（+）-大麻素类的合成及其治疗作用

技术领域

本发明涉及一种生产式(I)化合物

或式(I)化合物的盐的方法。下文解释了X和n的含义，并在下面的公开中确定了优选化合物。本发明还涉及式(I)化合物或式(I)化合物的盐，其用于实现一种或多种治疗作用的治疗方法，以及用于治疗和/或预防某些疾病。此外，本发明提供了一种药物组合物，其包含一种或多种式(I)化合物或一种或多种式(I)化合物的盐。

背景技术

大麻中最常见的大麻素，大麻二酚(CBD)，由于其广泛的生物活性谱，其在医学上的应用越来越受到人们的关注。CBD作为一种有效的药物成分与屈大麻酚联合用于MS 治疗，并作为单一药物用于治疗像Dravet综合征这样的癫痫疾病。在各种临床试验中，研究了结构相关的化合物次大麻二酚(CBDV)的抗癫痫治疗作用。

自然产生的CBD和CBDV具有绝对立体构型(-)-反式。顺式异构体或(+)-对映体不是在植物中产生的，因此迄今为止没有药物影响。对映体(+)-反式-CBD的首次生物学研究显示出惊人的生物学效应(Morales等人，“大麻二酚的合成和天然衍生物的药物化学概述(An overview on medicinal chemistry of synthetic and natural derivatives ofcannabidiol)”，药理学前沿(Frontiers in Pharmacology)，2017， Vol.8，Article 422，doi：10.3389/fphar.2017.00422)。然而，现有的生物数据是不成熟的。

在大麻素类作为医药产品合法化的过程中，对CBD的需求不断增加，这导致了对大麻植物种植替代品的开发。除了目前仍处于开发阶段的各种生物合成路线外，大麻素类的化学合成是最有前途的选择。化学合成可以产生一种监管安全的、有效的药物成分。然而，像CED这样的手性分子的每一个合成过程都必须证明产物是手性纯的。顺式构型可由于化学过程(如EP2842933B1中的CBD过程)而被排除。为证明产物是对映体纯的，在CBD的情况下，这将包括(-)-构型，该过程需要已证实的对映体纯的初级产物或确定的手性分析方法。这些方法可以是测定产物旋光度的方法，也可以是像HPLC或GC这样的手性色谱法。然而，为了验证这些方法，两种对映体都是必要的。因此，(+)-大麻素类作为参考物质也具有很大的分析潜力。

WO2017/011210A1涉及使用卤素和含卤素化合物(溴化物、二氯甲烷)并且需要巨大的仪器复杂性的(+)-大麻二酚的合成。US2017/0349517A1公开了(+)-次大麻二酚的合成，其是在使用二氯甲烷作为溶剂并需要冷却至-10℃至-15℃的间歇过程中进行的。

目前仍然需要有效的方法来生产对映体纯的(+)-大麻素类，并确定具有生物活性的化合物，其允许治疗性和/或预防性的医学应用。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种生产对映体纯的(+)-大麻素类的方法。特别地，该合成应该是高效的，并且允许连续的合成过程，而不需要巨大的仪器复杂性。此外，本发明的另一个目的是产物的纯化应是容易的，并且特别是不需要(手性)色谱步骤。此外，应当可以从非对映体纯离析物开始。

本发明的再一个目的是提供对映体纯的(+)-大麻素类，其具有生物活性，可用于实现特定治疗作用并允许治疗和/或预防某些疾病。

通过一种生产式(I)化合物

或式(I)化合物的盐的方法实现了上述目的，

其中X＝H或-COOY，

其中Y＝饱和的或不饱和的、支链的或无支链的烷基基团、芳基基团或杂芳基基团，其分别具有1至12个碳原子，并且选择性地被一个或多个氨基基团、羟基基团和/或卤素取代，并且

其中n＝2或4，

所述方法包括以下步骤：

i)使4S-薄荷二烯醇与式(II)化合物反应，

其中n＝2或4，

以获得式(III)化合物，

其中n＝2或4。

具体实施方式

该过程的第一步是4S-薄荷二烯醇和取代的间苯二酚衍生物(橄榄醇甲酯或divarin 甲酯)在酸催化剂下的Friedel Craft加成反应。该步骤不需要冷却，因此优选在20℃至25℃之间进行。为确保各大麻素甲酯的(+)-构型，起始材料薄荷二烯醇必须具有 4S构型。由于在加成过程中1S/1R立体中心被破坏，它可以是1S，4S-薄荷二烯醇、1R，4S- 薄荷二烯醇，或者两种薄荷二烯醇的混合物。另一方面，4R-薄荷二烯醇杂质会导致各自的(-)-大麻素。为考察该过程的稳定性及其纯化，可以使用含有5％的4R-薄荷二烯醇作为杂质的4S-薄荷二烯醇起始材料。

