一种硒寡糖冻干粉及其在制备用于海参富硒化养殖的富硒饲料中的应用

技术领域

本发明属于海产养殖技术领域，具体涉及一种硒寡糖冻干粉及其在制备用于海参富硒化养殖的富硒饲料中的应用。

背景技术

很多生物体内包含必要的硒蛋白(谷胱甘肽过氧化物酶、甲酸脱氢酶、硒磷酸合成酶等)，因此它们需要微量元素硒才能发挥正常的细胞学功能。硒具有抗氧化、抗衰老、抗癌、防治心脑血管疾病等多方面的生物学功效，硒也是人体谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心，其对人类健康十分重要，因此近年来硒成为人们关注的焦点。世界上的很多地区都缺硒，硒缺乏会导致甲状腺功能减退、免疫系统减弱以及诱发多种疾病，比如癌症、心脑血管病、肝病和克山病、大骨节病等。

我国是一个缺硒大国，据《中华人民共和国地方疾病与环境因素图集》揭示，我国存在一条低硒地带，占我国土地面积的72％，其中30％为严重缺硒地区，而约七亿人生活在这片低硒地区。据统计，我国成人每日的平均摄硒量仅为26-32μg，远低于中国营养学会推荐的硒安全和适宜摄入量(50μg/d-250μg/d)下限。全世界也有四十多个国家和地区属于缺硒地区。早在1973年，世界卫生组织(WHO)就宣布硒是人体及动物生命中不可缺少的微量元素，过去十年的研究也表明，硒除了满足基本营养要求外，还具有许多潜在的健康益处，中国营养学会也已将硒列入到十五种每日膳食营养素中。因此，开发富硒食品作为补硒营养源受到国内外的广泛关注。

在各种硒化物中，无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，且生物活性弱、毒性强、吸收率低、环境污染大。而有机硒与无机硒相比，具有较高生物活性(比无机硒高约100倍)和较低毒性。有机硒的生物利用率远高于无机硒，且毒性较小、适应性好，所以有机硒具有生物利用度高、安全性高等优势，已渐渐成为补硒产品的主流。在许多发达国家，无机硒已被明令禁止直接添加到动物饲料中，但在我国一些严重缺硒地区，由于有机硒价格太高，人体补硒仍在使用亚硒酸钠等无机硒，许多保健品、硒营养强化食品，甚至包括一些药品中也在添加无机硒盐，更不用说使用量巨大的养殖业。因此，寻找高效、低毒和价格低廉的有机硒化合物具有十分重要的意义。

将无机硒与海藻多糖通过生化反应使之成为有机硒化合物-硒化卡拉胶(一种硒多糖)，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。将硒与海藻多糖结合使之成为有机硒化合物-海藻硒多糖，不仅保持了海藻多糖的基本构型和活性，还很大程度提高了生物可利用度，同时具备了硒元素的重要生物学功能，还消除了硒的毒性和副作用，且海藻硒多糖具有生物活性强，环境污染小等特点。海藻硒多糖主要来源于天然硒多糖和人工合成硒多糖，天然硒多糖由于含量低，提取分离困难，成本太高而很难得到推广应用，而人工合成硒多糖主要手段为生物化学手段，可以实现规模化生物合成海藻硒多糖，成本较低，为该产品实际应用奠定了物质基础。海藻硒多糖这种有机硒化合物既消除了硒的毒副作用，又具有很高的生理活性。但是未降解的硒多糖粘度大、分子量大、水溶性差、不易扩散，导致其在生物体内吸收较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硒寡糖冻干粉，该硒寡糖冻干粉是由本发明从深海冷泉泥样中分离得到的芽孢杆菌N1-1发酵所产的硒化卡拉胶酶分解硒化卡拉胶后干燥得到的。

进一步的，芽孢杆菌N1-1的分类命名为Bacillus sp.，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20357。所述芽孢杆菌N1-1的适合生长温度为25-37℃，最适生长温度为30℃。

进一步的，所述硒寡糖冻干粉的制备步骤如下：

(1)将所述芽孢杆菌N1-1以2.5％的接种量接种到发酵培养基中，于35℃、150r/min恒温培养过夜，收集发酵液得到硒化卡拉胶酶酶液，将酶液进行真空冷冻干燥，得到硒化卡拉胶固化酶制剂；

