MIR-17~92作为运动神经元(MN)退化疾病的治疗或诊断目标

技术领域

本发明涉及微RNA(miRNA)，尤其作为运动神经元(MN)退化疾病的候选治疗或诊断目标的mir-17～92的领域。

背景技术

ALS，亦称为路-盖里格氏病(Lou Gehrig's disease)，是一种侵袭上位及下位运动神经元的破坏性成年发病型神经退化性疾病。随之发生进行性且最终致命的肌肉麻痹，通常在疾病发作的2至5年内导致死亡。ALS大多为偶发性的，但有约10％的病例为家族性的。在全世界内，发病率为每年每100,000人中有约2-3例病例。在约75％的ALS患者中，远程肢体神经支配MN，尤其是控制快速肢体动作的快缩易疲劳(fast-twitch fatigable，FF)MN通常为经历退化的第一MN亚型，因此患者最初经历手臂或腿无力或萎缩。其他MN亚型随后受到影响，且在3至5年内，患者遭受完全麻痹且最终因呼吸衰竭而死亡。用于治疗ALS的唯一市售药物(利鲁唑(Riluzole))具有适度作用，可改善肌肉功能，但具有较强副作用且对患者存活期无明显影响。最近，美国食品与药物管理局(US Food&Drug Administration，FDA)批准一种新药物(依达拉奉(Edaravone))，但其功效有待评估。迄今为止，尚无用于此致命疾病的有效治愈方法。

有若干基因的致病性突变已与家族性及偶发性ALS相关联，包括SOD1、TARDBP、FUS/TLS、VAPB、OPTN等。超氧化物歧化酶1(SOD1)基因中的显性突变占家族性ALS(fALS)的15-20％。尽管SOD1在ALS中的确切病理作用仍不清楚，但已确立一系列携带fALS SOD1突变体的转基因小鼠，其重演ALS发展的病理性表型，包括作为疾病发作的第一病征的肢体无力，且提供用于研究ALS机制的有价值模型。在这些fALS-SOD1转基因模型中进行的累积研究表明，多个细胞机制的失调共同地促成ALS发展。研究最深入的一个路径为内质网(ER)压力(Kikuchi H等人(2006)Spinal cord endoplasmic reticulum stress associatedwith a microsomal accumulation of mutant superoxide dismutase-1in an ALSmodel.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 103(15):6025-6030)，其主要在易损的FF-MN中观察到。亦已将RNA代谢与ALS病理学相关联，因为有许多经识别的疾病相关基因编码RNA结合蛋白，诸如TARDBP、FUS及HNRNPA1。值得关注的是，这些致病基因亦参与miRNA生物发生及代谢。近期的研究进一步揭示，miRNA表达的失调出现在ALS小鼠模型及患者中(Eitan C及Hornstein E(2016)Vulnerability of microRNA biogenesis in FTD-ALS.Brain Res 1647:105-111)。

微RNA(miRNA)为内源性非编码小RNA，其对脊髓中细胞命运决定及神经元存活起关键作用。最新的研究揭示，引起ALS的致病性突变足以抑制Dicer复合物活化，此是由压力颗粒(stress granule，SG)的细胞溶质大分子组装介导，导致miRNA生物发生的整体下调。然而，与ALS有关的miRNA的确切功能及集合尚未完全确定。尽管缺少肌肉特异性miRNAmir-206可加快fALS-SOD1

发明内容

本发明出人意料地发现，mir-17～92在脊髓MN中的表达持续整个成年期，且其尤其在SOD1

本发明提供一种治疗或预防个体的运动神经元退化疾病的方法，其包含向所述个体投与治疗或预防有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因(transgenes)。

本发明亦提供一种改善患有运动神经元退化疾病的个体的运动缺陷及延长所述个体的寿命的方法，其包含向所述个体投与有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因。在一个实施例中，所述方法可延迟或预防MN退化的发作或降低发展MN退化的风险。

某些实施例包括将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的中枢神经系统中。特定言之，将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的脊髓中。

本发明亦提供一种在活体外筛选保护ALS中的运动神经元亚型的药物的方法，其包含(i)提供带有包含fALS基因及报导体基因的转基因的干细胞株；(ii)将药物与所述细胞株一起培养；(iii)引导所述细胞分化成运动神经元细胞及表达；及(iv)若自所述干细胞株产生运动神经元亚型，则判定所述药物有效地保护ALS中的运动神经元亚型。

