用于递送外用制剂中的生物试剂的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年5月11日提交的第62/670,711号美国临时申请的权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及向真皮和/或浅表肌肉递送外用制剂中的生物试剂的方法。

背景技术

对于有益试剂的递送，人类皮肤是易于达到的表面。成人身体的皮肤平均覆盖约2m

发明内容

在一个方面，提供了递送生物试剂的方法。所述方法包括处理皮肤区域以破坏皮肤区域中的角质层来限定所处理的皮肤区域；并将制剂施用于所处理的皮肤区域，所述制剂包含生物试剂和药学上可接受的载体，其中处理和施用的步骤实现了生物试剂的局部或经皮递送。

在一个实施方案中，所述处理包括化学或机械处理或化学和机械处理的组合。

在一个实施方案中，所述处理包括含透明质酸的制剂，其中一部分透明质酸为结晶形式或微针(microspicule)形式。

在另一个实施方案中，所述处理为皮辊(dermal roller)。在一个实施方案中，所述皮辊具有多个微突起，这些微突起具有与角质层接触的扁平的刀片状边缘。在另一个实施方案中，所述皮辊具有多个微突起，这些微突起具有终止于与角质层接触的尖端的锥形轴。

在一个实施方案中，皮肤区域通过使皮辊经过皮肤区域一次来处理。在另一个实施方案中，皮肤区域通过使皮辊经过皮肤区域超过一次来处理。。

在又一个实施方案中，所述处理是胶带剥离。在一个实施方案中，所述胶带剥离包括施用和去除胶带条至少两次。在另一个实施方案中，所述胶带剥离包括施用和去除胶带条2-20次或3-12次。

在一个实施方案中，所述处理和施用是同时进行的。

在一些实施方案中，所述生物试剂是梭菌衍生物。在一个实施方案中，所述梭菌衍生物是肉毒杆菌毒素。在其他实施方案中，所述生物试剂的分子量大于约100,000道尔顿。在替代实施方案中，所述生物试剂的分子量大于约40,000道尔顿。

在另一方面，用生物试剂处理定位区域的病况的方法包括：处理皮肤区域以破坏皮肤区域中的角质层来限定所处理的皮肤区域；并将制剂施用于所处理的皮肤区域，所述制剂包含生物试剂和药学上可接受的载体。所述处理和/或施用实现了生物试剂的局部或经皮递送。

在一个实施方案中，所述病况是细纹或皱纹。在一个实施方案中，所述细纹或皱纹选自外眼角纹(lateral canthal lines)、眉间纹、额头纹、颈阔肌纹、鼻唇纹、口周唇纹及其组合。

在其他实施方案中，所述病况是皮肤松弛。在又一些其他实施方案中，所述病况是油性皮肤、皮脂或毛孔增大。在又一些其他实施方案中，所述病况是色素过量或减少。在一个实施方案中，所述病况是色素沉着过度。

在另一方面，提供了改善皮肤质量的方法。所述方法包括处理皮肤区域以破坏皮肤区域中的角质层来限定所处理的皮肤区域，并将制剂施用于所处理的皮肤区域，所述制剂包含梭菌衍生物和药学上可接受的载体。所述处理和/或施用实现了梭菌衍生物的皮肤递送，用于改善皮肤质量。

在一个实施方案中，所述处理不包括用化学溶剂处理，例如但不限于二甲基亚砜(DMSO)、油醇、丙二醇(PG)、甲基吡咯烷酮和十二烷基氮杂环庚烷2-酮

附图说明

以下附图用于说明本申请实施方案的方面和特征。

图1A是在局部施用IgG之前，用透明质酸制剂处理的人尸体皮肤的共焦激光扫描显微镜图像，所述图像是在0μm、8μm、16μm、24μm、32μm、40μm、48μm、56μm和64μm的组织深度处拍摄的图像，其中IgG被荧光标记以可视化IgG的渗透深度；

图1B是在局部施用IgG之前，未经皮肤处理的人尸体皮肤的共焦激光扫描显微镜图像，所述图像是在0μm、8μm、16μm、24μm、32μm、40μm、48μm、56μm和64μm的组织深度处拍摄的图像，其中IgG被荧光标记以可视化IgG的渗透深度；

图1C是用透明质酸制剂处理但未经IgG处理的人尸体皮肤的共焦激光扫描显微镜图像，所述图像是在0μm、8μm、16μm、24μm、32μm、40μm、48μm、56μm和64μm的组织深度处拍摄的图像；