(2)将所述硒化卡拉胶固体酶制剂溶解至浓度5mg/mL，与0.2％硒化卡拉胶溶液以1∶9的体积比混合，在40℃、pH为8.0条件下反应12h，然后加热煮沸15min停止反应，冷却至室温，于7500r/min离心15min以去除未酶解的不溶性片段去除未酶解的不溶性片段，留取反应液即为硒寡糖溶液；

(3)将硒寡糖溶液在8-14KD的透析袋中进行透析，透析外液60℃旋转蒸发浓缩，冷冻干燥后得到硒寡糖冻干粉。

进一步的，所述步骤(1)中的发酵培养基组分包括2gκ-卡拉胶、1g酵母粉、0.1g氯化钙，1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.0。

进一步的，所述步骤(1)中的真空冷冻干燥条件为：预冻温度-40℃、保护剂海藻糖浓度2.0％、酶液厚度5mm、预冻时间10h。

进一步的，所述步骤(1)中得到的硒化卡拉胶酶的酶活为8.416U/mL，能够有效地水解硒化卡拉胶。

进一步的，所述步骤(2)中得到的硒寡糖是以二糖和四糖为主的低聚糖。

进一步的，所述硒寡糖冻干粉的含硒量为48.69±0.95μg/g。

本发明的另一目的在于提供硒寡糖冻干粉在制备用于海参富硒化养殖的富硒饲料中的应用。本发明针对海参的生长习性，制备出适合海参生长的富硒饲料，该富硒饲料环保不污染水质，在满足海参全部营养需求的同时，还可以提高海参体内的硒含量，提高海参的营养价值，促进海参产业的健康可持续发展。

进一步的，所述硒寡糖冻干粉添加到基础饲料中混合制备出富硒饲料。

进一步的，所述富硒饲料的组分包括：马尾藻3份、鼠尾藻1份、大叶菜1.5份、海带粉1份、扇贝粉1份、虾粉1份、牡蛎粉1份、海虹粉1份、海泥10份、低聚糖0.4份、乳酸芽孢M30.4份、酵母0.3份、硒寡糖冻干粉0.1-0.2份。

进一步的，所述富硒饲料的制备方法为：将所述富硒饲料中所有成分粉碎后过150目筛，混合后加水至半散状态后拌匀，然后使用颗粒机进行加工制粒，在制粒后的饲料颗粒表面喷涂油脂，自然冷却后包装，得到富硒饲料。

进一步的，所述富硒饲料的使用方法为：于每日的早7点和晚16点，以海参总重量的4.00％～5.00％作为投喂量给海参投喂富硒饲料。

进一步的，海参的富硒化养殖方法为：将海参投放入养殖池塘内，在每天的早7点和晚16点投喂两次海参，投喂量为海参总重量的4.00％～5.00％；每日监测室温及水温，使养殖室温保持在18-28℃，水温保持在13-21℃；每天吸除粪便，并将池底、池壁、瓦片、充氧管等冲洗干净；每两天全部换水一次，直至海参达到目标重量。

进一步的，使用了所述富硒饲料养殖的富硒海参体壁硒含量、内脏硒含量明显增加。

进一步的，所述富硒海参体内谷胱甘肽过氧化物酶及总抗氧化能力显著增加。

进一步的，所述富硒海参肠道内有益菌群红杆菌(Rhodobacteraceae sp)和亚硫酸杆菌(Sulfitobacter sp.)相对丰度上升。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和技术效果：

本发明从深海冷泉泥样分离得到一株芽孢杆菌N1-1，其能够发酵生产出硒化卡拉胶酶，且得到的硒化卡拉胶酶酶活力达到8.416U/mL，可以有效地水解硒化卡拉胶，为硒化卡拉胶寡糖的制备提供了一种新的方式。