本发明进一步提供一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型的方法，其包含提供生物样品及侦测微RNA-17～92丛集之一或多个成员或者核PTEN的存在，其中失调的微RNA-17～92成员或核PTEN的存在指示对个体的ALS中的运动神经元亚型的诊断或对ALS中运动神经元亚型的易感性。

本发明进一步提供一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型或对ALS中运动神经元亚型的易感性的套组，其包含一或多种用于侦测生物样品中微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者核PTEN的存在的试剂。

图1A至K展示需要mir-17～92来维持成体脊髓MN。(A)说明mir-17～92如何藉由直接靶向Nedd4-2 E3泛素接合酶及其接头Ndfip1，由此抑制正在发育的LMC-MN中促凋亡核PTEN(nPTEN)的积聚来控制PTEN亚细胞定位(Tung等人，2015)。此研究还旨在揭示mir-17～92/nPTEN轴参与ALS中MN退化的可能。(B)在P40时腰椎脊髓的ChAT

图2A至J展示症状发生前SOD1

图3A至G展示SOD1

图4A至E展示SOD1

图5A至H展示SOD1

图6A至E展示SOD1

图7A至H展示在MN中mir-17～92的过度表现将延迟疾病发作且延长SOD1

图8A至E展示藉由在成年期过度表达mir-17～92进行的SOD1

具体实施方式

尽管与本文所述的方法及材料类似或等效的任何方法及材料均可用于实践或测试本文所述的实施例，但本文描述一些优选的方法、组合物、装置及材料。然而，在描述本发明材料及方法之前，应理解，本发明不限于本文中所描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为其可根据常规实验及优化而变化。亦应理解，用于本描述中的术语仅出于描述特定型式或实施例的目的，且并不意欲限制本文中所描述的实施例的范围。

除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术及科学术语具有与本发明所属领域一般技术者通常所理解相同的含义。

除非上下文另外明确规定，否则如本文及所附申请专利范围中所使用，单数形式“一个(种)(a)”、“一个(种)(an)”及“所述”包括多数个(种)参考物。

如本文中可互换地使用，术语“miR基因产物”、“微RNA”、“miRNA”或“miR”意谓与编码RNA杂交且调节编码RNA的表达的长度在18个与25个核碱基之间的非编码RNA。

如本文所用，术语“投药(administration)”及“投与(administering)”是指将药物、前药或其他药剂或治疗剂提供给个体或者活体内、活体外或离体细胞、组织及器官的行为。

如本文所用，术语“有发展……的风险”意谓个体易于发展病状或疾病。在某些实施例中，有发展病状或疾病的风险的个体展现所述病状或疾病的一或多种症状，但并未展现足够被诊断患有所述病状或疾病的数目的症状。在某些实施例中，有发展病状或疾病的风险的个体展现所述病状或疾病的一或多种症状，但程度比被诊断患有所述病状或疾病所要求的程度要轻。

如本文所用，术语“预防……的发作”意谓预防有发展疾病或病状的风险的个体发展所述病状或疾病。在某些实施例中，有发展疾病或病状的风险的个体接受与已患有所述疾病或病状的个体所接受的治疗类似的治疗。

如本文所用，术语“延迟……的发作”意谓延迟有发展疾病或病状的风险的个体中所述病状或疾病的发展。在某些实施例中，有发展疾病或病状的风险的个体接受与已患有所述疾病或病状的个体所接受的治疗类似的治疗。

在一个态样中，本发明提供一种治疗或预防个体的运动神经元退化疾病的方法，其包含向所述个体投与治疗或预防有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因。

在另一态样中，本发明提供一种改善患有运动神经元退化疾病的个体的运动缺陷及延长其寿命的方法，其包含向所述个体投与有效量的一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因或转基因。

在一些实施例中，本发明的投药包含将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的中枢神经系统中。在一些实施例中，将微RNA-17～92丛集的一或多个成员递送至个体的脊髓中。

在一些实施例中，运动神经元退化疾病的治疗或预防是经由SOD1

在一些实施例中，本发明的方法可延迟或预防MN退化的发作或降低发展MN退化的风险。

运动神经元疾病(MND)是选择性影响运动神经元的若干神经退化病症中的任一种，运动神经元是控制身体的随意肌的细胞。在一些实施例中，本发明中所描述的运动神经元退化疾病包括肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)及脊髓性肌肉萎缩症(SMA)。在一些实施例中，ALS是家族性ALS或偶发性ALS。

