活性氧、针对UV照射/DNA损伤以及病原体攻击的保护作用和植物免疫是重要的。此外,对于粮食作物,已知的是花青苷含量高的果实(包括蔬菜)对人类是健康有益的。果实在本文中被认为是大体上成熟的、可收获的和/或可食用的果实。
果实被认为是成熟的果实,其中在成熟期间,果实大小随时间增加成为具有不再显著增加(成熟状态)的果实大小的果实。当成熟时,果实是可收获和食用的。因此,果实从未成熟到成熟/成熟(ripe/mature)状态的成熟时间是已知的,或者可以确定。在本发明中,由于避免了花青苷分解并且花青苷含量在所述作物或果实的发育和成熟期间保持稳定,因此果实将在发育和成熟期间保持其颜色。
如本文使用的序列同一性被定义为在本序列的全长上相同的连续排列的核苷酸或氨基酸的数目除以本序列的全长的核苷酸或氨基酸的数目,并且乘以100%。
在果实发育期间显示出褪色表型的辣椒植物(辣椒(Capsicum annuum)物种)中鉴定到FA基因。基于可用的基因组序列,辣椒物种中FA的最佳击中为CA08g13530/Capana08g001718(分别为CM334 v1.55和Zunla v2.0)。FA编码与铁还原氧化酶类似的蛋白质,并且辣椒中FA的基因组区域的长度为3522个核苷酸,由9个外显子和8个内含子组成。FA基因的编码序列(cDNA)为2217个核苷酸,并且由SEQ ID No.1表示,其编码由SEQ ID No.2表示的FA蛋白。FA基因是在若干组织中表达的显性基因,所述组织诸如叶、花瓣(仅在发育的后期)、茎、花、果实和根。
本发明涉及包含FA基因的植物,其中FA基因编码与由SEQ ID No.1表示的编码序列包含至少75%序列同一性、优选地至少80%核苷酸序列同一性、更优选地至少85%、甚至更优选地至少95%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
本发明涉及这样的植物,其中FA蛋白具有与SEQ ID No.2包含至少70%序列同一性、优选地至少75%序列同一性、更优选地至少85%序列同一性、甚至更优选地至少95%序列同一性、优选地至少99%序列同一性、最优选地100%序列同一性的氨基酸序列。
本发明涉及这样的植物,其中在所述植物的果实成熟期间,与其中不存在FA基因中的突变的野生型植物相比,所述植物中的果实具有降低的花青苷降解。在本发明中,FA基因在辣椒中突变,通过降低其表达使该基因失活。降低辣椒果实中的FA基因表达阻止了花青苷的降解,从而导致成熟的辣椒果实在其果皮中具有高浓度的花青苷,导致成熟果实的紫色。具有紫色的成熟甜椒(sweet pepper)果实在自然界中不会出现,因为果实(果皮和果肉)中存在的花青苷在所述果实的成熟期间降解(褪色)。与其中不存在这样的突变的野生型植物相比,通过FA基因的突变来防止辣椒物种中花青苷的降解,导致减少的FA基因表达或FA基因表达的不存在和/或降低的mRNA水平和/或降低水平的FA蛋白或FA蛋白的不存在,并且因此果实在成熟期间将保持果皮中花青苷分子的浓度或水平。因此,成熟的果实保持其最初的紫色,果皮中存在高浓度的花青苷。
根据另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物的果实包含大体上为紫色或蓝色的果皮。在茄科中,诸如在辣椒、番茄和茄子中,花青苷可以赋予果实深紫色外观。在成熟开始时,在未成熟阶段果实中积累了高水平的花青苷,产生紫色、蓝色果实,而在果实成熟期间,花青苷消失,并且成熟的(番茄红素)果实颜色出现,根据作物物种或作物品种,颜色可以是红色、黄色、橙色、白色或绿色。在果实的果皮中的花青苷不褪色并且果肉中的花青苷褪色的情况下,可以获得具有紫色表皮/果皮和红色、黄色、橙色、白色或绿色果肉的果实。此外,当果皮和果肉两者中的花青苷均不褪色时,可以获得完全紫色/蓝色的果实,即具有高花青苷含量的成熟果实。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物的果实包含大体上为紫色或蓝色的果皮和果肉。
根据另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中在所述植物的果实发育期间,与从其中不存在这样的突变的茄科植物获得的果实的果皮相比,所述植物的果实在果皮中包含的花青苷的浓度高至少50%、更优选地高至少75%。为了确定果实中花青苷的浓度,可以进行吸收光谱法。测量的吸收值越高,果实中花青苷的浓度越高。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中,在果实发育期间,与从其中不存在这样的突变的茄科植物获得的果实的花青苷浓度相比,花青苷的降解减少至多50%、优选地至多40%、更优选地至多30%、最优选地至多25%。花青苷的降解和成熟果实的花青苷浓度的降低可以在果肉中或果皮中,或者在果皮和果肉两者中。
褪色基因也在其他茄科植物物种中被鉴定。使用公共数据库进行与SEQ ID No.1(辣椒的FA基因)的FA基因序列比对,以研究其他茄科植物物种是否也具有FA基因或FA直系同源物。除了辣椒植物(Capsicum annuum)之外,其他含有FA基因或FA直系同源物的植物是具有SEQ ID No.3的番茄植物(Solanum lycopersicum)、具有SEQ ID No.5的茄子(Solanummelongena)。碧冬茄属(Petunia)植物(腋花矮牵牛(Petunia axillaris))包含三个FA基因;SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。使用标准比对软件并且通过鉴定辣椒植物、番茄植物、茄子和碧冬茄属的相互最佳击中来进行序列比对(参见实施例中的表1和表2)。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物选自由以下组成的组:辣椒植物(Capsicum annuum)、番茄植物(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanummelongena)和碧冬茄属植物(腋花矮牵牛(Petunia axillaris))。
根据另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物是辣椒,并且所述FA基因编码与SEQ ID No.2具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%氨基酸序列同一性的FA蛋白。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中FA基因包含与SEQID No.1具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物是番茄,并且所述FA基因编码与SEQ ID No.4具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%氨基酸序列同一性的FA蛋白。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中FA基因包含与SEQ ID No.3具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物是茄子,并且所述FA基因编码与SEQ ID No.6具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%氨基酸序列同一性的FA蛋白。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中FA基因包含与SEQ ID No.5具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物是腋花矮牵牛,并且所述FA基因编码与SEQ ID No.8、SEQ ID No.10或SEQ ID No.12,优选地SEQ IDNo.8具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%氨基酸序列同一性的FA蛋白。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中FA基因包含与SEQ ID No.7、SEQ ID No.9或SEQ ID No.11,优选地SEQ ID No.7分别具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
调节FA基因以降低其表达可以在多个水平上实现。第一,内源性基因可以直接被突变。这可以通过诱变处理来实现。可选择地,可以通过转基因技术或通过基因渗入将修饰的FA基因引入植物,或者可以在调节水平降低FA的表达,例如通过修饰调节序列或通过基因沉默。
降低的FA蛋白表达水平是降低的内源性FA基因表达和/或降低的mRNA水平的结果。通过在转录或翻译水平下调基因表达,例如通过基因沉默或通过直接(诸如通过基因沉默)或间接通过修饰其调节序列影响FA基因表达的突变,或者通过刺激基因抑制,可以实现FA基因表达的降低。调节因子可以通过转基因过表达上调(在阻遏蛋白的情况下)。FA基因的过表达可以通过由强启动子例如植物生物技术中常用的35S启动子表达FA基因的阻遏蛋白来实现。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中FA基因中的突变编码所编码的FA蛋白中的氨基酸取代。