图2A是在局部施用IgG之前，经过微针皮辊处理的人尸体皮肤的共焦激光扫描显微镜图像，所述图像是在IgG施用后一小时且在0μm至280μm内的每隔10μm组织深度处拍摄的图像，其中IgG被荧光标记以可视化IgG的渗透深度；

图2B是在局部施用IgG之前，未经处理的人尸体皮肤的共焦激光扫描显微镜图像，所述图像是在IgG施用后一小时且在0μm至280μm内的每隔10μm组织深度处拍摄的图像，其中IgG被荧光标记以可视化IgG的渗透深度；

图3A是示出肌内(IM)或皮内(ID)注射BoNT/A(10U/kg)后3-4天观察到的大鼠足趾伸展评分(DAS)的最大均值的柱状图(n＝6只大鼠/给药方法)；

图3B是示出在经过以下步骤处理皮肤之后的大鼠DAS得分的最大均值的柱状图，所述步骤为：用针长为0.25mm、0.5mm或1.0mm的皮辊处理皮肤，其中将皮辊在正在进行处理的皮肤区域内经过一次(1X)或两次(2X)，然后局部施用BoNT/A组合物；

图3C是示出用针长为0.25mm、0.5mm或1.0mm的皮辊处理皮肤后，与DAS分析相比，在大鼠胫骨前肌的肌肉神经接点的SNAP25

图4是示出在经过以下步骤处理皮肤之后的大鼠DAS得分的最大均值的柱状图，所述步骤为：用针长为0.5mm的皮辊处理皮肤，其中将皮辊在正在进行处理的皮肤区域内通过两次，然后局部施用包含指定浓度的BoNT/A的两种不同制剂；

图5是示出用两种不同的皮辊(定义为MTX和DRS)处理皮肤后的大鼠DAS得分的最大均值的柱状图，其中在施用外用制剂BoNT/A之前将皮辊在正在处理的皮肤区域内经过两次(2X)、三次(3X)、四次(4X)或5次(5X)；

图6是示出在施用包含150kDa BoNT/A或900kDa BoNT/A的外用制剂之前，用皮辊处理皮肤之后的大鼠DAS得分的平均峰值的柱状图；和

图7是免疫组织化学(IHC)染色，其示出在胶带剥离且将BoNT/A局部施用至覆盖的皮肤表面后，大鼠TA肌肉的一些运动神经末梢和轴突中的轻度SNAP25

具体实施方式

定义

以下定义适用于本文：

本文所用的“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员确定的具体值的可接受的误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值(即测量系统的局限性)。例如，按照本领域的实践，“约”可以指标准偏差在1以内或大于1。如果在本申请和权利要求中记载了具体值，除非另有说明，否则术语“约”是指在具体值的可接受的误差范围内。

“给予”或“给药”是指将肉毒杆菌毒素给予(即给药)受试者的步骤，或者受试者接受药物组合物的步骤。

“缓解”是指病况或与病况相关的症状的发生减少。因此，缓解包括一些减少、显著减少、接近完全减少和完全减少。在向患者给予梭菌衍生物后的1至7天或此后有时在临床上可能不显现出缓解作用。

“不含动物蛋白”是指不存在血液来源、血液汇集和其他动物来源的产品或化合物。“动物”是指哺乳动物(如人)、鸟、爬行动物、鱼、昆虫、蜘蛛或其他动物物种。“动物”不包括微生物，如细菌。因此，不含动物蛋白的药物组合物可以包含肉毒杆菌神经毒素。例如，“不含动物蛋白”的药物组合物是大体上不含或基本上不含或完全不含血清来源的白蛋白、明胶和其他动物来源的蛋白(如免疫球蛋白)的药物组合物。不含动物蛋白的药物组合物的实例是包含肉毒杆菌毒素(作为活性成分)和合适的多糖(作为稳定剂或赋形剂)或由肉毒杆菌毒素(作为活性成分)和合适的多糖(作为稳定剂或赋形剂)组成的药物组合物。