本发明利用硒化卡拉胶酶水解硒化卡拉胶得到的以二糖和四糖为主的硒寡糖，该硒寡糖具有分子量小、含硒量高、黏度小，易被生物体吸收的优点。本发明再将硒寡糖干燥制备成硒寡糖冻干粉，然后将硒寡糖冻干粉添加到普通养殖海参的基础饲料中制成富硒饲料，按常规方法喂养海参，使海参体壁含硒达到0.20μg/g-2.0μg/g的富硒标准，通过富硒化养殖，不仅可以提高海参体内的硒含量，而且提高了海参的抗氧化能力和有益菌(Rhodobacteraceae sp.、Sulfitobacter sp.)丰度，提高海参营养价值的同时保障了海参健康高效养殖；并且海参体壁中未检出硒酸根离子及亚硒酸跟离子等无机硒，人体能够安全吸收利用。因此，本发明以硒寡糖作为外源硒添加，无毒性，使用安全性高，且可保证海参成活率的前提下，实现海参的健康养殖，具有良好的经济效益和广阔的推广应用前景。

附图说明

图1：芽孢杆菌N1-1的菌落形态特征；

图2：TLC产物分析，其中M：marker、C：control、1-11：硒寡糖样品；

图3：硒寡糖冻干粉末；

图4：大号海参体壁硒含量变化趋势；

图5：小号海参体壁硒含量变化趋势；

图6：大号海参内脏硒含量变化趋势；

图7：小号海参内脏硒含量变化趋势；

图8：海参肠道内红杆菌Rhodobacteraceae sp.富硒养殖后相对丰度变化；

图9：海参肠道内亚硫酸杆菌Sulfitobacter sp.富硒养殖后相对丰度变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则使用试剂和仪器均为市售产品。

实施例1：芽孢杆菌N1-1的筛选和鉴定

1、芽孢杆菌N1-1的筛选和活化

称取深海冷泉海泥沉积物1g，加入9mL无菌海水，取0.1mL逐级稀释为10-2～10-6浓度涂布于平板培养基(5g蛋白胨、1g酵母粉、0.1g磷酸铁、15g琼脂粉、1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.6)，在25℃恒温培养箱里培养。据菌落形态、大小等特征挑取单菌落，划线分离纯化3次后，直至获得多种纯细菌培养物。然后，配置2216E发酵培养基(5g蛋白胨、1g酵母粉、0.1g磷酸铁、1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.6)，高温灭菌后恢复常温，用接种环将纯化好的菌株接入发酵培养基中，置于恒温振荡培养箱，25℃，150rpm活化培养。

将活化后的不同菌株使用固体选择培养基(5g蛋白胨、1g酵母粉、15g硒化卡拉胶、15g琼脂粉，1000mL经0.22μm膜过滤的海水)进行点板测试，25℃培养16h后，用卢戈氏碘液染色，观察平板是否出现透明圈；对出现透明圈的平板上的菌株复筛三次后，筛选得到一株能够降解硒化卡拉胶的菌株，将该菌株命名为N1-1。如图1所示，所述菌株N1-1为革兰氏阳性菌，其菌落呈黄色，近圆形，边缘光滑，表面粗糙不透明，直径2-3mm。

2、芽孢杆菌N1-1的鉴定

对菌株N1-1进行16SrRNA扩增测序，然后将菌株N1-1的测序结果在NCBI-BLAST进行比对，结果显示，菌株N1-1与芽孢杆菌属的菌株的亲缘关系最近，因此确定该菌株N1-1为芽孢杆菌Bacillus sp.。

将菌株N1-1进行菌种保藏，所述芽孢杆菌Bacillus sp.的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年07月14日；芽孢杆菌Bacillus sp.的保藏编号为CGMCC No.20357。

实施例2：硒寡糖冻干粉的制备

(1)将芽孢杆菌N1-1以2.5％的接种量接种到发酵培养基中，于35℃、150r/min恒温培养过夜，收集发酵液即为硒化卡拉胶酶酶液，然后将酶液利用真空冷冻干燥机进行真空冷冻干燥(条件为：预冻温度-40℃、保护剂海藻糖浓度2.0％、酶液厚度5mm、预冻时间10h)制得硒化卡拉胶固化酶制剂。

用DNS(3，5-二硝基水杨酸)法测定硒化卡拉胶酶的活性。具体地，1mL酶液与1mL0.2％硒化卡拉胶底物(pH＝7.4)混合，在40℃的温度下，置于恒温水浴锅中反应3.0h，以100℃灭活的酶液作为对照组。取1mL反应液、1.5mL DNS溶液于25mL比色管中，沸水中加热反应15min，冷却至室温(冰浴)后，定容至25mL并摇匀，在波长600nm(OD