根据另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述突变是FA基因中的移码突变或终止密码子突变。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述突变是非天然突变。FA基因的下调可以通过编码序列、启动子、终止子区域或潜在内含子中的调节元件的诱变来实现。在许多情况下,FA编码序列中的突变导致氨基酸取代或过早终止密码子,它们负面地影响所编码的FA蛋白的表达或活性。这些突变可以在植物中通过使用诱变化学物质诸如甲磺酸乙酯(EMS)、通过用γ射线或快中子照射植物材料、或通过CRISPR/Cas介导或通过本领域已知的诱导基因突变的其他手段来诱导。
降低的FA蛋白水平是FA基因中的突变的结果,与其中不存在这样的突变的野生型FA基因相比,该突变导致降低的FA表达,或者导致降低的mRNA或蛋白稳定性。在特定的实施方案中,这通过使FA编码序列突变来实现,这导致非功能性FA蛋白。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物还包含编码MYB蛋白的MYB基因中的突变,与其中不存在MYB基因中的突变的野生型茄科植物相比,所述突变导致MYB蛋白的表达水平降低或活性降低,其中MYB蛋白与SEQ ID No.14具有至少70%序列同一性。由于这种类型的MYB蛋白的花青苷产生的抑制功能,降低特定的MYB蛋白水平将增加花青苷产生。如先前陈述的,花青苷生物合成途径通过保守的bHLH/WD40/MYB蛋白复合物调节。R2R3MYB蛋白起激活剂和阻遏物即MYB蛋白的作用,它包含C-末端EAR基序。MYB在碧冬茄属中的组成型过表达导致没有花青苷生物合成,而降低其表达导致增加的花青苷生物合成。这些R2R3 MYB阻遏物在辣椒、番茄和碧冬茄属中被鉴定,并且其中辣椒R2R3MYB阻遏物表达被VIGS降低的实验导致未成熟辣椒果实中花青苷含量增加两倍(参见图4)。因此,MYB基因的突变导致降低的mRNA表达,并且可能导致降低的MYB蛋白水平,并且从而导致花青苷生物合成的增加。与野生型植物(MYB基因中没有突变)的果实相比,具有突变的MYB基因的植物将产生具有较高花青苷含量的果实。
突变的MYB基因和突变的FA基因两者的组合导致未成熟果实将具有增加的花青苷含量,这是由于MYB基因表达的降低或缺乏。同时,由于FA基因表达的降低或缺乏,成熟果实(或正在成熟的未成熟果实)中的花青苷不褪色。与MYB基因和FA基因中没有突变的野生型植物的果实相比,两种基因的突变具有协同效应,导致成熟果实具有高的、持久的花青苷含量。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物是辣椒,并且所述MYB基因编码与SEQ ID No.14具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%氨基酸序列同一性的MYB蛋白。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中MYB基因包含与SEQID No.13具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
根据另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物是番茄,并且所述MYB基因编码与SEQ ID No.16具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%氨基酸序列同一性的MYB蛋白。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中MYB基因包含与SEQID No.15具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中所述植物是碧冬茄属植物,并且所述MYB基因编码与SEQ ID No.18具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%氨基酸序列同一性的MYB蛋白。
根据另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中MYB基因包含与SEQ IDNo.17具有至少90%、优选地至少95%、更优选地至少98%、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中MYB基因中的所述突变是非天然突变。MYB的突变可以通过基因编辑技术、优选地通过CRISPR/Cas和/或诱变处理,特别是用诱变剂或辐射实现。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的植物,其中果实具有增加的货架期(shelf life)。成熟果实中高浓度的花青苷对其货架期具有积极影响。
根据第二方面,本发明涉及一种用于提供本发明的茄科植物的方法,该方法包括以下步骤:
a)在褪色基因(FA基因)中引入突变,其中所述FA基因包含与SEQ ID No.1具有至少70%核苷酸序列同一性的编码序列
b)确定植物中FA蛋白和/或FA mRNA的内源性水平的降低
c)选择产生富含花青苷的果实的茄科植物。
待突变的FA基因可以具有与SEQ ID No.1包含至少75%核苷酸序列同一性、优选地至少80%、更优选地至少85%、甚至更优选地95%、优选地99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。
根据优选的实施方案,本发明涉及这样的方法,其中步骤a)还包括在MYB基因中引入突变,其中所述MYB基因包含与SEQ ID No.13具有至少70%核苷酸序列同一性、优选地至少80%、更优选地至少85%序列同一性、甚至更优选地至少95%序列同一性、优选地至少99%、最优选地100%核苷酸序列同一性的编码序列。
根据另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的方法,其中该方法的步骤b)还包括确定植物中MYB蛋白和/或MYB mRNA的内源性水平的降低。FA基因和/或MYB基因中的突变可以导致所编码的蛋白中的氨基酸取代和/或其中FA基因和/或MYB基因中的突变是移码突变或终止密码子突变。FA基因和/或MYB基因中的突变优选地是非天然突变。
根据又另一种优选的实施方案,本发明涉及这样的方法,其中FA和/或MYB的突变通过基因编辑技术、优选地通过CRISPR/Cas和/或诱变处理,特别是用诱变剂或辐射实现。
在以下实施例和附图中将进一步详述本发明,在附图中:
图1:示出了Mavis和Zulu辣椒果实表型。A)Mavis对照植物的成熟果实表型。B)FA-VIGS植物的成熟果实。C)来自FA-VIGS果实(来自B中所示的果实)的红色部分和紫色部分的切开(部分地去除果皮)。D)Zulu对照植物的未成熟(紫色)和成熟(红色)果实。E)FA-VIGS植物的未成熟(紫色)和成熟(红色/紫色斑块)果实。
图2:示出了从作为对照的Zulu和Mavis获得的果实和FA-VIGS果实中的FA基因表达分析。A)Zulu FA VIGS果实和对照果实(来自图1D和图1E中所示的材料)中的mRNA表达分析。辣椒看家基因肌动蛋白(CaActin)用于显示出等量的输入材料。此外,确定了辣椒即Capsicum annuum(Ca)的AN2、DFR和FA的表达水平。这些基因编码调节花青苷生物合成的转录因子。使这些基因中的一个基因突变导致无花青苷合成。泳道代表:1=Zulu未成熟(对照),2=Zulu成熟(对照),3=Zulu FA VIGS未成熟,4=Zulu FA VIGS成熟-红色,5=ZuluFA VIGS成熟-紫色。所有样品以一式两份进行。辣椒中FA基因(CaFA)表达降低(参见加框区),并且花青苷生物合成途径中的CaDFR、CaAN2基因不受影响,因此花青苷以正常水平产生。
图3:示出了,具有突变的FA基因(fa突变体)的碧冬茄属花不呈现出褪色表型,因为花瓣中的花青苷没有随时间降解,保持了紫色花颜色(上图)。在FA突变由表达FA基因的构建体(35S:FA)补充即稳定的转化植物的情况下,花在发育的早期阶段开始褪色,失去紫色并且变成白色花(图3A)。实验示出了,碧冬茄属褪色表型可以由辣椒FA基因补充。结果清楚地示出了,辣椒FA基因(图3B)和碧冬茄属FA基因(图3A)是功能可交换的。
图4:示出了成熟辣椒果实和未成熟辣椒果实(Zulu)中花青苷的浓度。使用具有全功能FA基因和MYB基因的成熟果实和未成熟果实(Zulu对照),并且使用利用VIGS使FA基因或MYB基因沉默的成熟果实和未成熟果实(VIGS FA或VIGS MYB)。当FA基因被VIGS沉默时,FA基因表达降低,导致未成熟果实和成熟果实两者中高的花青苷浓度。当MYB基因被VIGS沉默时,MYB基因表达降低,导致未成熟果实中高的花青苷浓度。
实施例
为了研究FA是否参与辣椒中的花青苷降解,进行了病毒诱导的基因沉默(VIGS)分析。设计覆盖FA基因的第一外显子的一部分和第二外显子的一部分的274nt片段(113nt-384nt),以使用烟草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus,TRV)和VIGS方法降低内源性mRNA水平。作为植物,使用Mavis和Zulu辣椒品种,在未成熟阶段它们都显示出果实中高水平的花青苷积累,而在果实成熟期间,花青苷降解并且出现红色成熟的果实颜色。合成被设计为靶向FA的DNA片段并且随后将其克隆到载体中。FA靶序列的DNA序列通过Sanger测序证实。该载体包含编码功能性TRV颗粒所需的蛋白质的所有序列,包括FA靶序列。在VIGS实验中使用包含FA靶序列的载体(=VIGS构建体),以降低辣椒果实中的内源性mRNA水平。