方案1：4S-薄荷二烯醇与取代的间苯二酚衍生物的Friedel Craft加成反应

根据一个实施方式，上述方法还包括一个或多个步骤：

ii)所述式(III)化合物的酯交换反应，和/或

iii)所述式(III)化合物的脱羧反应。

在进行步骤ii)之前，不需要纯化初级产物，即所述式(III)化合物。该过程的步骤ii)包括(+)-大麻素甲酯的酯交换反应以及随后的酸性脱羧反应生成所需的(+) -大麻素。所述酯交换反应优选在真空中进行，优选在300mbar至700mbar之间，更优选在400mbar至600mbar之间，尤其优选在约500mbar进行，以允许立即蒸馏出低沸点乙醇。通过所述酯交换反应形成的中间酯通常不是孤立的。任何烷基醇都可以用作该酯交换反应中的反应参与物。以下给出了优选醇。所述产物不需要手性色谱纯化以达到＞99％的手性纯度。

根据优选的实施方式，在上述方法中，步骤i)作为一个批次进行，或者优选作为连续流动反应过程进行。

第一步可以作为间歇反应进行，但如果采用流动细胞反应器作为连续流动反应进行，则可以获得更好的收率和纯度。

表1：合成(+)-反式-大麻二酚甲酯(CBD-ME)的间歇反应-连续流动反应的比较

在上述方法的另一个优选实施方式中，所述式(I)化合物选自由式(1)至(5) 的化合物或其盐组成的组

化合物(1)：(+)-大麻二酚甲酯((+)-CBD-ME)

化合物(2)：(+)-大麻二酚乙二醇酯((+)-CBD-GE)

化合物(3)：(+)-大麻二酚((+)-CBD)

化合物(4)：(+)-大麻二酚羟基戊酯((+)-CBD-HPE)

化合物(5)：(+)-次大麻二酚((+)-CBDV)

化合物(1)至(5)已被证明具有生物活性，其允许如下更详细解释的治疗应用。

对于本发明背景下的式(I)化合物和化合物(1)至(5)的盐，以下适用：在适当的情况下，一种或多种化合物的一个或多个羟基基团以去质子化的形式存在。除了一种或多种(去质子化)的化合物外，还存在相应数量的抗衡阳离子，其中这些阳离子优选地选自由以下各项组成的组：第一主族和第一族过渡元素的单正电荷阳离子、铵离子、三烷基铵离子、第二主族和第二族过渡元素的双正电荷阳离子以及第三主族和第三族过渡元素的三重正电荷阳离子，以及它们的组合。

化合物的酚羟基通常比脂肪族侧链中的羟基基团(如果存在)的酸性更强。

相应数量的抗衡阳离子(取决于它们的电荷)来自于去质子化羟基基团的数量。例如，它产生于作为这种盐的基础的具有两个酚羟基基团的式(I)化合物，在这些酚羟基基团完全去质子化的情况下，存在一个带双负电荷的阴离子，可以导出必须由一种或多种抗衡阳离子提供的正电荷数(在这种情况下：两个)。最优选地，这些抗衡阳离子选自由Na

进一步优选上述的方法，其中，在步骤i)中使用纯1S，4S-薄荷二烯醇或纯1S，4R-薄荷二烯醇或1S，4S-薄荷二烯醇与1R，4S-薄荷二烯醇的混合物。

令人惊讶的是，根据本发明的方法允许从非对映体纯起始材料，即1S，4S-薄荷二烯醇与1R，4S-薄荷二烯醇的混合物，合成对映体纯的(+)-大麻素类及其衍生物。最终产物可以被纯化而不必进行任何耗时、昂贵的手性纯化方法，并且仍然可以获得＞99％的纯度以及＞99％的对映体纯度。

根据上述方法的优选实施方式，步骤i)在无卤素溶剂中进行，优选在甲苯中进行。其他可能的溶剂是苯、二甲苯、环己烷或甲基叔丁酯。

有利地，根据本发明的方法可以在无卤素溶剂中进行，这避免了生态问题。优选地，步骤i)在甲苯中进行，这提供最佳效率和反应收率。

根据上述方法的又一个优选实施方式，在步骤i)中提供路易斯酸催化剂的溶液并使其与式(II)化合物和4S-薄荷二烯醇的溶液接触。

为了确保所述催化剂始终存在于反应室中，将该催化剂的溶液装入反应室，然后将式(II)化合物和4S-薄荷二烯醇的溶液装入反应室。在连续流动反应过程中，该过程中两种溶液均通过连续流动反应器泵送，该催化剂的溶液优选在式(II)化合物和4S- 薄荷二烯醇的溶液之前开始并在其之后结束。

在优选的实施方式中，所述路易斯催化剂是三氟化硼乙醚络合物。使用三氟化硼乙醚络合物作为催化剂已经显示出提供了具有良好收率的高效反应。

如上所述，任何烯丙醇均可用作步骤ii)中所述酯交换反应的反应参与物。支链的或无支链的、饱和的或不饱和的烷基醇以及环状烷基醇可能是合适的。然而，当使用具有一个伯羟基基团的无支链的、饱和的烷基醇时获得了最佳收率和选择性。