在一些实施例中，微RNA-17～92丛集的成员包括(但不限于)mir-17、mir-17*、mir-18a、mir-19a、mir-19b、mir-20a及mir-92a。在一个实施例中，微RNA-17～92丛集的成员是mir-17。

在一些实施例中，本发明的基因或转基因是并入或囊封于载剂中以用于投与或递送。在一些实施例中，载剂为病毒载体或纳米粒子。在一些实施例中，病毒载体是scAAV9、重组AAV的任何血清型(诸如AAV1、AAV2、AAV9、AAV2/1、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9)或慢病毒。能够驱动微RNA-17～92丛集表达的任何启动子均可用于载体中。在一些实施例中，启动子是H1、CMV、RSV、SV40、人类β-肌动蛋白、人类延长因子1α或细胞巨大病毒早期增强子/鸡β-肌动蛋白。在某一实施例中，本发明的转基因包含CMV启动子及一或多个编码微RNA-17～92丛集的成员的基因。

在一些实施例中，本发明的方法进一步包含投与一或多种靶向SOD1或MMP9的抑制性核酸、编码核PTEN干扰肽的转基因、ER压力抑制剂、压力颗粒阻断剂或miRNA生物发生活化剂。

适用于本发明方法中的抑制性核酸包括反义寡核苷酸、siRNA化合物、诸如siRNA化合物的单股或双股RNA干扰(RNAi)化合物、经修饰的碱基/锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)及与目标SOD1或MMP9的至少一部分杂交的其他寡聚化合物或寡核苷酸模拟物。在一些实施例中，抑制性核酸包括反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经修饰键联的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)、微干扰RNA(miRNA)、小时序RNA(stRNA)、或短发夹RNA(shRNA)、小RNA诱导的基因活化(RNAa)、小活化RNA(miRNA)或其组合。

举例而言，反义寡核苷酸通常设计成藉由结合至DNA或RNA目标且阻止在转录、转译或剪接层面上的表达来阻断所述目标的表达。本发明的反义寡核苷酸是经设计以在严格条件下与SOD1或MMP9杂交的互补核酸序列。

举例而言，本文所描述的方法中所用的抑制性核酸包含一或多个经修饰的键或碱基。经修饰的碱基包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸或锁核酸(LNA)分子。优选地，经修饰的核苷酸为锁核酸分子，包括α-L-LNA。LNA包含核糖核酸类似物，其中核糖环经2'-氧与4'-碳间的亚甲基桥“锁定”；亦即，含有至少一个LNA单体的寡核苷酸。

举例而言，与SOD1或MMP9互补的核酸序列可为干扰RNA，包括(但不限于)小干扰RNA(“siRNA”)或小发夹RNA(“shRNA”)。用于构筑干扰RNA的方法是此项技术中所熟知的。

本发明的基因或与所述基因组合的本文所述的试剂可调配为医药组合物或与医药学上可接受的载剂的组合。这些医药组合物或组合可调配成非经肠、体表、经口、鞘内或藉由局部投药方式投与。这些医药组合物或组合可以任何方式调配且可视病状或疾病以及疾病程度、各患者的一般医学状况、所得优选投药方法及类似因素而以多种单位剂型投与。在一个实施例中，所述医药组合物或组合可经鞘内投与。举例而言，在实施例中，所述医药组合物或组合可经由鞘内注射活体内投与。

本发明的医药组合物或组合可根据此项技术中已知用于制造医药的任何方法制备。此类药物可含有甜味剂、调味剂、着色剂及防腐剂。调配物可混有适合制造的医药学上可接受的无毒赋形剂。调配物可包含一或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，且可以诸如以下形式提供：液体、粉末、乳液、冻干粉末、喷雾剂、乳膏、洗剂、控制释放调配物、锭剂、丸剂、凝胶、在贴片上、在植入物中等。

在一些实施例中，本文所描述的方法可包括与一或多种靶向SOD1或MMP9的抑制性核酸、编码核PTEN干扰肽的转基因、ER压力抑制剂、压力颗粒阻断剂或miRNA生物发生活化剂共投与。

在另一态样中，本发明提供一种在活体外筛选保护ALS中的运动神经元亚型的药物的方法，其包含(i)提供带有包含fALS基因及报导体基因的转基因的干细胞株；(ii)将药物与所述细胞株一起培养；(iii)引导所述细胞分化成运动神经元细胞及表达；及(iv)若自所述干细胞株中产生运动神经元亚型，则判定所述药物有效地保护ALS中的运动神经元亚型。