Mavis和Zulu品种两者均显示出,在VIGS构建体的农杆菌渗入后4个月,紫色未成熟果实与对照植物相同(图1D和图1E)。然而,在成熟期间,我们观察到FA-VIGS果实上出现深色(紫色)和红色斑块(图1B和图1E,两个FA-VIGS植物),并且即使在果实继续成熟时,紫色斑点保持其颜色。图1C示出了果实的果肉是红色的,并且仅果皮含有花青苷(在剖面图中,果皮被部分去除)。基于这些结果,可以得出结论,果皮中的紫色斑点是FA表达降低的结果。
为了确定FA-VIGS果实中FA的mRNA水平是否降低,对如图1D和图1E中所示的果实进行表达分析。从果实中提取RNA。使用oligo-dT oligo方法从所有样品中合成cDNA,并且将其用作模板,用于RT-PCR。收获未成熟和成熟阶段的果实,并且从果实的紫色部分和/或红色部分切下~1cm
看家基因肌动蛋白(CaActin)用于显示出等量的输入材料。此外,确定了AN2、DFR和FA的表达水平。这些基因编码调节花青苷生物合成的转录因子。使这些基因中的一个基因突变导致无花青苷合成。FA-VIGS果实的表达分析证实FA的内源性mRNA水平降低,而其他已知的花青苷相关基因诸如AN2和DFR未显示出mRNA表达水平的变化(图2)。
结果示出,FAmRNA仅存在于Zulu对照果实中,而不存在于FA VIGS果实中,与发育阶段,即未成熟或成熟果实无关。这证实了VIGS方法确实导致降低的内源性FA mRNA水平,并且因此阻断果皮中花青苷的降解。结果还表明,DFR和AN2表达独立于FA表达。
在碧冬茄属中,进行互补测定,以研究FA基因的突变对褪色的影响。FA基因通过dTPh1转座子插入被突变。在FA启动子中含有插入,因此没有褪色表型的褪色突变体碧冬茄属植物稳定转化有在组成型35S启动子下的FA编码序列。简言之,从非褪色的碧冬茄属品系(V74)中PCR扩增FA cDNA,并且将其克隆到含有花椰菜花叶病毒启动子(35S)和用于转基因选择的卡那霉素基因的载体中。具有正确编码序列的克隆在大肠杆菌(E.coli)中增殖,并且随后转化到根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)AGL0中。来自非褪色的V74碧冬茄属品系的叶组织用于农杆菌介导的转化。选择产生的外植体中转基因的存在,并且含有转基因的那些植物显示出褪色表型的恢复,表明FA是导致褪色的基因(图3A)。
为了用辣椒FA基因补充褪色表型,将来自褪色Mavis和Zulu辣椒品种的基因组FA基因克隆到含有35S启动子和卡那霉素选择标志物的相同克隆载体中,随后进行相同的植物转化,并且农杆菌介导的转化用于将辣椒褪色基因引入碧冬茄属V74中。选择产生的外植体中转基因的存在,并且含有转基因的那些植物显示出碧冬茄属褪色表型的恢复(图3B)。
实验示出了碧冬茄属fa突变体褪色表型可以由FA基因补充。结果示出了辣椒FA基因(图3B)和碧冬茄属FA基因(图3A)是功能可交换的。碧冬茄属中的非褪色表型通过用辣椒(Capsicum annuum)的从强组成型35S启动子转录的FA基因补充的非褪色的fa突变体碧冬茄属植物来拯救。包含FA基因的稳定转化的植物具有在发育的早期阶段褪色的花,而包含突变的fa基因的对照植物不显示出褪色。
为了确定辣椒果实中花青苷的浓度,进行在530nm的波长的吸收光谱法。测量的吸收值越高,果实中花青苷的浓度越高。使用具有全功能FA基因的成熟果实和未成熟果实(Zulu对照),并且使用利用VIGS使FA基因沉默的成熟果实和未成熟果实(Zulu VIGS FA)。FA基因的VIGS沉默导致降低的FA基因表达。将新鲜果实(每组2-4个果实)切成小块,并且在液氮中冷冻。使用研钵和研杵用液氮研磨冷冻的样品。加入5体积(基于重量)的包含45%甲醇和5%乙酸的提取缓冲液,并且充分混合。在室温以12,000×g离心5min,并且将上清液转移到新管。然后在室温以12,000×g离心5分钟,并将上清液转移到新管。测量每个样品在530nm处的吸光度,以确定果实中花青苷的浓度。
对照组和VIGS FA组两者的未成熟果实均是紫色的,并且结果示出(图4)这两组的果实均显示出相似的高吸光度值,并且因此包含高花青苷含量。成熟的对照果实是红色的并且导致吸光度下降,表明这些果实中几乎不存在花青苷至存在低浓度的花青苷。与未成熟的VIGS果实相比,在为紫色的具有红色斑块的成熟的VIGS FA果实中,仅检测到轻微的吸光度下降,并且再次测量到高吸光度水平。该结果表明,在成熟的VIGS FA果实中,花青苷保持以高水平存在,并且花青苷降解通过降低的FA基因表达而减少。
使用多重比对软件确定茄科之间的FA基因与FA蛋白、MYB基因与MYB蛋白的相似性。确定了FA基因的序列(编码序列):辣椒(Capsicum annuum)SEQ ID No.1、番茄(Solanumlycopersicum)SEQ ID No.3、茄子(Solanum_melongena)SEQ ID No.5和碧冬茄属(腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-1、腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-2、腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-3)分别地SEQ ID No.7、SEQ ID No.9和SEQ ID No.11。确定了FA蛋白的序列:辣椒(Capsicum annuum)SEQ ID No.2、番茄(Solanum lycopersicum)SEQ ID No.4、茄子(Solanum_melongena)SEQ ID No.6和碧冬茄属(腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-1、腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-2、腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-3)分别地SEQ IDNo.8、SEQ ID No.10和SEQ ID No.12。FA核苷酸序列(表1)和FA蛋白序列(表2)两者在茄科之间显示出高相似性。
表1.同一性百分比矩阵FA基因
表2.同一性百分比矩阵FA蛋白
此外,确定了MYB基因的序列(编码序列):辣椒(Capsicum annuum)SEQ ID No.1、番茄(Solanum lycopersicum)SEQ ID No.3和碧冬茄属(腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-1)SEQ ID No.7。确定了MYB蛋白的序列:辣椒(Capsicum annuum)SEQ IDNo.2、番茄(Solanum lycopersicum)SEQ ID No.4和碧冬茄属(腋花矮牵牛(Petunia_axillaris)-1)SEQ ID No.12。如同对于FA基因序列和FA蛋白序列,MYB核苷酸序列和MYB蛋白序列两者(表3和表4)也在茄科之间显示出高相似性。
表3.同一性百分比矩阵MYB基因
表4.同一性百分比矩阵MYB蛋白
序列表
<110> 安莎种子公司
<120> 富含花青苷浓度的茄科植物
<130> 4/2WL14/60
<160> 18
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 2217
<212> DNA
<213> 辣椒(Capsicum annuum)
<400> 1
atgggtgaac tttcaagcca agaacctctt cttttaaaga aagaaaatga atttaattat 60
ctcaagaaga tacctctttt ggtatcatca acaatcaaag gaataatgtg ggtgatcttc 120
attgcatggg cagctttttt ctttgtgttg cctacagaat ttggaagaga attgcaacat 180
aaaactataa gagccacaaa tggaactctt tttgggacta caggaagcac attcttgtta 240
ttcagtttcc cagttttcat gattgcattt cttggaatta ttcgtctcgt tctctctggt 300
gaagatgaac ctcaagtcaa gaagactgca aaaggtccaa agtttagatt gtggacattc 360
ccggtgctgg tggatggacc atttggtgtt gttacagcta cagaaatgat tggtgttata 420
ctcttctcag tgtacatcgt gtgggctgta ataatgtaca ctatacagaa tgttgacctc 480
ttatccttgt ttgatgcaca cggcatgaaa gagaaaagtg ctttgttgct ggagctgaca 540
ggccttcgtt ttggattcat tggattaatc tgcttagcat ttttgtttct gcctgttgca 600
cgaggttcag ttcttcttcg agctatagat atcccttttg aacatgccac tagatatcat 660