“生物试剂”意指具有生物活性的分子，其分子量为5,000道尔顿或更大，或其分子量在本文指定的值的范围内。

“肉毒杆菌毒素”是指由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的神经毒素，以及由非梭菌物种以重组方式制成的肉毒杆菌毒素(或其轻链或重链)。本文使用的术语“肉毒杆菌毒素”包括血清型A肉毒杆菌毒素(BoNT/A)、血清型B肉毒杆菌毒素(BoNT/B)、血清型C肉毒杆菌毒素(BoNT/C)、血清型D肉毒杆菌毒素(BoNT/D)、血清型E肉毒杆菌毒素(BoNT/E)、血清型F肉毒杆菌毒素(BoNT/F)、血清型G肉毒杆菌毒素(BoNT/G)、血清型H肉毒杆菌毒素(BoNT/H)、血清型X肉毒杆菌毒素(BoNT/X)和嵌合体肉毒杆菌毒素和/或其亚型和变体。本文使用的“肉毒杆菌毒素”还包括“修饰的肉毒杆菌毒素”。此外本文使用的其他“肉毒杆菌毒素”还包括肉毒杆菌毒素复合体(例如，300、600和900kDa复合体)，以及与复合蛋白无关的肉毒杆菌毒素的神经毒性成分(150kDa)。

“梭菌衍生物”是指含有梭菌毒素任何部分的分子。如本文所用，术语“梭菌衍生物”包括天然或重组的神经毒素、重组修饰的毒素、其片段、靶向囊泡胞吐调节剂(TEM)或其组合。

“梭菌毒素”是指由可执行整体细胞机制的梭菌毒素菌株所产生的任何毒素，由此梭菌毒素使细胞中毒并且包括梭菌毒素与低亲和力或高亲和力的梭菌毒素受体的结合、毒素/受体复合体的内化、梭菌毒素轻链易位到细胞质和梭菌毒素底物的酶修饰。梭菌毒素的非限制性实例包括肉毒杆菌毒素，如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C

用于生物活性成分的“有效量”是指通常足以在受试者中引起期望的变化的成分的量。例如，当期望的效果是减少结石形成时，成分的有效量是至少使膀胱过度活动症和相关症状显著减少，并且不产生显著的毒性的量。

术语“完整的皮肤”是指保留其天然屏障功能，并且没有被化学手段或物理处理以可能损害角质层屏障功能的方式改变的皮肤。相反，“非完整的”皮肤是指以损害角质层屏障功能的方式处理的皮肤。

“定位给药”是指在动物体上或动物体内的某一部位或附近给予药剂(期望在该部位处具有药物的生物学效应)，例如通过肌内或皮内或皮下注射或局部给药。定位给药不包括全身性给药途径，如静脉内或口服给药。局部给药是将药剂施用于患者的皮肤上的一种定位给药。

“经修饰的肉毒杆菌毒素”是指与天然肉毒杆菌毒素相比，至少一个氨基酸缺失、改变或替代的肉毒杆菌毒素。此外，经修饰的肉毒杆菌毒素可以是以重组方式产生的神经毒素，或者是以重组方式制备的神经毒素的衍生物或片段。经修饰的肉毒杆菌毒素保留了天然肉毒杆菌毒素的至少一种生物活性，例如与肉毒杆菌毒素受体结合的能力，或抑制神经递质从神经元释放或囊泡从非神经元细胞释放的能力。经修饰的肉毒杆菌毒素的一个实例是具有来自一种血清型(如血清型A)肉毒杆菌毒素的轻链和来自不同血清型(如血清型B)肉毒杆菌毒素的重链的肉毒杆菌毒素。经修饰的肉毒杆菌毒素的另一个实例是偶联到神经递质(如物质P)的肉毒杆菌毒素。

术语“分子量”是指构成分子的所有原子的原子量之和，可以用以道尔顿(Da)在数量上表示。

“突变”是指天然存在的蛋白质或核酸序列的结构改变。例如，在核酸突变的情况下，突变可以是DNA序列中一个或多个核苷酸的缺失、增加或替代。在蛋白质序列突变的情况下，突变可以是蛋白质序列中一个或多个氨基酸的缺失、增加或替代。例如，蛋白质序列中包含的一个具体氨基酸可以被另一个氨基酸替代，例如，选自以下的氨基酸：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸或任何其他天然或非天然存在的氨基酸或化学修饰的氨基酸。蛋白质序列的突变可以是DNA序列突变的结果，即在将DNA序列转录且使所得的mRNA翻译时，产生突变的蛋白质序列。蛋白质序列的突变也可以通过将含有所需突变的肽序列与所需蛋白质序列融合而产生。