在一些实施例中，干细胞株是胚胎干细胞株或iPSC细胞株。在一些实施例中，干细胞株是人类或小鼠干细胞株。

在一些实施例中，fALS基因为含有经扩增的GGGGCC重复序列的C9orf72突变、FUS-R521C、FUS-P525R、FUS-R521H、FUS-Q210H、FUS-R514G、FUS-C1574G、SOD1-G93A、SOD1-A4V、SOD1-D90A、SOD1-D91A、SOD1-H46R、SOD1-A89V、SOD1-I113T、TDP43-A315T、TDP43-Q343R、TDP43-M337V、TDP43-N345K、TDP43-I383V或TDP43-M337V。

在一些实施例中，所述报导体为双报导体。在一些实施例中，所述双报导体为Hb9::RFP及FoxP1::GFP。

在另一态样中，本发明提供一种用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型的方法，其包含提供生物样品及侦测微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者核PTEN的存在，其中失调的微RNA-17～92成员或核PTEN的存在指示对个体的ALS中的运动神经元亚型的诊断或对ALS中运动神经元亚型的易感性。

本文亦提供用于诊断个体的ALS中的运动神经元亚型或对ALS中运动神经元亚型的易感性的套组，其包含一或多种用于侦测生物样品中微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者PTEN的存在的试剂。在一个特定实施例中，所述套组包含至少一个用于侦测微RNA-17～92丛集的一或多个成员或者PTEN的存在的连续核苷酸序列，所述核苷酸序列实质上为微RNA-17～92丛集的一或多个成员或PTEN或者与其互补。举例而言，核酸可包含至少一个与微RNA-17～92或PTEN(完全、部分)互补的序列。在一个实施例中，所述套组中的一或多种试剂经标记，且因此，这些套组可进一步包含能够侦测所述标记的试剂。所述套组可进一步包含有关使用所述套组的组件侦测ALS中的运动神经元亚型的说明书。

以下实例中进一步描述本发明，这些实例不限制申请专利范围中所描述的本发明的范围。

实例

材料及方法

小鼠

携带突变型人类SOD1

为了产生具有双转基因(Tg)报导体的小鼠，将脊髓MN报导体Hb9::RFP构筑体经电穿孔放入BALB/c胚胎干细胞(ESC)中且注射至宿主小鼠中。若干嵌合小鼠出生且进一步使其与C57BL/6J野生型小鼠杂交以获得种系传递的转基因Hb9::RFP始建系(founder line)。使用具有在起始密码子处插入约195kb的5′FoxP1序列及GFP的BAC的FoxP1::GFP ES细胞株(由Jeremy Dasen及Hynek Wichterle惠赠)(44)在C57BL/6背景下得到FoxP1::GFP小鼠品系。随后，使FoxP1::GFP品系与Hb9::RFP品系配对，得到在C57BL/6背景下具有双Tg报导子(FoxP1::GFP；Hb9::RFP)的小鼠。在E12.5时分析双Tg FoxP1::GFP；Hb9::RFP胚胎以验证双报导体的功效。所有活动物均保持在经中央研究院动物实验管理小组(IACUC AcademiaSinica)批准及监督的SPF动物设施中。

组织收集

小鼠在用300μL的20mg/mL阿佛丁(Avertin)(2,2,2-三溴乙醇，Sigma)麻醉下处死且随后灌注PBS及含4％多聚甲醛(PFA)的PBS。分离整个脊髓，再固定且在蔗糖中低温保存。将脊髓包埋于FSC 22冷冻切片包埋剂(Leica)中，且切割为10μm恒冷箱切片(cryostatsection)，随后藉由3'DIG标记的LNA miRCURY探针(Exiqon)进行免疫染色或原位杂交。关于步骤及分析的详细说明提供于SI材料及方法中。

雷射捕获显微切割

小鼠在用阿佛丁麻醉下处死且随后灌注DEPC-PBS。取出脊髓且在7分钟内切割成若干段，随后包埋于FSC 22冷冻切片包埋剂(Leica)中。在-20℃下，将冷冻块低温切割成20μm厚的切片且储存在-80℃下直至雷射捕获程序。