gtttggctgg gacatcttac tatggctctt tttactcttc atggtctgtt ctatgtgatt 720
ggctgggcaa tgcggggacg acttgtggaa gaactagttg actggaaaaa cgtaggagtg 780
gccaatcttc caggagttat cagccttgca gctggtttac tgatgtgggt gacttcactt 840
cctggattaa ggagaaaaaa ctttgaactg ttcttctata cacaccaatt gtatgtggtg 900
ttcgtggtat tcctggtctt gcatgttggt gatttcatct tcatgatggc tggagctggg 960
atcttcctgt tcatgcttga tcggttcctt agattcttcc agtcaagaaa gactgttgac 1020
atactttcag ccacatgttt cccttgtgga accgttgaac tcgttatctc aaaacctgca 1080
aatttagatt acaacgccct tggctggata ttcttacaaa tacgcgagtt gtcctggctg 1140
cagtggcacc ctttcagtgt ctcatctagt ccccttgatg ggaaacagca tcttgctatt 1200
ctgataaagg ttcttggaga ttggacagag aaactgaagg gaaacatctt gaatctttct 1260
gtagagcaat ctgagacgga gccgcttttg cagcataaca ggaaaataac agcttctgtt 1320
gaaggtcctt atggacatga atcaccatac cacttaacgt atgaaaatct cattttggta 1380
gcaggtggaa ttggaatttc tccctttcta gctatcctga gtgatattct ccaccatatc 1440
aatgatggca agccttgtct gtcaagaaat atactgatag tatgggctat caaaaattcg 1500
gacgagcttc cacttcttga tacagttgac atggaggcaa tctgtccact tttctctgat 1560
aaactgaatc ttgagcttca aacatttgtg actcgggaat cacagcctcc attggaggag 1620
ggtaaaacac ccaaagcaat gcaaccctca atctcccctg gcttcaaggg atgccgaatg 1680
tctggtttgg ttggtactgg aaatattgta tggtctggat tatatgtcgt agtatccacc 1740
atagggttgg tgatcactac agcgtcgctg aacattttct acgtaaatcc attcaatgta 1800
tattattggt ggtacaaagg gcttttgttg attggatgca tggctgcaag cattcttata 1860
tttggtggtc tcgtgatcgc tttatggcat ctttgggaaa ggaaaacctc atcgaaggag 1920
gaaccagagg acgacacaaa gaaagttgac atcctgcagc accagaatga agcctcttta 1980
cccaagagtt ttggagaggc tcgatttgtc aacaatattc gatatggtca aagaccggat 2040
ttccaagaga tatttggatc gcatgcaaag agctggggaa gtgtagatat tggtgtgatt 2100
gtgtgtggtc ctcctactct tcagactagt gttgctaaag agtgcagaag gcagaacttg 2160
cagagaagag gccatcaggc tattttccat ttcaacagcc acagttttga cctctag 2217
<210> 2
<211> 738
<212> PRT
<213> 辣椒(Capsicum annuum)
<400> 2
Met Gly Glu Leu Ser Ser Gln Glu Pro Leu Leu Leu Lys Lys Glu Asn
1 5 10 15
Glu Phe Asn Tyr Leu Lys Lys Ile Pro Leu Leu Val Ser Ser Thr Ile
20 25 30
Lys Gly Ile Met Trp Val Ile Phe Ile Ala Trp Ala Ala Phe Phe Phe
35 40 45
Val Leu Pro Thr Glu Phe Gly Arg Glu Leu Gln His Lys Thr Ile Arg
50 55 60
Ala Thr Asn Gly Thr Leu Phe Gly Thr Thr Gly Ser Thr Phe Leu Leu
65 70 75 80
Phe Ser Phe Pro Val Phe Met Ile Ala Phe Leu Gly Ile Ile Arg Leu
85 90 95
Val Leu Ser Gly Glu Asp Glu Pro Gln Val Lys Lys Thr Ala Lys Gly
100 105 110
Pro Lys Phe Arg Leu Trp Thr Phe Pro Val Leu Val Asp Gly Pro Phe
115 120 125
Gly Val Val Thr Ala Thr Glu Met Ile Gly Val Ile Leu Phe Ser Val
130 135 140
Tyr Ile Val Trp Ala Val Ile Met Tyr Thr Ile Gln Asn Val Asp Leu
145 150 155 160
Leu Ser Leu Phe Asp Ala His Gly Met Lys Glu Lys Ser Ala Leu Leu
165 170 175
Leu Glu Leu Thr Gly Leu Arg Phe Gly Phe Ile Gly Leu Ile Cys Leu
180 185 190
Ala Phe Leu Phe Leu Pro Val Ala Arg Gly Ser Val Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ile Asp Ile Pro Phe Glu His Ala Thr Arg Tyr His Val Trp Leu Gly
210 215 220
His Leu Thr Met Ala Leu Phe Thr Leu His Gly Leu Phe Tyr Val Ile
225 230 235 240
Gly Trp Ala Met Arg Gly Arg Leu Val Glu Glu Leu Val Asp Trp Lys
245 250 255
Asn Val Gly Val Ala Asn Leu Pro Gly Val Ile Ser Leu Ala Ala Gly
260 265 270
Leu Leu Met Trp Val Thr Ser Leu Pro Gly Leu Arg Arg Lys Asn Phe
275 280 285
Glu Leu Phe Phe Tyr Thr His Gln Leu Tyr Val Val Phe Val Val Phe
290 295 300
Leu Val Leu His Val Gly Asp Phe Ile Phe Met Met Ala Gly Ala Gly
305 310 315 320
Ile Phe Leu Phe Met Leu Asp Arg Phe Leu Arg Phe Phe Gln Ser Arg
325 330 335
Lys Thr Val Asp Ile Leu Ser Ala Thr Cys Phe Pro Cys Gly Thr Val
340 345 350
Glu Leu Val Ile Ser Lys Pro Ala Asn Leu Asp Tyr Asn Ala Leu Gly
355 360 365
Trp Ile Phe Leu Gln Ile Arg Glu Leu Ser Trp Leu Gln Trp His Pro
370 375 380
Phe Ser Val Ser Ser Ser Pro Leu Asp Gly Lys Gln His Leu Ala Ile
385 390 395 400
Leu Ile Lys Val Leu Gly Asp Trp Thr Glu Lys Leu Lys Gly Asn Ile
405 410 415
Leu Asn Leu Ser Val Glu Gln Ser Glu Thr Glu Pro Leu Leu Gln His
420 425 430
Asn Arg Lys Ile Thr Ala Ser Val Glu Gly Pro Tyr Gly His Glu Ser
435 440 445
Pro Tyr His Leu Thr Tyr Glu Asn Leu Ile Leu Val Ala Gly Gly Ile
450 455 460
Gly Ile Ser Pro Phe Leu Ala Ile Leu Ser Asp Ile Leu His His Ile