在另一个优选实施方式中，在步骤ii)中进行与乙二醇和/或1，2-戊二醇的酯交换反应。

步骤ii)中化合物(1)与乙二醇和/或1，2-戊二醇的酯交换反应分别提供所述化合物(2)和/或化合物(4)。化合物(2)和化合物(4)已显示出具有生物活性，其允许如下更详细解释的治疗性应用。此外，它们很容易脱羧得到化合物(3)。

方案2：化合物(1)与乙二醇(顶部)和1，2-戊二醇(底部)的酯交换反应

在另一个优选的实施方式中，在步骤ii)中使用酸。脱羧反应可以通过加入酸，诸如硫酸来进行。或者，可以使用盐酸，但优选使用硫酸。

方案3：与乙二醇的酯交换反应以及脱羧反应

粗(+)-大麻素类可以通过快速色谱法或薄层蒸馏法进行纯化。纯化步骤之后可进行最终的结晶步骤，其分别产生纯度＞99％的(+)-大麻素和绝对对映体纯度的(+)- 大麻素。

根据另一个方面，本发明涉及上述的(+)-大麻素化合物用于治疗方法，尤其是用于治疗和/或预防医疗状况。(+)-大麻素化合物的治疗作用可归因于它们与大麻素受体CB

哺乳动物组织中含有至少两种大麻素受体CB

CB

CB

中枢和外周大麻素受体都是七螺旋区G蛋白偶联受体超家族的成员。已知大麻素受体通过百日咳毒素敏感的Gi/o抑制腺苷酸环化酶来介导其作用(Pacher等人，2006)。

为用于医疗/药物制剂，有必要通过各物质与CB受体的选择性相互作用来靶向不同的作用。例如，9-THC是一种非选择性的CB

所有受试的(+)-大麻素类在纳摩尔范围内均表现出与CB

令人惊讶的是，没有一种化合物显示CB

所述受试化合物具有不同但明确的活性谱，其中(+)-CBD是最活跃的。选择性活性谱能够使标题的大麻素类根据适应症用于不同的靶点。尤其令人惊讶的是，CB

原代人单核细胞是存在人类血液中的一种白细胞，或白血球(PBMCs：外周血单核细胞)，其代表约10％至30％的PBMCs。单核细胞及其巨噬细胞和树突状细胞后代在免疫系统、吞噬、抗原呈递和细胞因子产生中起着三个主要和关键的作用。作为脊椎动物固有免疫系统的一部分，单核细胞也影响适应性免疫的过程。已经显示出人类单核细胞表达CB

原代人成纤维细胞是细胞外基质(ECM)蛋白的主要来源，除了为细胞提供支架外还在决定细胞表型和功能方面发挥着关键作用。成纤维细胞在起始阶段和分解阶段都有助于损伤反应。它们在许多免疫和炎症反应中也起辅助细胞的作用。成纤维细胞能够产生多种细胞因子或对其产生反应，这些介体允许成纤维细胞和白细胞在复杂过程，诸如伤口愈合中进行合作。成纤维细胞能够改变其细胞外基质成分的输出，以响应其他类型细胞释放的介质。一些人类慢性炎症性疾病最终发展成致残性纤维性疾病，显示出免疫系统的持续激活是如何导致了成纤维细胞功能的严重紊乱。研究已表明CB

人HaCAT角质形成细胞是表皮，即皮肤的最外层的主要细胞类型，占皮肤细胞的90％。角质形成细胞的主要功能是形成屏障，防止病原细菌、真菌、寄生虫、病毒、热、紫外线辐射和水分流失造成的皮肤环境损害。已经表明，人角质形成细胞参与外周内源性大麻素系统，并显示CB

受试的(+)-大麻素类在不同细胞系中表现出不同的生物学活性。有趣的是，所有的大麻素类都有不同的作用。在大多数情况下，这可能与它们的CB

(+)-CBD对单核细胞(除IL-1、MMP9和异前列烷外)和成纤维细胞具有强力的抗炎作用。这些作用很可能与化合物的CB

(+)-CBDV具有的强力抗炎作用与(+)-CBD相当，其效力稍差但也能微弱抑制LPS诱导的IL-1。这种作用部分地与化合物的CB

(+)-CBD-ME对LPS介导的TNF-α和IL-6仅表现出轻微的抑制作用，对IL-1诱导的成纤维细胞的PGE2的抑制作用较弱，对Poly I:C刺激的HaCat的TIMP1的抑制作用是5种受试物中活性最低的化合物。这直接对应于它对CB

(+)-CBD-GE在单核细胞和成纤维细胞中也显示出了强大的抑制作用，其阻止了除IL-8和MMP9外的大多数炎症诱导参数，这些参数甚至被该大麻素增加了。这种增加可能与高剂量的化合物的细胞毒性作用有关。在Poly I:C处理的HaCat细胞中观察到MMP9 和TIMP1的微弱抑制作用。

