一种毛囊外根鞘混悬液及其制备方法

技术领域

本发明涉及毛囊外根鞘混悬液技术领域，具体涉及一种毛囊外根鞘混悬液及其制备方法。

背景技术

白癜风是一种获得性黑素细胞缺失引起的色素性皮肤病，其临床的典型特征为皮肤出现单一或多处的白斑。我国的白癜风发病率约为0.09％-2.7％，近年来发病率呈上升趋势。白癜风虽然不危及患者生命，但是病情的迁延不愈、反复发作给患者造成了巨大的心理负担，阻碍患者的人际交往，甚至造成心理疾病。

白癜风的病因尚不明确，一般认为病因与以下几个方面有关：1、遗传易感性，有一定的家族遗传聚集现象。2、自身免疫，常伴随着其他自身免疫性疾病。3、黑素细胞自毁，在白癜风患者的皮损区出现了不同情况的黑素细胞缺失。4、环境因素，长期接触含有酚类的物质可导致白癜风发病率增加。

白癜风的治疗方法并不完善，在该病进展期只能单纯依靠药物、光疗等方法进行治疗，而在稳定期才可以适当使用外科手段，在目前最常用的外科治疗方式是自体表皮移植手术，虽然表皮移植能够让皮损区复色，但是，其治疗面积完全受供皮区大小限制，对存在大面积皮损的患者只能通过多次表皮移植才能实现，这对患者的身心以及经济都造成了巨大的负担。

目前，也有通过自体黑色素细胞进行移植治疗，但是，现有技术中的黑色素细胞获取后需要进行培养后才能进行使用，培养过程中需要使用大量的生长因子、血清等物质，由于这些物质用于人体，会存在较大的安全隐患，而且，黑色素细胞培养的时间较长，导致治疗的周期延长。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种毛囊外根鞘混合液的制备方法，该方法可有效解决现有的黑色素细胞存在的培养时间长，培养所用溶液安全性的问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种毛囊外根鞘混悬液的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取患者头部毛囊单位；

(2)将步骤(1)中获取的毛囊单位用含有抗菌素的高糖DMEM培养基进行清洗；

(3)将步骤(2)中清洗后的毛囊单位放入含Ⅱ型胶原酶的高糖DMEM培养基中进行孵育；

(4)刮取步骤(3)中孵育后的毛囊单位上的毛囊外根鞘组织，过滤，得过滤物1和细胞混悬液，将细胞混悬液离心，收集沉淀，向沉淀中加入含有抗菌素的高糖DMEM培养基后吹打重悬，得混悬液1；

(5)将步骤(4)中过滤物1加入含有胰蛋白酶的EDTA溶液中进行消化，然后向其中加入含有抗菌素的高糖DMEM培养基稀释胰蛋白酶，过滤，得过滤物2和细胞混悬液，将细胞混悬液离心，收集沉淀，向沉淀加入含有抗菌素的高糖DMEM培养基后吹打重悬，得混悬液2；

(6)取步骤(5)中的过滤物2，将其重复步骤(5)中的操作，得混悬液3；

(7)将步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)中的混悬液1、2和3混合后以2000r/min的转速离心，得细胞沉淀，将细胞沉淀重悬，然后用细胞筛过滤得滤液，将滤液继续以2000r/min的转速离心5min，收集沉淀，将沉淀用含有抗菌素的高糖DMEM培养基重悬，制得。

进一步地，步骤(3)中将毛囊单位于37℃条件下在CO

进一步地，步骤(3)中所述高糖DMEM培养基中的Ⅱ型胶原酶的质量体积浓度为1mg/ml。

进一步地，步骤(4)和步骤(5)中分别将细胞悬液以3000r/min的转速离心5min。

进一步地，步骤(5)中的过滤物1于37℃条件下在CO

进一步地，步骤(5)中所述EDTA溶液中胰蛋白酶的质量体积浓度为0.25％。

进一步地，步骤(2)、步骤(4)、步骤(5)和步骤(7)中所述高糖DMEM中抗菌素为青霉素-链霉素-两性霉素B混悬液，其中青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml，两性霉素的浓度为0.25ug/ml。