术语“被动经皮给药”是指通过将活性试剂置于皮肤表面而递送活性剂，由此活性剂根据皮肤表面的较高的药物浓度至皮肤内的较低的药物浓度的浓度梯度而渗入皮肤。

“外周给药”是指在离开症状位点的位置处给药，而不是定位(local)给药。

“药物组合物”是指包含活性药物成分，例如梭菌毒素活性成分(例如肉毒杆菌毒素)和至少一种额外成分(例如稳定剂或赋形剂等)的组合物。因此，药物组合物是适用于对受试者(例如人类患者)的诊断性或治疗性给药的制剂。药物组合物可以是，例如，在冻干或真空干燥条件下，冻干或真空干燥的药物组合物复水(reconstitution)后形成的溶液，或作为不需要复水的溶液或固体。

“药学上可接受的赋形剂”与“药学赋形剂”或“赋形剂”同义，是指在给予哺乳动物时基本上没有长期或永久有害影响的任何赋形剂，并且包含例如以下化合物：稳定剂、膨胀剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、添加剂、媒介物(vehicle)、载体、稀释剂或辅助剂。赋形剂通常与活性成分混合，或允许稀释或包封活性成分，且可以是固体、半固体或液体剂。也考虑包含梭菌毒素活性成分的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，该赋形剂有利于将活性成分加工成药学上可接受的组合物。只要任何药学上可接受的赋形剂不是与梭菌毒素活性成分不相容的，那么就考虑将其用于药学上可接受的组合物中。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可参见例如Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(Howard C.Ansel et al.，eds.，Lippincott Williams&WilkinsPublishers，第7版，1999)；Remington：The Science and Practice of Pharmacy(AlfonsoR.Gennaro ed.，Lippincott，Williams&Wilkins，第20版，2000)；Goodman&Gilman′s ThePharmacological Basis of Therapeutics(Joel G.Hardman等人，eds.，McGraw-HillProfessional，第10版，2001)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients(RaymondC.Rowe等人，APhA Publications，第3版，2003)，上述每一篇均以引用的方式全文纳入本说明书。

本文使用的“TEM”与“靶向胞吐调节剂”或“重靶向内肽酶”或“靶向分泌抑制剂(TSI)”同义。一般来说，TEM包含来自梭菌毒素轻链的酶结构域、来自梭菌毒素重链的易位结构域、和靶向结构域。TEM的靶向结构域提供了改变的细胞靶向能力，使分子靶向至除了天然存在的梭菌毒素所利用的天然梭菌毒素受体以外的受体。这种重靶向能力是通过将梭菌毒素的天然存在的结合结构域替换为具有针对非梭菌毒素受体的结合活性的靶向结构域来实现的。虽然与非梭菌毒素受体结合，但TEM经历了中毒过程的所有其他步骤，包括将TEM/受体复合体内化到细胞质中，在囊泡膜和二链分子中的形成孔，将酶结构域易位到细胞质中，并对靶细胞的SNARE复合体的组分发挥蛋白水解作用。

本文使用的“局部施用(topical application)”或“局部施用(topicallyapplying)”是指直接涂抹或扩散到表皮组织，特别是外层皮肤，其中角质层可能是完整的或被破坏的。

本文使用的“局部递送”或“局部给药”等是指使局部施用的活性剂进入皮肤以定位递送至皮肤。

本文使用的“经皮”是指进入和/或穿透皮肤，以定位递送至浅表肌肉或全身递送活性剂。

“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指暂时或永久地缓解(或消除)至少一种症状(例如髋关节和腹股沟疼痛)。

“治疗有效量”是指足以达到所需的治疗效果的量。

“变体”是指相对于野生型肉毒杆菌毒素，通过替换、修饰、增加或缺失至少一个氨基酸而进行修饰的梭菌神经毒素，如野生型血清型A、B、C、D、E、F、G、H、X、嵌合体肉毒杆菌毒素，和/或其亚型、杂种、嵌合体，其被靶细胞识别，由靶细胞内化，并在靶细胞中催化裂解SNARE(SNAP(可溶性NSF附着蛋白)受体)蛋白。

变体神经毒素组分的实例可以包含具有一个或多个被替代、修饰、缺失和/或增加的氨基酸的肉毒杆菌毒素的变体轻链。这种变体轻链可能有相同或更好的防止胞吐作用的能力，例如，释放神经递质囊泡。此外，与母体化学实体相比，变体的生物学效应可能降低。例如，具有经去除的氨基酸序列的A型肉毒杆菌毒素的变体轻链可能比母体(或天然的)A型肉毒杆菌毒素轻链的生物持久性更短。