(+)-CBD-HPE的效力不如(+)-CBD、(+)-CBDV和(+)-CBD-GE，仅对LPS诱导的单核细胞的PGE2、IL-1刺激的成纤维细胞的IL-6和IL-8、以及Poly-I:C诱导的HaCat 细胞的MMP9和TIMP有强力的抑制作用。这是令人惊讶的，因为(+)-CBD-HPE表现出最高的CB

因此，本发明也涉及式(I)化合物或式(I)化合物的盐，其优选地选自由化合物(1)至(5)或其盐组成的组，用于实现选自由以下各项组成的组的作用的治疗方法：

-消炎、

-免疫调节、

-免疫抑制、

-免疫刺激、

-止痛。

所有受试的(+)-大麻素化合物都显示出抗炎作用，不过(+)-CBD、(+)-CBDV 和(+)-CBD-GE是最有效的，因此被优选用于实现抗炎作用的治疗方法。

由于CB

因此，本发明特别优选的实施方式是式(I)化合物用于上述的治疗方法，其中所述式(I)化合物是化合物(3)或化合物(3)的盐。

CB2-激动剂是治疗各种疼痛性疾病(慢性、神经性、炎症性)的有前途的止痛疗法(Le Boisselier等人，2017；Likar等人，2017)。另外，CB2-激动剂有益于治疗神经炎症和神经退行性疾病，如多发性硬化症(Pertwee，2007；Dittel，2008)、亨廷顿氏病(Sagredo等人，2012)、阿尔茨海默病(Aso等人，2016)以及治疗脑中风(Zhang 等人，2007)。

CB2-激动剂也是治疗周围炎性疾病，如动脉硬化(Mach等人，2008)或炎症性肠病(Izzo等人，2008；Wright等人，2008)、缺血(Bátkai等人，2007)、糖尿病肾病 (Barutta等人，2011)和肝硬化(Izzo等人，2008；Mallat等人，2007；Lotersztajn 等人，2008)的有效方法。

流行病学和临床前数据表明，激活CB

CB1拮抗剂是治疗肥胖症进而治疗糖尿病的有前途的疗法(Dourish等人，2008；Badal等人，2017；Wagner等人，2012)，因此被认为对减肥模式很重要。另外，它们在药物停止和药物戒断(酒精、烟草、麻醉品)的治疗中显示出有益的效果(Ravan等人，2014；Chandler等人，2009；Koob等人，2014)。

CB1拮抗剂还可通过阻断脂肪肝代谢来治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)(Badal等人，2017)。另外，CB1拮抗剂是治疗神经退行性疾病，如帕金森氏病的有前途的疗法(Brotchie，2003；Cerri等人，2014)。

因此，本发明的一个优选实施方式是式(I)化合物或式(I)化合物的盐，优选地选自由化合物(1)至(5)或其盐组成的组，用于治疗和/或预防：炎症性疾病，诸如神经炎症性疾病、动脉硬化、炎症性肠病或缺血；和/或疼痛性疾病，诸如慢性疼痛、神经性疼痛或糖尿病性神经病变；和/或神经退行性疾病，诸如多发性硬化症、亨廷顿氏病，阿尔茨海默病或帕金森氏病；和/或脑中风和/或肝硬化和/或骨质疏松症和/或癌症和/或肥胖症和/或糖尿病和/或肝纤维化和/或非酒精性脂肪肝疾病和/或牛皮癣，和/ 或用于治疗麻醉品、阿片类药物、烟草或酒精的停止或戒断症状。

优选地，用于上述治疗和/或预防的所述式(I)化合物是化合物(3)或化合物(3)的盐。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含一种或多种式(I)化合物或一种或多种式(I)化合物的盐，所述一种或多种式(I)化合物或式(I)化合物的盐优选地选自由化合物(1)至(5)或其盐组成的组。

根据本发明的药物组合物优选地选自由固体盖伦剂型(例如片剂，有包衣或无包衣，有调释或无调释)、糖衣丸(有包衣或无包衣，有调释或无调释)、胶囊(软明胶胶囊或硬明胶胶囊，有调释或无调释)、颗粒(有调释或无调释)、粉末(有调释或无调释，例如鼻粉、耳粉)、栓剂(有包衣或无包衣，有调释或无调释)、锭剂、口香糖、半固体形式(例如疏水性软膏，其中例如碳氢化合物凝胶、脂质体凝胶、硅凝胶、油凝胶，以及水溶性如软膏，其中例如吸收基质、亲水性软膏、亲水胶(水凝胶)或糊剂、还有鼻软膏)、吸入剂(例如压力气体计量吸入器、粉末吸入器、雾化吸入器、吸入用吸入浓缩物)、可注射物和植入物(例如，基于液体或固体形式，这些形式适用于制备能够调释的可注射溶液或固体基质或用作该可注射溶液或固体基质)、含有活性成分的贴剂、耳塞剂组成的组。