465 470 475 480
Asn Asp Gly Lys Pro Cys Leu Ser Arg Asn Ile Leu Ile Val Trp Ala
485 490 495
Ile Lys Asn Ser Asp Glu Leu Pro Leu Leu Asp Thr Val Asp Met Glu
500 505 510
Ala Ile Cys Pro Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Leu Glu Leu Gln Thr
515 520 525
Phe Val Thr Arg Glu Ser Gln Pro Pro Leu Glu Glu Gly Lys Thr Pro
530 535 540
Lys Ala Met Gln Pro Ser Ile Ser Pro Gly Phe Lys Gly Cys Arg Met
545 550 555 560
Ser Gly Leu Val Gly Thr Gly Asn Ile Val Trp Ser Gly Leu Tyr Val
565 570 575
Val Val Ser Thr Ile Gly Leu Val Ile Thr Thr Ala Ser Leu Asn Ile
580 585 590
Phe Tyr Val Asn Pro Phe Asn Val Tyr Tyr Trp Trp Tyr Lys Gly Leu
595 600 605
Leu Leu Ile Gly Cys Met Ala Ala Ser Ile Leu Ile Phe Gly Gly Leu
610 615 620
Val Ile Ala Leu Trp His Leu Trp Glu Arg Lys Thr Ser Ser Lys Glu
625 630 635 640
Glu Pro Glu Asp Asp Thr Lys Lys Val Asp Ile Leu Gln His Gln Asn
645 650 655
Glu Ala Ser Leu Pro Lys Ser Phe Gly Glu Ala Arg Phe Val Asn Asn
660 665 670
Ile Arg Tyr Gly Gln Arg Pro Asp Phe Gln Glu Ile Phe Gly Ser His
675 680 685
Ala Lys Ser Trp Gly Ser Val Asp Ile Gly Val Ile Val Cys Gly Pro
690 695 700
Pro Thr Leu Gln Thr Ser Val Ala Lys Glu Cys Arg Arg Gln Asn Leu
705 710 715 720
Gln Arg Arg Gly His Gln Ala Ile Phe His Phe Asn Ser His Ser Phe
725 730 735
Asp Leu
<210> 3
<211> 2223
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 3
atgggtgaac tctcaagcca agaacctctt cttttgaaaa aagaaaatga atttgattct 60
ctcagaaaga caccattttt aatctcatca acaaagttga ttctcaaagt attaatgtgg 120
gtgattttta tttcatgggc tgcttttatt ttcttgttgc caacaaagtt cactaatgaa 180
atttttggga caattgttgg agccaccaaa ggatctattt ttcggacagc aggtagcaca 240
tccttgttat tcagtttccc aattatcatg attgcatttc ttgcaattat tcttctcgtt 300
gtctcgggtg aagatcaacc tcaaatcaag aaggctggta aaggaccaac ttttagatta 360
tggacattcc ctgtgctggt ggatggacca tttggggttg ttacagctgc ggaaatgatt 420
ggcgttataa tcttctcggt ctacatcgtc tgggctgtag ttatgtatag tatacagaat 480
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gagctgacag gtctccgttt tggattcatt ggattaatct gcttagcgtt tttgtttctg 600
cctgttgcac gtggttcagt tcttcttcga gccatagata tcccttttga acatgccact 660
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tatattattg gctgggcaat tcaagggaga cttttggaag aactagtcgg ctggaaaaac 780
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tatgtggtgt ttgtggtgtt cctggctttg catgttggtg atttcgtctt catgatggct 960
ggagctggga tcttcctgtt catgcttgat cggttcctta gattcttcca gtcacgaaag 1020
acagttgaca tactttcggc cacatgcttt ccttgtggaa ccgttgaact cgttatttca 1080
aaacctgcaa atttacatta caacgctctt ggctggatat tcttacaaat acgcgagttg 1140
tcctggctgc agtggcaccc tttcagtgtc tcttctagtc cccttgatgg caaacatcat 1200
cttgcgattc tcataaaggt tcttggagat tggactgaaa aactgaaggg aaacatcttg 1260
aatctttctg tagaagaatc tgagacggag cctcttttgc tgcataacag gaaaattaca 1320
gcttctgttg aaggtcctta tggacatgaa tcaccatacc acttaacgta tgaaaatctc 1380
attttggtag caggtggaat tggaatttct cccttcctag ctatcctgag tgatatcctc 1440
caccgtatca acgatagctc gccttgcctg ccaagaaata tactaatagt atgggctatc 1500
aaaaactcag atgagcttcc acttcttgaa acagttgaca tggaggcaat ctgtccactt 1560
ttctctgata aactgaatct tgagattcaa acatatgtga cacgggaatc acagccttca 1620
ttggaggagg gtaaaacacc caaagcaatg caccactcaa tctcccctgg cttcaaagga 1680
tgtcgaatgt ctggtttggt tggtactgga catgtcgtat ggtctggatt atatgtcata 1740
gtatccacca tagggtttgt gatcactgta gcattgctgg acattttcta cataaatcca 1800
ttcaatataa cttactggtg gtacaagggg cttttgttga ttggatgcat gactgcaagt 1860
attcttatat ttgggggttt cgttatcgct ttatggcatc tttgggagag gaaaacctca 1920
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cctgatttcc aagagatatt tggatcacat gcaaagagct ggggaagtgt agatattggt 2100
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tag 2223
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<211> 740
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 4
Met Gly Glu Leu Ser Ser Gln Glu Pro Leu Leu Leu Lys Lys Glu Asn
1 5 10 15
Glu Phe Asp Ser Leu Arg Lys Thr Pro Phe Leu Ile Ser Ser Thr Lys
20 25 30
Leu Ile Leu Lys Val Leu Met Trp Val Ile Phe Ile Ser Trp Ala Ala
35 40 45
Phe Ile Phe Leu Leu Pro Thr Lys Phe Thr Asn Glu Ile Phe Gly Thr
50 55 60