其中，发酵培养基是根据芽孢杆菌N1-1的产酶条件检测获得，该发酵培养基的配方为2gκ-卡拉胶、1g酵母粉、0.1g氯化钙，1000mL经0.22μm膜过滤的海水，pH为7.0。

(2)将在最佳冻干工艺条件下制得的500mL硒化卡拉胶固体酶制剂(5mg/mL)与4.5L 0.2％硒化卡拉胶溶液混合，在40℃、pH为8.0条件下反应12h，然后加热煮沸15min停止反应，冷却至室温，7500r/min离心15min以去除未酶解的不溶性片段，留取反应液即为小分子的硒寡糖溶液。

采用薄层层析(TLC)的方法分析硒化卡拉胶固体酶制剂酶解硒化卡拉胶反应体系中还原糖的变化，以卡拉胶低聚糖为标准品。结果图2所示，随着反应时间的增加，体系中还原糖的含量不断增加，聚合度为二和聚合度为四的卡拉胶低聚糖量不断的增加，由此确定由芽孢杆菌N1-1发酵产生的硒化卡拉酶分解硒化卡拉胶得到的硒寡糖中主要存在聚合度二和聚合度四的低聚糖。

(3)将降解后的硒寡糖反应液在透析袋(8-14KD)进行透析，小分子的糖(小于8000Da)则存在于透析外液内，将透析外液进行60℃旋转蒸发并浓缩，冷冻干燥(冷阱温度达到-40℃以下，真空度为1.0pa)后即得到小于8000Da的淡黄色的硒寡糖冻干粉，如图3所示。

采用紫外分光光度法对硒寡糖冻干粉进行含硒量的测定，该硒寡糖冻干粉的含硒量为48.69±0.95μg/g。

实施例3：富硒海参的养殖

1、硒寡糖饲料的制备

将实施例2制备得到的硒寡糖冻干粉添加到基础饲料中；具体的，将基础饲料的所有组分和硒寡糖冻干粉进行混合，并加水至半散状态后拌匀，然后使用颗粒机对其进行加工制粒，制粒后在饲料颗粒表面喷涂油脂，自然冷却后包装，即为用于富硒海参养殖的富硒饲料。

其中，基础饲料由以下质量份数的成分组成：马尾藻3份、鼠尾藻1份、大叶菜1.5份、海带粉1份、扇贝粉1份、虾粉1份、牡蛎粉1份、海虹粉1份、海泥10份、低聚糖0.4份、芽孢M3 0.4份、酵母0.3份；上述每种饲料成分均需要单独粉碎并过150目筛，同时保证粉碎的饲料要100％通过筛网。

2、硒寡糖添加量检测

本发明对海参养殖时硒寡糖冻干粉添加量进行了小试试验，分别将0.1、0.2、0.4、0.8份的硒寡糖冻干粉添加到基础饲料中，并按照上述的方法制备出含有不同质量硒寡糖冻干粉的富硒饲料。

选择质量、大小相近的刺参分组后集中在室内海参池塘暂养两周：每日向海参投喂富硒饲料两次(早7点和晚16点)，每次的投喂量为海参总重量的4.00％～5.00％；每日监测室温及水温；每天吸除养殖池粪便，并将池底、池壁、瓦片、充氧管等冲洗干净；每天检查海参数量，饲料是否有剩余，并保持每两天全部换水一次。

结果显示：添加0.1、0.2、0.4、0.8份的硒寡糖冻干粉的富硒饲料养殖的刺参的成活率均在85％以上，而0.1份和0.2份的成活率为100％。

3、海参的富硒化养殖

选择不同的刺参食用品种，即刺参科中的刺参(Stichopus japonicus)和花刺参(Stichopus variegates)进行富硒化养殖：

(1)制备富硒饲料：取经过粉碎并过150目筛的饲料成分进行混合，饲料成分组成为：马尾藻3份、鼠尾藻1份、大叶菜1.5份、海带粉1份、扇贝粉1份、虾粉1份、牡蛎粉1份、海虹粉1份、海泥10份、低聚糖0.4份、乳酸芽孢M3 0.4份(购买于山东山东宝来利来生物产业集团)、酵母0.3份、硒寡糖冻干粉0.2份，混合后加水至半散状态后拌匀，然后使用颗粒机对其进行加工制粒，制粒后在饲料颗粒表面喷涂油脂，自然冷却后包装，得到富硒饲料。