液体形式例如是溶液、悬浮液、乳液、糖浆类药品(俗称咳嗽糖浆)、漱口剂、漱口液、喉咙喷剂或鼻喷剂、滴鼻剂、鼻腔冲洗液、滴耳剂、耳喷剂和洗耳液。

药物组合物优选包含一种或多种选自以下组的组分：填充材料(例如，纤维素、碳酸钙)、流动剂和防结块剂(例如，滑石、硬脂酸镁)、涂料(例如，聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)、崩解剂(例如，淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮)、增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二丁酯)、造粒用物质(乳糖、明胶)、延迟剂(例如，分散型聚甲基丙烯酸-甲基/乙基/2-三甲基氨基乙基酯共聚物、醋酸乙烯酯/巴豆酸共聚物)、压实剂(例如，微晶纤维素、乳糖)、溶剂、悬浮液或分散剂(例如，水、乙醇)、乳化剂(例如，十六烷醇、卵磷脂)、用于改变流变性能的物质 (二氧化硅、海藻酸钠)、用于微生物稳定的物质(例如，苯扎氯胺、山梨酸钾)、防腐剂和抗氧化剂(例如，DL-α-生育酚、抗坏血酸)、改变pH值的物质(乳酸、柠檬酸)、推进剂或惰性气体(例如，氟化氯化烃、二氧化碳)、着色剂(氧化铁、氧化钛)、软膏基质材料(例如，石蜡、蜂蜡)，尤其它们可在技术文献中找到(例如，Schmidt，P.C.， Christin，I.，，Wirk-und Hilfsstoffe für Rezeptur，Defektur und Groβherstellung“， 1999，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart orBauer，K.H.，

本领域技术人员可根据各制剂的种类和用途，通过简单的试错法容易地确定在一种药物组合物中的一种或多种式(I)化合物和/或其一种或多种盐的优选用量。

附图说明

图1显示了如实施例4中评估的(+)-CBD的CB

图2显示了如实施例4中评估的(+)-CBDV的CB

图3显示了如实施例4中评估的(+)-CBD-ME的CB

图4显示了如实施例4中评估的(+)-CBD-GE的CB

图5显示了如实施例4中评估的(+)-CBD-HPE的CB

图6显示了如实施例5中评估的(+)-CBD对CB

图7显示了如实施例5中评估的(+)-CBDV对CB

图8显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-ME对CB

图9显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-GE对CB

图10显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-HPE对CB

图11显示了如实施例5中评估的(+)-CBD对CB

图12显示了如实施例5中评估的(+)-CBDV对CB

图13显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-ME对CB

图14显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-GE对CB

图15显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-HPE对CB

图16显示了如实施例5中评估的(+)-CBD对CB

图17显示了如实施例5中评估的(+)-CBDV对CB

图18显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-ME对CB

图19显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-GE对CB

图20显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-HPE对CB

图21显示了如实施例5中评估的(+)-CBD对CB

图22显示了如实施例5中评估的(+)-CBDV对CB

图23显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-ME对CB

图24显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-GE对CB

图25显示了如实施例5中评估的(+)-CBD-HPE对CB

图26显示了如实施例6中评估的(+)-CBD对人单核细胞的细胞活力的影响。

图27显示了如实施例6中评估的(+)-CBDV对人单核细胞的细胞活力的影响。

图28显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-ME对人单核细胞的细胞活力的影响。

图29显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-GE对人单核细胞的细胞活力的影响。

图30显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-HPE对人单核细胞中细胞活力的影响。

图31显示了如实施例6中评估的(+)-CBD对LPS处理的人单核细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL1β、TNFα、IL6、IL8、MMP9、PGE2和异前列腺素。

图32显示了如实施例6中评估的(+)-CBDV对LPS处理的人单核细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL1β、TNFα、IL6、IL8、MMP9、PGE2和异前列腺素。

图33显示了如实施例6中评估的(+)(+)-CBD-ME对LPS处理的人单核细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL1β、TNFα、IL6、IL8、MMP9、PGE2 和异前列腺素。

图34显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-GE对LPS处理的人单核细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL1β、TNFα、IL6、IL8、MMP9、PGE2和异前列腺素。

图35显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-HPE对LPS处理的人单核细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL1β、TNFα、IL6、IL8、MMP9、PGE2和异前列腺素。

图36显示了如实施例6中评估的(+)-CBD对IL-1处理的人皮肤成纤维细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL6、IL8和PGE2。

图37显示了如实施例6中评估的(+)-CBDV对IL-1处理的人皮肤成纤维细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL6、IL8和PGE2。

图38显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-ME对IL-1处理的人皮肤成纤维细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL6、IL8和PGE2。

图39显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-GE对IL-1处理的人皮肤成纤维细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL6、IL8和PGE2。

图40显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-HPE对IL-1处理的人皮肤成纤维细胞炎症参数的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：IL6、IL8和PGE2。