Ile Val Gly Ala Thr Lys Gly Ser Ile Phe Arg Thr Ala Gly Ser Thr
65 70 75 80
Ser Leu Leu Phe Ser Phe Pro Ile Ile Met Ile Ala Phe Leu Ala Ile
85 90 95
Ile Leu Leu Val Val Ser Gly Glu Asp Gln Pro Gln Ile Lys Lys Ala
100 105 110
Gly Lys Gly Pro Thr Phe Arg Leu Trp Thr Phe Pro Val Leu Val Asp
115 120 125
Gly Pro Phe Gly Val Val Thr Ala Ala Glu Met Ile Gly Val Ile Ile
130 135 140
Phe Ser Val Tyr Ile Val Trp Ala Val Val Met Tyr Ser Ile Gln Asn
145 150 155 160
Val Asp Ile Leu Ser Leu Tyr His Leu Pro Asp Met Lys Glu Arg Ser
165 170 175
Ala Lys Leu Leu Glu Leu Thr Gly Leu Arg Phe Gly Phe Ile Gly Leu
180 185 190
Ile Cys Leu Ala Phe Leu Phe Leu Pro Val Ala Arg Gly Ser Val Leu
195 200 205
Leu Arg Ala Ile Asp Ile Pro Phe Glu His Ala Thr Arg Tyr His Val
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Trp Leu Gly His Leu Thr Met Ala Ile Phe Ser Leu His Gly Leu Phe
225 230 235 240
Tyr Ile Ile Gly Trp Ala Ile Gln Gly Arg Leu Leu Glu Glu Leu Val
245 250 255
Gly Trp Lys Asn Ile Gly Ile Ala Asn Leu Pro Gly Val Ile Ser Leu
260 265 270
Leu Ala Gly Leu Leu Met Trp Leu Thr Ser Leu Pro Gly Val Arg Arg
275 280 285
Lys Asn Phe Glu Leu Phe Phe Tyr Thr His Gln Leu Tyr Val Val Phe
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Val Val Phe Leu Ala Leu His Val Gly Asp Phe Val Phe Met Met Ala
305 310 315 320
Gly Ala Gly Ile Phe Leu Phe Met Leu Asp Arg Phe Leu Arg Phe Phe
325 330 335
Gln Ser Arg Lys Thr Val Asp Ile Leu Ser Ala Thr Cys Phe Pro Cys
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Ala Leu Gly Trp Ile Phe Leu Gln Ile Arg Glu Leu Ser Trp Leu Gln
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Trp His Pro Phe Ser Val Ser Ser Ser Pro Leu Asp Gly Lys His His
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Leu Ala Ile Leu Ile Lys Val Leu Gly Asp Trp Thr Glu Lys Leu Lys
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Gly Asn Ile Leu Asn Leu Ser Val Glu Glu Ser Glu Thr Glu Pro Leu
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Val Trp Ala Ile Lys Asn Ser Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Thr Val
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515 520 525
Ile Gln Thr Tyr Val Thr Arg Glu Ser Gln Pro Ser Leu Glu Glu Gly
530 535 540
Lys Thr Pro Lys Ala Met His His Ser Ile Ser Pro Gly Phe Lys Gly
545 550 555 560
Cys Arg Met Ser Gly Leu Val Gly Thr Gly His Val Val Trp Ser Gly
565 570 575
Leu Tyr Val Ile Val Ser Thr Ile Gly Phe Val Ile Thr Val Ala Leu
580 585 590
Leu Asp Ile Phe Tyr Ile Asn Pro Phe Asn Ile Thr Tyr Trp Trp Tyr
595 600 605
Lys Gly Leu Leu Leu Ile Gly Cys Met Thr Ala Ser Ile Leu Ile Phe
610 615 620
Gly Gly Phe Val Ile Ala Leu Trp His Leu Trp Glu Arg Lys Thr Ser
625 630 635 640
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<212> DNA
<213> 茄子(Solanum melongena)
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atgggtgaac tctcaggcca agaaccttta cttttgaaaa aagaagaatt taattatctc 60
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gaagggaaaa ttattaaagc caccaaagga actatttttg ggactacagg aagcacattc 240
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ctcttatcct tgtttcatcc aagagacatg aaagagagaa gtgctctgtt tctggaggta 540
acaggcctcc gttttggatt cattggatta atctgcttag catttttgtt tctgcctgtt 600
gcacgtggtt cagttcttct tcgagctata gatatccctt ttgaacatgc cactagatat 660
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atagccaatc ttccaggagt gatcagcctt gcagctggtt tattgatgtg ggtgacttca 840
cttcccggat taaggagaaa aaactttgaa ctgttcttct atacgcatca attgtatgtg 900
gtgttcgtgg tgttcctggc cttgcatgtt ggtgatttca tcttcatgat ggctggagct 960
gggatcttcc tgttcatgct tgatcggttc cttagattct tccagtcacg aaagacagtg 1020
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gagggtaaaa cacccaaagc aatgcaaacc ccgtcaatct gccctggctt caagggatgt 1680
caaatgtctg gtttggttgg tactggaaat gttgtatggt ctggattata tgtcatagta 1740
tccaccatag ggttggtgat cactgtagcg ttgctggaca tttactacat aaatccattc 1800
aatgtaactt actggtggta caagggactt ttgttgattg gatgcatgac tgcaagtatt 1860
cttatatttg ggggtttcgt tatcatttta tggcatcttt gggaaaggaa agccccatcg 1920
aaggaggaac cagaggatgc cacacagata gttgacgttt tgcagcagca gcagcagaat 1980
gaagcctctt tacccaagag ttctggagag gctcgatatg ttaataatat tcgatatggt 2040