对于MN的染色，各切片用不含RNA酶的70％乙醇洗涤60秒，在含1％天蓝B(MPBiomedicals)的洗涤溶液中染色180秒，随后再洗涤20秒，且随后完全风干。MN是鉴别为存在于L5腰椎脊髓的腹侧区中的较深染色的大细胞体，而背侧非MN是鉴别为位于背侧脊髓中的经天蓝B染色的细胞体。自各小鼠显微切割(PALM MicroBeam，ZEISS，20X物镜)约400～500个MN或背侧非MN且收集至单个管中。自每一品系的3～4只小鼠收集MN及背侧非MN。

脊髓运动神经元计数

在各指定阶段，在10μm脊髓切片的一侧对L5腹角中具有DAPI的ChAT

AAV9病毒制备及注射

AAV9-mir-17～92质粒的构筑描述于SI方法中。AAV9-mir-17～92及AAV9-GFP是由中央研究院的AAV核心设施(AAV Core Facility)封装。对于鞘内注射，在P60时小鼠藉由异氟醚麻醉。经由在小鼠背部以手术方式切开约1.5cm窗口，暴露出腰椎脊髓。使用27G针将20μL的AAV9-GFP或AAV9-mir-17～92(5×10

实例1mir17～92/PTEN在成体脊髓MN中表达及维持MN存活的mir-17～92要求

在先前研究(Tung，Y.T.，Lu，Y.L.，Peng，K.C.，Yen，Y.P.，Chang，M.，Li，J.，Jung，H.，Thams，S.，Huang，Y.P.，Hung，J.H.等人(2015).Mir-17～92 Governs Motor NeuronSubtype Survival by Mediating Nuclear PTEN.Cell reports 11，1305-1318)中发现，mir-17～92miRNA丛集的表达在正在发育的LMC-MN中富集，且所述丛集从而在LMC-MN到达神经支配肌肉并自其得到神经营养支持前促进LMC-MN存活。在机械作用上，mir-17～92靶向PTEN及其相关E3泛素接合酶复合物，亦即Nedd4-2及Ndfip1。因此，PTEN单泛素化较少且大部分保留在细胞质中以防止LMC-MN在正在发育的脊髓中经历天然存在的细胞凋亡(图1A)。

鉴于许多脊髓发作ALS患者是自四肢无力开始，且活动性去神经在ALS患者的四肢中比在其胸椎椎旁肌中发生得更显著，故LMC-MN看来比在ALS中的其他MN类型更容易发生退化(Kanning，K.C.，Kaplan，A.及Henderson，C.E.(2010).Motor neuron diversity indevelopment and disease.Annual review of neuroscience 33，409-440)。此情形促使吾人检查mir-17～92/核PTEN(nPTEN)是否能经由其在成体MN亚型中的不同表达造成ALS中MN亚型的不同易损性(图1A)。

先使用miR-17作为丛集中的代表性miRNA且胆碱乙酰转移酶(ChAT)作为MN标记物，在产后第40天(P40)藉由在经切片的成体腰椎脊髓中进行原位杂交(ISH)以及免疫染色，检查mir-17～92的表达在成体脊髓MN中是否仍保持富集(图1B)。尽管在整个脊髓中的神经元中可侦测到miR-17的表达，但其表达在腹侧脊髓中更显著(图1B及S1A)。定量验证了相较于位于腹侧脊髓处的闰绍细胞(Renshaw cell，RC)，脊髓MN中的miR-17表达量较高。

为了证实mir-17～92丛集的每一成员在MN中富集，对腹侧MN及来自背侧脊髓的非MN的细胞体进行雷射显微切割(图1C及图1D)并进行定量RT-PCR(qPCR)。使用ChAT以确保捕获了真正的MN(图1E)。与来自背侧脊髓的非MN相比，在成年小鼠脊髓的MN中mir-17～92的表达量更高(图1F)，证实mir-17～92的表达富集且自发育的胚胎持续至成体脊髓MN。

随后，检查mir-17～92的目标(亦即，PTEN)在成体脊髓中的表达。值得关注地是，PTEN在腹侧ChAT

吾人先前的研究指示，MN中mir-17～92缺失(Olig2

实例2 SOD1

为测试mir-17～92/nPTEN路径的失调与ALS的MN退化有关的假设，吾人将SOD1

为了精确定量在退化前完整SOD1

此外，除了mir-17～92在相同组经显微切割的MN中的下调外，吾人还观察到，与对照相比时，在P100时所捕获的SOD1

实例3 SOD1

为了进一步检查mir-17～92失调是否促成肢体神经支配MN对ALS的易损性，在此情境下，吾人确立一种新颖的双重转基因小鼠品系，其中肢体神经支配LMC-MN标记有GFP(Foxp1::GFP)且普通运动神经元标记有RFP(Hb9::RFP)。为验证报导体的保真度，吾人检查双重荧光报导体沿脊髓的延喙尾轴的表达模式。如所预期，在LMC-MN中侦测到Foxp1::GFP信号，而在LMC-MN及非LMC-MN两者中侦测到Hb9::RFP信号。因此，LMC-MN及非LMC-MN可藉由活体内转基因报导体的组合来区分，其中GFP