图41显示了如实施例6中评估的(+)-CBD对PolyIC处理的人角质形成细胞(HaCat)中MMP1、MMP9和TIMP1的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：MMP9、TIMP1和MMP1。

图42显示了如实施例6中评估的(+)-CBDV对PolyIC处理的人角质形成细胞(HaCat) 中MMP1、MMP9和TIMP1的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：MMP9、TIMP1和MMP1。

图43显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-ME对PolyIC处理的人角质形成细胞(HaCat)中MMP1、MMP9和TIMP1的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：MMP9、TIMP1 和MMPl。

图44显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-GE对PolyIC处理的人角质形成细胞(HaCat)中MMP1、MMP9和TIMP1的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：MMP9、TIMP1 和MMP1。

图45显示了如实施例6中评估的(+)-CBD-HPE对PolyIC处理的人角质形成细胞(HaCat)中MMPl、MMP9和TIMP1的影响。每个浓度的柱形从左到右表示：MMP9、TIMP1 和MMP1。

将基于以下实施例对本发明进行更详细地解释。

方案4：合成(+)-CBD-ME(1)

将71.4g(300mMol)橄榄醇甲酯和50g(330mMol)1R，4S-薄荷二烯醇与甲苯一起溶解以达到400ml的组合体积-＞溶液A。使21.3g(150mMol)BF

用快速色谱法(洗脱液系统环己烷/乙酸乙酯＝40/1体积/体积)纯化粗产物。GC纯度：99.1％。手性GC分析：对映体过量99％(对于对映体纯起始材料)。

方案5：经(+)-CBD GE(2)合成(+)-CBD(3)

将49.2g(103mMol)(+)-CBD-ME(1)在60度下溶解于250mL乙二醇中，并倒入1L实验室反应器中。加入5.7g氢氧化钾，并在搅拌至120度和500mbar的真空时开始加热反应混合物。将累积的挥发性副产物蒸馏掉。2小时后，反应温度升高到150度，该温度保持额外3小时。在添加400mL水和130mL正庚烷之后，将反应混合物冷却到80度。在缓慢添加1.2mL硫酸(50％)直到pH值为约6时，温度进一步降低到40度。分离各层，用250mL水和250ml氢氧化钠溶液(0.05％)各洗涤有机层一次。有机层在Na

在120度下2小时后取出反应混合物样品，用正庚烷和水淬灭，并用硫酸(10％重量/重量)中和。分离各层，将有机层蒸干。用快速色谱法(洗脱液系统正庚烷/乙酸乙酯＝4/1体积/体积)纯化粗(+)-CBD-GE(2)。GC纯度：97.8％。手性GC分析：对映体过量99％(对映体纯起始材料)。

在本实例中，粗(+)-CBD通过快速色谱法(洗脱液系统环己烷/乙酸乙酯＝20/1体积/体积)纯化。在由正庚烷结晶后，可以用薄层蒸馏代替快速色谱法。GC纯度：99.8％。手性GC分析：对映体过量99％(对于对映体纯起始材料和含有高达5％的4R-薄荷二烯醇对映体的起始材料)。

方案6：合成(+)-CBD HPE(4)

使10g(24mMol)(+)-CBD-ME(1)在60度下溶解于250mL 1，2-戊二醇中，并倒入1L实验室反应器中。加入1.1g氢氧化钾，并在搅拌至120度和500mbar的真空下开始加热反应混合物。将累积的挥发性副产物蒸馏掉。2小时后，在添加400mL 水和130mL正庚烷之后，将反应混合物冷却到80度。温度进一步降低到室温，并用硫酸(10％重量/重量)中和。分离各层，有机层用250mL水洗涤一次，在Na

方案7：合成(+)-CBDV ME

将91g(430mMol)divarin甲酯和66g(430mMol)4S-薄荷二烯醇与甲苯一起溶解以达到610ml的组合体积-＞溶液A。使20g(140mMol)BF

原料化合物可进一步使用，无需纯化。

方案8：经(+)-CBDV-GE合成(+)-CBDV(5)

将117g(275mMol)(+)-CBDV-ME在60度下溶解于150mL乙二醇中，并倒入1L实验室反应器中。将30.8g(550mMol)氢氧化钾溶解在100ml乙二醇中并加入到搅拌溶液中。在搅拌至120度和500mbar的真空下开始加热反应混合物。将累积的挥发性副产物蒸馏掉。2小时后，反应温度升高到150度，该温度保持额外3小时。在添加550mL水和200mL正庚烷之后，将反应混合物冷却到80度。在缓慢添加45g硫酸(50％)直到pH值为约6时，温度进一步降低到40度。分离各层，水层用200ml MTBE 萃取一次。将有机层组合并蒸干，以提供99克粗产物。在粗产物中加入23克Synalox 油，并在薄层蒸馏设备上蒸馏出所得混合物。然后，所得蒸馏物(62g，根据GC分析： 83.4％产物)由正庚烷结晶。得到的白色晶体再次由正庚烷重结晶，以得到纯产物。收率：27g。GC纯度：99.6％。手性GC分析：对映体过量99％(对于对映体纯起始材料和含有高达5％的4R-薄荷二烯醇对映体的起始材料)。