进一步地，步骤(7)中所述细胞筛的孔径为70um。

采用上述方法制备得到毛囊外根鞘混悬液。

采取上述方案所产生的有益效果为：

本发明中的培养基内不含任何血清及生长因子，对人体无害，移植后的安全性较高，而且，本发明中的黑色素细胞提取后无需进行体外培养，可直接应用于人体进行治疗。

本发明中的外根鞘混悬液在制备过程中，先采用含有青霉素-链霉素-两性霉素B的培养基对提取的黑色素细胞进行浸洗，可有效杀死操作过程中的污染细菌，然后用含Ⅱ型胶原酶的高糖DMEM培养基对其进行消化处理，再用含有胰蛋白酶的EDTA溶液进行处理，通过不同的作用机制对细胞组织进行消化，进而提高消化效果。

具体实施方式

实施例1

一种毛囊外根鞘混悬液的制备方法，包括以下步骤：

(1)选取病期处于稳定的白癜风患者，对其枕部进行备皮，选取毛囊茂密的部位使用碘伏进行消毒，并使用生理盐水进行擦拭，盐酸利多卡因注射液皮下浸润麻醉，采用提取仪顺着毛发的生长方向取得完整的毛囊，将取下的毛囊放置在生理盐水中；

(2)将步骤(1)中获取的毛囊单位用含有青霉素-链霉素-两性霉素B的高糖DMEM培养基进行清洗3次；

(3)将步骤(2)中清洗后的毛囊单位放入含Ⅱ型胶原酶的高糖DMEM培养基中于37℃条件下在CO

(4)用手术刀刮取步骤(3)中孵育后的毛囊单位上的毛囊外根鞘组织，过滤，得过滤物1和细胞混悬液，将细胞混悬液以3000r/min的转速离心5min，收集沉淀，向沉淀中加入含有青霉素-链霉素-两性霉素B的高糖DMEM培养基后吹打重悬，得混悬液1；

(5)将步骤(4)中过滤物1加入含有胰蛋白酶的EDTA溶液中于37℃条件下在CO

(6)取步骤(5)中的过滤物2，将其重复步骤(5)中的操作，得混悬液3；

(7)将步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)中的混悬液1、2和3混合后以2000r/min的转速离心，得细胞沉淀，将细胞沉淀重悬，然后用孔径为70um的细胞筛过滤得滤液，将滤液继续以2000r/min的转速离心5min，收集沉淀，将沉淀用含有青霉素-链霉素-两性霉素B的高糖DMEM培养基重悬，制得。

上述步骤中所用的高糖DMEM培养基中青霉素-链霉素-两性霉素B中青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为0.1mg/ml，两性霉素的浓度为0.25ug/ml。

对比例1

在实施例1的基础上，将步骤(3)中高糖DMEM培养基中的Ⅱ型胶原酶替换成中性蛋白酶。

对比例2

在实施例1的基础上，将步骤(3)中高糖DMEM培养基中的Ⅱ型胶原酶的质量体积浓度变为3mg/ml。

对比例3

在实施例1的基础上，将步骤(2)、(4)和(5)中高糖DMEM培养基中的青霉素-链霉素-两性霉素B替换为青霉素。

试验例

用碘伏对患者的皮损区进行消毒，生理盐水擦拭，盐酸利多卡因注射液对患处皮肤进行皮下浸润麻醉，之后使用机械皮肤消磨机将皮损区的表皮移除，然后用注射器分别吸取实施例1和对比例1-3中制得的毛囊外根鞘混悬液，在注射器头部安装钝头吸取针，将毛囊外根鞘混悬液均匀涂抹在患者的皮损区，然后使用几丁聚糖生物膜覆盖患处，并在其上覆盖纱布，绷带包扎即可。注射2周后，观察患者患部，对患部的颜色变化进行记录，具体详见表1。

表1：患者患处皮肤颜色变化统计表

通过上表得知，按照本发明中的方法制得的毛囊外根鞘混悬液可有效治疗患者的白癜风，且治疗效果较好，治疗后患处皮肤颜色基本恢复正常，而且，现有的方法制得的毛囊外根鞘混悬液的制备时间较短，无需体外培养的过程，缩短了治疗周期。且按照本发明中的方法制得的毛囊外根鞘混悬液中的黑色素细胞活性较高，其内的杂菌较少，不易引起皮肤感染。