治疗方法

在一个方面，提供了局部或经皮递送生物试剂的方法。所述方法包括：处理皮肤区域以破坏皮肤区域中的角质层来限定所处理的皮肤区域，并将制剂施用于所处理的皮肤区域，所述制剂包含生物试剂和药学上可接受的载体。所述处理和/或施用实现了生物试剂的局部或经皮递送。在一些实施方案中，所述处理和/或施用实现了将生物试剂递送到，例如，所处理的皮肤区域的浅表肌肉或所处理的皮肤区域的真皮。在其他方面，提供了用于处理定位区域的病况、用于改善皮肤质量或用于处理损伤或衰老皮肤的方法。在一些实施方案中，所述生物试剂为梭菌衍生物。

进行了一项研究以表明处理皮肤病况的方法，其通过处理皮肤区域和施用生物试剂进行，如实施例1所述。用含有透明质酸微晶的研磨擦洗剂处理人尸体皮肤，以破坏角质层。用透明质酸擦洗剂处理后，将包含生物试剂IgG的制剂施用于所处理的皮肤区域。IgG为150kDa蛋白。它是荧光标记的，以便可视化其进入皮肤的渗透深度。对于比较对照，一些皮肤样本在施用IgG制剂之前不使用透明质酸擦洗剂处理，其他皮肤样本仅使用透明质酸擦洗剂(即不施用IgG制剂)处理。用共焦激光扫描显微镜对皮肤样本以增加组织深度的方式进行扫描直到无法检测到荧光，并捕获图像。结果如图1A-IC所示。

参考图1A，在局部施用IgG之前，用透明质酸擦洗剂处理的皮肤的共焦激光扫描显微镜的图像在如每张图像所示的在不同的组织深度处示出。共聚焦图像显示，经荧光标记的IgG的渗透深度约为32μm。图像还显示，用透明质酸擦洗剂改变了皮肤的形态。这通过检查图1B中的图像也是明显的，其对应于未用透明质酸擦洗剂处理的皮肤对照样本。将生物试剂施用于皮肤(未对皮肤进行处理以破坏角质层)实现了IgG渗透深度为约8μm。未接受透明质酸擦洗剂处理的对照样本的图像(图1B)也表明荧光强度低得多，几乎看不见。对于用透明质酸擦洗剂处理而不用IgG处理的其他对照样本，图像如图1C所示。在仅用透明质酸擦洗剂处理的对照皮肤样本中检测到很少的背景荧光。这些结果表明，使用研磨擦洗剂(如含有透明质酸微晶的研磨擦洗剂)破坏皮肤上的角质层，可以改善生物试剂(如150kDa IgG)对于表皮/真皮屏障的递送，并且表明可以通过破坏皮肤结构以提高皮肤中的大分子渗透。在一个实施方案中，在限定区域内处理皮肤以破坏角质层，并将含有生物试剂的制剂施用于所处理的皮肤区域，实现了生物试剂渗入限定区域的渗透深度的增加，该渗透深度是施用于未经处理以破坏角质层的皮肤的相同制剂的生物试剂的渗透深度的至少约2、2.5、3、3.5或4倍。

在另一项研究中，使用皮辊处理皮肤区域，以破坏角质层。如实施例2所述，用具有长度为0.5mm的针的皮辊对人尸体皮肤样本进行微穿孔。用皮辊处理后，将具有荧光标记的IgG的制剂施用于所处理的皮肤区域。一小时后，用共焦激光扫描显微镜对皮肤进行分析，并以10μm厚度扫描穿入皮肤层，直到可以看见荧光。作为对照，在施用IgG制剂之前不使用皮辊处理皮肤样本。

图2A显示了在局部施用荧光标记的IgG之前，用微针皮辊处理皮肤的图像。该图像显示了所创建的微通道的深度220μm是检测荧光标记的IgG的极限。图2B显示了在局部施用IgG之前未用皮辊处理的皮肤的图像。超过约70μm深度就不能看见荧光标记的IgG。这些结果表明，生物试剂在使用皮辊物理处理后渗透到人皮肤的深度是没有使用物理处理的三倍。在皮辊处理(图2A)后，荧光标记物在大约220μm深度是可见的，而没有使用皮辊处理(图2B)的对照皮肤，荧光标记物在大约70μm深度是可见的。递送到220μm深度等于递送到皮肤的真皮层。这些结果表明，可以通过在施用生物试剂之前或同时破坏皮肤结构，使分子量大于5,000道尔顿、10,000道尔顿、50,000道尔顿、75,000道尔顿或100,000道尔顿的生物试剂在皮肤中的渗透增强。在一个实施方案中，渗透增强是施用于未被处理以破坏角质层的类似皮肤区域的相同制剂中相同生物试剂所获得的渗透增强的至少约2、2.5、3、3.5、4、4.5或5倍。