通过竞争研究来评估作为CB

来自人类CB

利用转染CB

表2：化合物的CB

在确定这些化合物对大麻素受体表达结合亲和力后，分析了它们对大麻素受体的作用(激动作用、拮抗作用)。

HEK 293T-CB

对于CB

对于CB

为了测量CB

对于细胞中的CB

刺激6小时后，按照荧光素酶检测试剂盒(Promega，Madison，WI)的说明，对细胞进行裂解(在25mM Tris-phosphate中，pH 7.8，8mM MgCl

CB

HEK 293T-CB

CB

HEK 293T-CB

CB

HEK 293T-CB

CB

以下研究了所述化合物对CB

表3：受试化合物的CB

将受试化合物溶解在DMSO(10mg/ml储备溶液)中，并在用于下述实验的培养基中稀释。

细胞培养物：遵循使用完全无内毒素培养的标准化方案(梯度制剂，淋巴细胞分离培养基，PAN Biotech，P04-60125，德国艾登巴赫)，从当地血库(德国弗莱堡大学医院)提供书面知情同意书的医学健康志愿者的全血中提取人原代单核细胞。使用50ml 的试管，25ml的Pancoll装有25ml血液(血沉棕黄层)。在缓慢加速和减速下，通过以1800rpm在20℃下离心40分钟来建立梯度。小心去除间期的外周血单核细胞，并将其重新悬浮于50ml预热磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Pan Biotech，P04-36500)，然后以 1600rpm在20℃下离心10分钟。丢弃上清液，在50ml PBS中洗涤球粒，并如上所述离心。然后将该球粒重新悬浮在50ml添加有10％人血清(Hexcell，德国柏林，SP2080) 的RPMI-1640低内毒素培养基中。在粒子计数器(Euro Diagnostics，德国克雷费尔德) 中计数细胞数后，将细胞接种在24孔板中进行酶联免疫吸附试验(ELISA)(2.2mio. 个细胞/孔)，或以2×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中用于细胞活力测试，并在 37℃下用5％的CO

细胞活力：细胞用大麻素类(3个剂量，n＝4)孵育24小时。细胞毒性通过阿尔玛蓝染色(formazan)进行分析。然后用100μl PBS洗涤细胞一次，然后将100μl培养基-阿尔玛蓝混合物(90％培养基、10％阿尔玛蓝、DAL1025、Thermo Fisher)添加到每个孔中。然后于37℃下加湿5％CO

成纤维细胞中炎性分子的测定：原代人成纤维细胞如上所述培养，并接种在24孔板中(500000个细胞/孔)。在大麻素类(5剂量，n＝3)缺乏或存在的情况下，细胞用 IL-1β(Roche，德国曼海姆，10U/ml)孵育24小时。非刺激细胞用作阴性对照。细胞刺激后24小时，去除上清液，离心，并根据制造商的方案使用ELISAs研究IL-6、PGE2 和IL-8的浓度(PGE2来自Cayman/Biomol，德国汉堡；IL-6和IL-8来自Immunotools，德国弗里索伊特)。使用96孔板阅读器(Berthold，德国奥芬堡)确定各自的消光。

角质形成细胞中MMPs和TIMPs的测定：角质形成细胞(HaCat)如上所述培养。将细胞接种在24孔板中，在大麻素类(5剂量，n＝3)缺乏或存在的情况下用Poly I:C(InvivoGen，美国加利福尼亚州圣地亚哥，10μg/ml)孵育24小时。非刺激细胞用作阴性对照。细胞刺激后24小时，去除上清液，离心，并根据制造商的方案(来自Biotechne，德国威斯巴登)使用ELISAs研究MMP1、MMP9和TIMP1的浓度。使用96孔板阅读器 (Berthold，德国奥芬堡)确定各自的消光。

原代人单核细胞中细胞因子和PGE2的测定：细胞用LPS(Sigma Aldrich，德国陶夫基兴，10ng/ml)孵育24小时。在LPS处理前30分钟加入大麻素类(5剂量)。24 小时后，去除上清液，离心，并使用制造商的方案研究EIAs(PGE2和异前列烷，来自 Cayman/Biomol，德国汉堡)或ELISAs(IL-1β，Hiss，德国弗莱堡；TNFα、IL-6和 IL-8，ImmunoTools，德国Frysoithe；MMP9，Biotechne，德国威斯巴登)中IL-1beta、 IL-8、IL-6、TNFalpha、MMP9、异前列烷和PGE2的浓度。使用96孔板阅读器(Berthold，德国奥芬堡)确定各自的消光。每个剂量在两个不同献血者的两个血沉棕黄层中分析4 次(使用的2个血沉棕黄层来自2个不同健康献血者，最终n＝4个值)。