在此情况下，吾人进一步得到Foxp1::GFP；Hb9::RFP胚胎干细胞(ESC)株，且随后使用确定的方案使其分化成脊髓MN，由此产生颈/臂Hoxa5

随后，吾人使Foxp1::GFP；Hb9::RFP品系与Ctrl及SOD1

为了阐明MN亚型对CPA压力的敏感性差异，吾人研究CPA处理后24小时(亦即，在LMC-MN损失之前的时间点)时在吾人的ESC源性MN系统中mir-17～92及其目标(PTEN、Ndfip1及Nedd4-2)的表达。在SOD1

实例4 SOD1

随后，吾人研究在CPA处理后24小时自Ctrl及SOD1

为了进一步细查MN亚型是否对核PTEN的细胞毒性起不同反应，吾人采用卵内系统，藉由将PTEN与核定位或核输出信号(NLS及NES)的融合物电穿孔放入正在发育的鸡胚胎中进行(图4C)。与PTEN-WT及PTEN-NES的微小作用相比，PTEN-NLS的异位过度表达则导致Foxp1

总之，这些发现表明选择性mir-17～92/nPTEN失调在SOD1

实例5人类ALS SOD1

为了进一步探究在人类MN情形下mir-17～92的作用是否相关，吾人使带有MN报导体Hb9::GFP(HuES3 HB9::GFP)的人类ESC细胞株在限定条件下分化为MN(Maury，Y.，Come，J.，Piskorowski，R.A.，Salah-Mohellibi，N.，Chevaleyre，V.，Peschanski，M.，Martinat，C.及Nedelec，S.(2014).Combinatorial analysis of developmental cues efficientlyconverts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.Naturebiotechnology)，由此重演自OLIG2

接下来，自携带SOD1

为了加快ALS进展，吾人在MN成熟后(自第32～60天)剥夺培养基中的NF(Shi，Y.，Lin，S.，Staats，K.A.，Li，Y.，Chang，W.H.，Hung，S.T.，Hendricks，E.，Linares，G.R.，Wang，Y.，Son，E.Y.等人(2018).Haploinsufficiency leads to neurodegeneration inC9ORF72 ALS/FTD human induced motor neurons.Nature medicine 24，313-325)，导致自ALS-SOD1

实例6在人类SOD1

为研究mir-17～92是否能充当停止ALS中MN退化的目标，随后吾人测试操纵mir-17～92的表达是否能修复人类ALS-iPSC源性MN中的MN退化。吾人在NF剥夺前利用慢病毒(LV)将hsa-mir-17～92或作为对照的YFP递送至iPSC～MN中(图6A)。在整个存活分析中，分别藉由免疫染色及qPCR确认ALS-SOD1

实例7藉由在MN中过度表达mir-17～92改善SOD1

为研究mir-17～92是否能在活体内拯救ALS中的MN退化，吾人随后测试操纵mir-17～92的表达是否能改善SOD1

为进一步检查mir-17～92过度表达是否改善ALS症状及运动功能，吾人进行一系列生理分析(Kanning，K.C.，Kaplan，A.及Henderson，C.E.(2010).Motor neurondiversity in development and disease.Annual review of neuroscience 33，409-440)。在P140，[SOD1

实例8 AAV9-mir17～92的成年投药延长SOD1

在SOD1

为了在更接近临床的环境中评估小鼠，吾人藉由量测CMAP来分析MN及腓肠肌(GA)肌肉连接性。吾人在以下若干时间点进行CMAP：自P60(在即将AAV处理前)至P140。在P60时，SOD1

综合而言，吾人的结果证实，mir-17～92是经由调节成体MN中的PTEN亚细胞易位来维持MN存活的一个必不可少的固有调节因子。在ALS情形中，藉由遗传方法或在成体中递送scAAV9以在MN中过度表达mir-17～92将延迟MN退化的发作、增强运动功能且延长ALS小鼠模型的寿命。这些发现设想mir-17～92为ALS患者MN退化的预后标记物及有希望的候选治疗目标。