实施例3描述了另一项研究，其中处理皮肤以破坏角质层从而允许递送生物试剂。在本研究中，生物试剂是A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)。用具有针长为0.25mm、0.50mm或1.0mm的皮辊对于无毛大鼠的胫骨前肌(TA)肌肉上覆盖的皮肤进行微穿孔。针装置滚动经过处理皮肤区域的数量或次数为一次或两次(即一次或两次经过，在图中表示为1X、2X等)。在用皮辊处理后，将包含150kDa生物试剂BoNT/A的制剂施用于所处理的皮肤区域。

为了测量(BoNT/A的皮肤渗透性，采用大鼠足趾伸展评分(DAS)。DAS是用于确定BoNT/A对局部肌肉减弱的功效的生理试验(Broide，R.S.等人，Toxicon，

在本研究中，在局部施用后，在第1-4天和第7天进行DAS读数，并观察和记录每组的DAS得分最大均值。评分标准如实施例3所示。使用皮内注射BoNT/A(10U/kg；900kDa)至TA肌肉上覆盖的皮肤作为阳性对照。先前已将皮内注射与相同毒素剂量的肌内注射进行了比较，结果发现其功效仅略有下降(分别为～ED70vs.～ED90)，如图3A所示。

参考图3B-3C，用皮辊微穿孔导致大鼠暂时性肌肉麻痹，DAS得分为0至4(在试验中的最大反应)(图3B)。长度为0.25mm的针导致在局部施用肉毒杆菌神经毒素的情况下的DAS得分低(均值＜1)。长度为0.5mm和1.0mm的针提供了比长度为0.25mm的针的实质上更好的DAS得分(3-4)，这表明针长度影响了屏障破坏的功效以及由此产生的BoNT/A递送的功效。不考虑针长度，与单次经过相比，用皮辊经过两次使递送增强。

大鼠DAS试验通常包括将BoNT/A肌内注射至一个后肢小腿肌肉(如胫骨前肌)，然后进行DAS评分。对于大鼠TA肌肉上覆盖的皮肤组织进行屏障破坏的处理(例如皮辊)以破坏角质层，可以促进功能性BoNT/A从皮肤表面递送到下层肌肉。与肌内注射一样，BoNT/A的这种局部施用也会引起剂量依赖性的、可测量的DAS反应。

单一皮辊调理(处理)和BoNT/A局部处理后的SNAP25

因此，在一个实施方案中，提供了将生物试剂递送到真皮和/或浅表肌肉的方法。所述方法包括：处理皮肤以破坏角质层，并将含有生物试剂的制剂局部施用于所处理的皮肤。在一个实施方案中，生物试剂完全且仅通过被动运输递送到真皮和/或浅表肌肉。被动运输或扩散依赖于药物在皮肤外表面和内表面之间的浓度梯度。扩散速率与梯度成正比，并受分子大小、疏水性、亲水性和其他物理化学性质以及吸收表面面积的调节。在一个实施方案中，将生物试剂递送到真皮和/或浅表肌肉，没有任何主动运输。主动运输或递送依赖于，例如，生物试剂的电离，或其他手段来推动试剂进入和穿过皮肤。主动运输递送系统包括方法例如离子透入疗法、超声促渗和热微穿孔法(thermal microporation)。

在实施例4中记载了另一项研究，其中评估了用皮辊破坏屏障后生物试剂和制剂的剂量对递送至真皮或浅表肌肉的功效。使用0.50mm微针的皮辊，通过将皮辊在皮肤区域上经过两次，对无毛大鼠的皮肤处理区域进行调理。包含BoNT/A的两种制剂，以每种制剂的两种不同剂量施用于所处理的皮肤区域。局部施用后，在第1-4天和第7天进行DAS读数，并确定每组的DAS得分最大均值。图4显示不同制剂的大鼠DAS得分的最大均值。DAS得分平均峰值表明，当剂量、针长和辊的经过次数保持不变时，不同制剂可以以不同效率递送BoNT/A。不考虑制剂，局部施用的剂量增加有助于将BoNT/A更有效地递送到TA肌肉。