caaagaccag atttccaaga gatatttgga tcacatgcaa agagttgggg aagtgtagat 2100
ataggtgtga ttgtgtgtgg tcctcctact cttcaatcca gtgttgctaa agagtgcaga 2160
agtcagaact tgcagagaag aggccatcag gctattttcc acttcaacag ccacagtttt 2220
gacctctag 2229
<210> 6
<211> 742
<212> PRT
<213> 茄子(Solanum melongena)
<400> 6
Met Gly Glu Leu Ser Gly Gln Glu Pro Leu Leu Leu Lys Lys Glu Glu
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Phe Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Pro Leu Trp Val Ser Ser Thr Lys Leu
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Ile Leu Asn Val Val Ile Trp Val Thr Phe Ile Ala Trp Ala Ala Phe
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tactggtggt acaaggggct tttgttgatc ggatgcatgg ctgcaagtat tcttatattt 1860
gggggtccag tgatcgcttt atggcatttt tgggaaagga aaaccttatt gaaggaggaa 1920
tcagaggatg tcaaaaagaa ggttgacatc cagcagcaga atgaggctag tttacaaaag 1980
aatcttgggg aggctcgata tgtcaataat attcgatatg gtgaaagacc tgatttccaa 2040
gaaatatttg gattacatgc aaagagttgg ggaagtgtag atattggtgt catagtgtgt 2100
ggtcctccta ctcttcagtc cagtgttgct aaagagtgca gaaggcagaa cttgcaaaga 2160
agagggcatg aggccatttt ccattttaac agccacagtt ttgacctcta g 2211
<210> 12
<211> 736
<212> PRT
<213> 腋花矮牵牛(Petunia axillaris)
<220>
<223> 3
<400> 12
Met Gly Glu Tyr Ser Gly Gln Glu Pro Leu Leu Leu Lys Lys Glu Asp
1 5 10 15
Asp Phe Asn Tyr Leu Lys Lys Thr Pro Phe Trp Ile Pro Ser Thr Lys
20 25 30
Leu Ile Leu Lys Val Val Met Trp Val Ile Phe Ile Ala Trp Ala Thr
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Leu Pro Thr Asn Phe Met Lys Glu Leu Gln Glu Lys
50 55 60
Cys Ile Glu Ala Thr Asn Gly Thr Ile Phe Gly Glu Thr Gly Ser Ile
65 70 75 80
Phe Leu Met Phe Ser Phe Pro Ile Leu Ile Ile Ala Phe Leu Ala Ile
85 90 95
Ile Arg Leu Ala Leu Ser Thr Gly Glu Asp Glu Pro Leu Val Lys Lys
100 105 110
Thr Ala Lys Gly Pro Asn Phe Arg Leu Trp Thr Phe Pro Val Leu Val
115 120 125
Asp Gly Pro Leu Gly Val Val Thr Ala Ala Glu Met Ile Gly Ile Ile
130 135 140
Val Phe Ser Val Tyr Ile Ile Cys Ala Val Ile Met Tyr Thr Ile Arg
145 150 155 160
Asn Ile Asp Ala Leu Ser Trp Phe His Leu Glu Glu Thr Asn Arg Ser
165 170 175
Ala Leu Phe Leu Gln Leu Thr Gly Arg His Leu Gly Ser Met Gly Leu
180 185 190
Val Cys Leu Gly Phe Leu Phe Leu Pro Val Ala Arg Gly Ser Val Leu
195 200 205
Leu Arg Ala Ile Asp Ile Pro Phe Glu His Ala Ile Arg Tyr His Val
210 215 220
Trp Leu Gly His Leu Thr Met Ala Leu Phe Ser Leu His Gly Leu Phe
225 230 235 240
Tyr Val Ile Gly Trp Ala Met Arg Gly Arg Leu Val Glu Met Val Ser
245 250 255
Val Gly Val Ala His Leu Pro Gly Val Ile Ser Leu Ala Ala Gly Leu
260 265 270
Val Met Trp Val Thr Ser Leu Pro Gly Val Arg Arg Lys Asn Phe Glu
275 280 285
Leu Phe Phe Tyr Thr His Gln Leu Tyr Val Val Phe Val Val Phe Leu
290 295 300
Ala Leu His Val Gly Asp Phe Thr Phe Val Ile Ala Gly Ala Gly Ile
305 310 315 320
Phe Leu Phe Met Leu Asp Arg Phe Leu Arg Phe Cys Gln Ser Arg Arg
325 330 335
Thr Val Asp Ile Leu Ser Ala Thr Cys Leu Pro Cys Gly Thr Ile Glu
340 345 350
Val Val Leu Pro Lys Pro Ala Asn Leu His Tyr Asn Ala Leu Gly Trp
355 360 365
Ile Phe Leu Gln Ile Arg Glu Leu Ser Leu Leu Gln Trp His Pro Phe
370 375 380
Ser Val Ser Ser Ser Pro Leu Asp Gly Lys His His Ile Ala Ile Leu
385 390 395 400
Ile Lys Gly Leu Gly Asp Trp Thr Glu Lys Leu Lys Gly Arg Ile Leu
405 410 415
Asn Leu Ser Val Glu Gln Phe Glu Met Glu Pro Leu Leu Gln His Asn
420 425 430
Ser Lys Ile Thr Ala Ser Val Glu Gly Pro Tyr Gly His Glu Ser Pro
435 440 445
Tyr His Leu Thr Tyr Glu His Leu Ile Leu Val Ala Gly Gly Ile Gly
450 455 460
Ile Ser Pro Phe Leu Ala Ile Leu Ser Asp Ile Leu His Arg Ile Asn
465 470 475 480
Asp Ser Arg Pro Cys Leu Pro Arg Asn Ile Leu Ile Val Trp Ala Ile
485 490 495
Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu Asp Met Glu Ala
500 505 510
Ile Cys Pro Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Leu Glu Ile Gln Thr Phe
515 520 525
Val Thr Arg Glu Ser Gln Pro Ser Val Glu Glu Gly Lys Thr Pro Asn
530 535 540
Ala Met Asn Thr Ser Ile Cys Pro Gly Phe Lys Gly Cys Gln Met Ser
545 550 555 560
Ser Leu Ile Gly Thr Gly Asn Val Ile Trp Ser Gly Leu Tyr Val Ile
565 570 575
Val Ser Thr Ile Gly Leu Val Ile Thr Val Ala Leu Leu Asn Ile Phe
580 585 590
Tyr Ile Asn Pro Phe Asn Val His Tyr Trp Trp Tyr Lys Gly Leu Leu