对人单核细胞细胞活力的影响

对原代人单核细胞进行细胞毒性试验。(+)-CBD和(+)-CBDV在25μM及更高剂量下开始影响细胞活力(图26和27)，另外三个大麻素类则在50μM时开始影响细胞活力(图28至图30)。为能够比较五种大麻素类的活性，25μM用作最高剂量。

对LPS诱导的人单核细胞炎症参数的影响

如图31所示，(+)-CBD在0.1μM(TNFα)和1μM(PGE2)时开始显著抑制LPS 刺激的TNFα和PGE2的释放，使用25μM时作用最强，这表明抑制率为约80％。LPS诱导的IL-6在5μM至25μM的剂量时被抑制，IL-8仅在25μM的剂量时被抑制，而LPS 介导的IL-1β、MMP9和异前列烷不受(+)-CBD的影响。对这3个参数的非抑制作用表明，使用25μM不会杀灭细胞因而影响了其他参数。

在最高剂量下，(+)-CBDV除了对TNFα的影响较弱，对IL-1β稍有影响外，显示出与(+)-CBD的作用相当(图32)。

(+)-CBD-ME仅轻微抑制LPS诱导的IL-6和TNFα，抑制率为约20％，但在5μM 至25μM剂量时增加了趋化因子IL-8，在25μM剂量时增加了IL-1(图33)。

如图34所示，(+)-CBD-GE从0.1μM开始剂量依赖性地抑制LPS刺激的TNFα、 IL-6、IL-1、异前列烷和PGE2的释放，使用25μM时作用最强，这表明对IL-6和PGE2 的抑制率为约80％，对另外三个参数的抑制率为约40％。LPS-诱导的IL-8不受影响，而对LPS介导的MMP9在5μM至25μM剂量时抑制作用显著增强(比LPS值高20％至60％)。

(+)-CBD-HPE在5μM至25μM的剂量时仅轻微抑制LPS诱导的PGE2，在10μM 和25μM的剂量时轻微抑制IL-6。在剂量为25μM时，LPS刺激的IL-8和MMP9仅受到轻微阻止，而对LPS介导的IL-1β在25μM剂量时抑制作用显著增加(几乎是LPS作用的两倍)，而LPS诱导的TNFα则不受影响(图35)。

对IL-1诱导的人皮肤成纤维细胞炎症参数的影响

如图36所示，(+)-CBD从0.1μM开始显著且剂量依赖性地抑制IL-1刺激的IL-6 和IL-8的释放，使用25μM时作用最强，表明抑制率超过90％。在剂量为10μM至25μM 时，IL-1诱导的PGE2受到强烈抑制(抑制率超过80％)。

(+)-CBDV显示出与(+)-CBD可比的情形，但开始使用5μM时对IL-6和IL-8 的活性较弱。在剂量为10μM至25μM时，IL-1诱导的PGE2受到强烈抑制(抑制率超过80％)(图37)。

(+)-CBD-ME轻微增加了LPS诱导的IL-6和IL-8，并轻微降低了IL-1介导的PGE2。25μM的剂量似乎对成纤维细胞有毒性(图38)。

如图39所示，(+)-CBD-GE从5μM开始剂量依赖性地抑制全部IL-1刺激的参数，使用25μM时作用最强，这表明对IL-6和IL-8的抑制率约为95％，对P6E2的抑制率约为80％。

(+)-CBD-HPE在剂量为10μM和25μM时抑制IL-1诱导的IL-6和IL-8(抑制率 95％)，仅在剂量为25μM时抑制PGE2(抑制率50％)(图40)。

对人HaCat角质形成细胞中Poly I:C诱导的蛋白酶的影响

如图41所示，(+)-CBD从5μM开始轻微抑制Poly I:C刺激的MMP9和TIMP1，使用25μM时作用最强，这表明其对MMP9的抑制率约为40％，对TIMP1的抑制率约为70％。在剂量为25μM时Poly I:C诱导的MMP1仅稍微受到抑制(超过约40％的抑制率)。

(+)-CBDV在剂量为25μM时显示出对Poly I:C刺激的MMP9和TIMP1轻微的抑制作用，但增强了Poly I:C刺激的MMP1(图42)。

(+)-CBD-ME在剂量为5μM至25μM时剂量依赖性地轻微降低Poly I:C诱导的 TIMP1(抑制率40％)，但增强了Poly I:C刺激的MMP9和MMP1(图43)。

如图44所示，(+)-CBD-GE(25μM)对Poly I:C刺激的MMP9和TIMP1有轻微的抑制作用(抑制率为30％至50％)，但对Poly I:C诱导的MMP1没有影响。

(+)-CBD-HPE对Poly I:C诱导的所有参数均有抑制作用，在剂量为25μM时，对MMP9的抑制率为40％，对TIMP1的抑制率为60％，对MMP1的抑制率为20％(图45)。

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