实施例5中描述了另一项研究，其中评估了两种不同的皮辊对生物试剂递送的影响。皮辊各自具有0.5mm针，一种辊有更高的针密度——540针(“DRS”辊)而另一种有200针(“MTS”辊)。针的形状也不同，一种辊有更扁平的、刀片状外观的针，另一种有圆柱的、锥形针。用其中一种皮辊，通过将皮辊在皮肤区域内经过两次，或将MTX辊在皮肤区域内经过三次、四次和五次，对无毛大鼠的皮肤处理区域进行调理。将包含BoNT/A的制剂施用于所处理的皮肤区域。局部施用后，进行DAS读数，确定每组的DAS得分最大均值。图5显示不同辊处理的大鼠DAS得分的最大均值。数据表明，具有不同物理设计的皮辊可用于递送分子量大于150,000道尔顿(150kDa)的蛋白质生物试剂。

图6示出另一项研究的结果，该研究表明使用本文记载的方法将分子量为150,000道尔顿和900,000道尔顿的生物试剂递送到浅表肌肉。用皮辊对大鼠的皮肤区域进行调理(实施例6)，并且在调理后，施用含生物试剂的外用制剂。用DAS试验评价生物试剂——肉毒杆菌毒素——到肌肉的功能性递送。图6中的数据表明，通过将真皮屏障破坏与局部施用相结合，900kDa BoNT/A复合体可以如150kDa BoNT/A分子一样有效地递送。考虑到与纯化的150kDa BoNT/A相比实质上增大的尺寸的BoNT/A复合体，这是一项令人惊讶的结果。

在另一项使用无毛大鼠的研究中，评估了用胶带剥离处理皮肤并且将生物试剂递送至真皮或下面的浅表肌肉。如实施例7所述，使皮肤经胶带剥离以破坏角质层，从而有利于将功能性BoNT/A递送至下面的肌肉。在进行或不进行胶带剥离的预处理后，将BoNT/A逐滴施用于TA肌肉上方的皮肤区域。局部施用后，将所处理的皮肤和下面的肌肉收集并加工用于通过免疫组织化学进行SNAP25

图1-7中的数据表明，通过处理或调理皮肤以破坏角质层并施用含有生物试剂的制剂来实现将生物试剂递送至真皮和/或浅表肌肉。这些数据是利用人尸体皮肤和无毛大鼠皮肤作为人皮肤模型而产生的。无毛大鼠皮肤的皮肤厚度大于典型大鼠皮肤。在无毛大鼠中，腿部皮肤表面至肉膜为约1.2mm。在人类中，从人的面部皮肤表面到皮肤脂肪的距离为约2-3mm。对阳性DAS反应的本申请研究的观察表明，屏障破坏有利于毒素穿过无毛大鼠腿部皮肤递送至TA肌肉，距离为大于～1.2mm(该区域的大鼠皮肤厚度)。因此，屏障破坏可以促进毒素递送至离皮肤表面2-3mm的人面部肌肉。肉毒杆菌神经毒素在组织中扩散和蔓延。扩散和蔓延的程度基于几个因素，包括剂量和体积。基于本文中的数据，生物试剂如BoNT/A能够从表皮下方向下面的肌肉扩散0.5cm。

如上所述，并且基于图1-7中的数据，考虑将生物试剂递送至真皮或浅表肌肉的方法，其通过调理或处理皮肤区域并且将含有生物试剂的制剂局部施用于所处理的或所调理的皮肤区域来进行。在一个方面，考虑将该方法用于处理皮肤病况，如细纹和/或皱纹。所述细纹和/或皱纹可以是外眼角纹(眼角鱼尾纹)、眉间纹(眉毛之间的垂直纹)、额头纹、颈阔肌纹(颈纹)、鼻唇纹(“微笑纹”或“笑纹)或口周唇纹(嘴和嘴唇周围)。实施例8提供了实例，其中对人受试者进行处理以改善由于老化引起的细纹。