595 600 605
Leu Ile Gly Cys Met Ala Ala Ser Ile Leu Ile Phe Gly Gly Pro Val
610 615 620
Ile Ala Leu Trp His Phe Trp Glu Arg Lys Thr Leu Leu Lys Glu Glu
625 630 635 640
Ser Glu Asp Val Lys Lys Lys Val Asp Ile Gln Gln Gln Asn Glu Ala
645 650 655
Ser Leu Gln Lys Asn Leu Gly Glu Ala Arg Tyr Val Asn Asn Ile Arg
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Ser Trp Gly Ser Val Asp Ile Gly Val Ile Val Cys Gly Pro Pro Thr
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<210> 13
<211> 522
<212> DNA
<213> 辣椒(Capsicum annuum)
<400> 13
atgagcaaac ctggttgtga taacaaagag gaaatgcata aaggatcttg gtctaaacaa 60
gaagatcaaa aactcattga ttatatcact aaacatggtg aaggttgttg gagagattta 120
cctaaagctg ctggtctact tcgttgcgga aaaagttgta ggctaagatg gatgaattat 180
cttaacccaa atttaaaaag aggaaatttt tctgaggatg aagatgatct catcatcaag 240
cttcatgctc ttcttggcaa taggtggtcc ttaatagctg gaagattgcc aggaagaact 300
gataatgaag tgaagaatta ttggaattcc catttgagaa gaaaacttat aaaaatggga 360
atcgatccaa aaaatcataa tatttctcat tatcttcgta taaaaagact tgaatatttc 420
caagaaaatg gcataaaatc agaaaataat gcagtaatat ctgatgctac aagttctaat 480
tgtgttacaa gttcattgcc tgatcttaat tcacttccat ag 522
<210> 14
<211> 173
<212> PRT
<213> 辣椒(Capsicum annuum)
<400> 14
Met Ser Lys Pro Gly Cys Asp Asn Lys Glu Glu Met His Lys Gly Ser
1 5 10 15
Trp Ser Lys Gln Glu Asp Gln Lys Leu Ile Asp Tyr Ile Thr Lys His
20 25 30
Gly Glu Gly Cys Trp Arg Asp Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Asn Pro Asn
50 55 60
Leu Lys Arg Gly Asn Phe Ser Glu Asp Glu Asp Asp Leu Ile Ile Lys
65 70 75 80
Leu His Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Val Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu
100 105 110
Arg Arg Lys Leu Ile Lys Met Gly Ile Asp Pro Lys Asn His Asn Ile
115 120 125
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130 135 140
Ile Lys Ser Glu Asn Asn Ala Val Ile Ser Asp Ala Thr Ser Ser Asn
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165 170
<210> 15
<211> 537
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 15
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gaagatcaaa aactcattga ttatatcact aaacatggtg aaggttgctg gagaaattta 120
cctaaagctg ctggcctgct tcgttgtgga aaaagttgta ggctaagatg gatgaattat 180
cttaatccaa atctaaaaag aggaaatttt tctgaggatg aagatgatct aatcatcaag 240
cttcatgctc tccttggcaa taggtggtcg ttaatagcag gaagattgcc aggacgaacg 300
gataatgaag tgaagaatta ttggaattct catttgacaa gaaaacttat aaaaatggga 360
attgatccaa aaaatcatag gctatctcat tatcttcaca taaaaagact tgaattactc 420
caagaaaata acacaagatt agaaaatgtt ggagtaatat ctgatgctac aagttcttat 480
gctaataaag atcaacaaat tacaagttca ttgcttgatc tcaatttaat tccatag 537
<210> 16
<211> 178
<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 16
Met Arg Lys Pro Cys Cys Asp Asn Lys Glu Glu Met His Lys Gly Ala
1 5 10 15
Trp Ser Lys Gln Glu Asp Gln Lys Leu Ile Asp Tyr Ile Thr Lys His
20 25 30
Gly Glu Gly Cys Trp Arg Asn Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Met Asn Tyr Leu Asn Pro Asn
50 55 60
Leu Lys Arg Gly Asn Phe Ser Glu Asp Glu Asp Asp Leu Ile Ile Lys
65 70 75 80
Leu His Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Val Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu
100 105 110
Thr Arg Lys Leu Ile Lys Met Gly Ile Asp Pro Lys Asn His Arg Leu
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Ile Pro
<210> 17
<211> 555
<212> DNA
<213> 腋花矮牵牛(Petunia axillaris)
<400> 17
atgagaaagg cttgctgtga taacaaggag gaaatgcata gaggagcttg gtctaagcaa 60
gaagaccaga agctcattga ttatatcact aagcatggcg caggttgctg gcgaaattta 120
cctaaagctg ccggtctgct tcgttgcggt aaaagttgca ggctaagatg gatgaattat 180
cttagcccaa accttaaaag aggaaatttt tctgaggatg aagaggatct catcatcaag 240
cttcatgccc tacttggcaa caggtggtct ctaatagcgg gtagattgcc agggcgcact 300
gataatgaag tgaagaacta ttggaattcc catttgagaa gaaaacttat aaaaatggga 360
attgatccaa agaatcatag gatatctcat tatcttcata ggaaaagact tgagtattgg 420
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tgtgcacaac cgtag 555
<210> 18
<211> 184
<212> PRT
<213> 腋花矮牵牛(Petunia axillaris)
<400> 18
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Ile His Ser Ser Cys Ala Gln Pro
180
- 富含花青苷浓度的茄科植物
- 一种富含花青苷的低酒度黄酒及其生产方法