(2)将室内海参养殖池塘中间设置隔断，分别将初始体质量70g±10g小号海参与初始体质量100g±10g大号海参放入池塘中，每组100头，向刺参投喂上述的富硒饲料作为实验组，富硒饲料的日投喂量为刺参总重量的4.00％～5.00％，并根据刺参大小、水温、摄食情况及残饵量加以调整，配合饲料易败坏水质，要保证勤投少投。另一个养殖池塘中放入同样的两组海参，以未添加硒源的基础饲料作为对照组，均按常规方法喂养。

常规喂养方法为：每日分别在早7点和晚16点投喂两次海参；每日监测室温及水温，使养殖室温保持在18-28℃，水温保持在13-21℃；每天吸除粪便，并将池底、池壁、瓦片、充氧管等冲洗干净；每两天全部换水一次；集中暂养一个月。

(3)在养殖的过程中，每5天取一次样，并记录取样时间，每组海参取3头，每次取样用海水冲洗后测定湿重，做记录，见表1。每10天将各组成参的体壁、内容物冷冻干燥，并研磨成粉末，按照原子吸收光谱法测定各组织内硒的含量。

结果如图4-7所示，经过富硒化养殖30天后的大号刺参体壁硒含量比对照组增加了74.4％，达到了达到2μg/g，内脏硒含量比对照组增加了88％，达到了8.24μg/g；小号刺参体壁硒含量比对照组增加了50.4％，达到了1.8μg/g，内脏硒含量比对照组增加了86.6％，达到了7.59μg/g，由此可见，使用了本发明的富硒饲料养殖的富硒刺参比普通养殖刺参组织内的硒含量得到明显提高，且海参的存活率高达100％。

(4)养殖一个月后，将收集的海参体腔液在4℃下以4000rpm离心10分钟，然后将上清液用于分析。每个样品的丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性(谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC))均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按照制造商的说明进行测定。每个测试样品进行三次重复，在恒定温度下用酶标仪SpectraMax M2进行吸光度读取，对不同组海参的抗氧化指标进行检测。抗氧化指标结果见表2，富硒化养殖的海参体内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及总抗氧化能力(T-AOC)指标显著上升，丙二醛(MDA)含量显著下降，说明使用了本发明的富硒饲料养殖的海参体内的抗氧化能力显著高于普通养殖的海参。

表1海参湿重

表2海参体内抗氧化指标变化

(5)对养殖后的不同海参进行有益菌群相对丰富度检测。

采用SDS方法对海参肠道内容物样本的基因组DNA进行提取，使用通用引物515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′和907R：5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′扩增样本16S rDNA的V4-V5区域。使用

检测结果如图7-8所示，经过富硒化养殖的海参肠道内有益菌群红杆菌(Rhodobacteraceae sp)和亚硫酸杆菌(Sulfitobacter sp.)相对丰度上升；说明使用了本发明的富硒饲料养殖的海参体内的有益菌群相对丰富度显著提高。

经过富硒化养殖的海参成活率在85％以上，成活率最高为100％，且海参体壁中未检出硒酸根离子及亚硒酸跟离子等无机硒，因此人体食用后富硒海参后，能够安全吸收利用；

(6)对富硒化养殖后的海参进行质量评价：富硒海参外形端正，与普通刺参无明显差异，色泽颜色鲜亮，口感细腻光滑。

综上，通过在海参养殖饲料中添加本发明制备的硒寡糖冻干粉做为有机硒源进行刺参富硒化养殖，在保证刺参成活率的同时，两种食用刺参体内主要可食用部分体壁中的硒含量得到大幅度提高，而且提高了海参的抗氧化能力和红杆菌、亚硫酸杆菌等有益菌的丰度，保障了海参健康高效养殖；并且居民每天食用200g以上含硒量在1mg/kg以上的富硒海参，就能达到健康安全补硒的目标，因此，通过食用富硒海参，可实现全民安全补硒、促进人类健康的目标，提高了刺参的营养价值及养殖效益，具有良好的经济效益和广阔的推广应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。