在其他方面，考虑本文记载的方法用于改善皮肤质量。人皮肤的病况或质量不断受到各种因素的影响，包括例如湿度、紫外线、化妆品、老化、疾病、压力、吸烟和饮食习惯，其中每一种因素都可导致各种皮肤变化。皮肤上出现了具有老化特征的变化，其中许多变化在通过皮肤结构的变化反映。皮肤老化的一些临床迹象包括出现细纹和深的皱纹，其中每一种都可随着年龄而增加。皱纹可由皮肤随时间的老化和由于皮肤暴露于阳光的皮肤的光老化而导致。如本文所考虑的用于改善皮肤质量的方法包括对于与自然老化或上述各种因素相关的皮肤变化的逆转、减缓其发展，或者预防。例如，改善皮肤质量包括对于与阳光损害或光老化有关的皮肤变化——即与暴露于阳光或其他形式的光辐射(例如紫外线辐射和晒黑室)有关的皮肤变化——的逆转、减缓其发展，或预防。作为另一个实例，改善皮肤质量还可以包括对于由外部因素(包括但不限于辐射、空气污染、风、冷、湿、热、化学物质、烟雾、吸烟及其组合)引起的皮肤变化的逆转、减缓其发展，或预防。改善皮肤质量还可以包括对于由于某些皮肤病况(例如痤疮)、感染(例如利什曼病(leishmaniasis))或伤害(例如擦伤、刺穿、撕裂或手术伤口)所造成的疤痕的逆转、预防或减少。改善皮肤质量包括使以上讨论的一种或多种皮肤变化减少、减小和/或最小化。改善皮肤质量可使皮肤具有更年轻的外观。改善皮肤质量可使皮肤更光滑、含水(即较不干燥)、甚至较少出现色素或鳞状化。

关于本文描述的用于改善皮肤质量、用于处理局部皮肤病况或用于递送生物试剂的方法，所考虑的用于治疗的皮肤可包括面部皮肤，颈部、手、手臂、腿或躯干的皮肤以及其他身体区域的皮肤。待处理或改善的皮肤病况包括例如皱纹(包括但不限于人面部皱纹)、皮肤纹加深、皮肤变薄、疤痕减少、皮肤变黄、斑点、色素沉着过度、色素型和/或非色素型老年斑的出现、皮似、弹性丧失、回缩力丧失、胶原纤维丧失、弹性纤维异常变化、真皮小血管恶化、蜘蛛静脉形成及其组合。

在其他实施方案中，改善皮肤质量的方法包括改善皮肤松弛、油性皮肤、皮脂或毛孔增大中的一个或多个。在又一些其他实施方案中，所述方法是通过处理皮肤的色素沉着过度来改善皮肤质量。

实施例9-11描述了使用本文所考虑的方法来处理人受试者以改善皮肤质量的实例。在实施例9中，对于人类女性进行以下处理：用透明质酸微针擦洗剂进行微皮肤擦破并且将肉毒杆菌毒素局部施用于所处理的皮肤区域，以改善皮肤质量，包括使皱纹最小化和改善皮肤松弛。在实施例10中，用皮辊和BoNT/A的液体制剂处理男性人类，以通过降低油性、皮脂和毛孔大小来改善皮肤质量。在实施例11中，对于男性人类进行以下处理：用透明质酸微针擦洗剂进行微皮肤擦破并且将肉毒杆菌毒素局部施用于所治疗的皮肤区域，以通过降低油性、皮脂和毛孔大小来改善皮肤质量。

从所记载的实施例中可以看出，本文的方法包括对皮肤区域进行化学或机械处理或化学和机械处理的组合。在一个实施方案中，所述处理包括含透明质酸的制剂，其中一部分透明质酸为结晶形式或微针形式。在另一个实施方案中，所述处理是微针装置，如皮辊。在一个实施方案中，所述微针装置具有多个微突起，这些微突起具有与角质层接触的扁平的刀片状边缘。在另一个实施方案中，所述微针装置具有多个微突起，这些微突起具有终止于与角质层接触的尖端的锥形轴。在一个实施方案中，皮肤区域通过使微针装置经过皮肤区域一次来处理。在另一个实施方案中，皮肤区域通过使微针装置经过皮肤区域超过一次来处理。

在又一个实施方案中，所述处理是胶带剥离。在一个实施方案中，所述胶带剥离包括施用和去除胶带条至少两次。在另一个实施方案中，所述胶带剥离包括施用和去除胶带条2-20次或3-12次。

在一个实施方案中，所述化学和/或机械处理是按顺序或同时进行的。在另一个实施方案中，所述化学和/或机械处理以及施用含有生物试剂的制剂是按顺序或同时进行的。

本文记载的方法中所考虑的生物试剂的分子量可大于10kDa、25kDa、50kDa、75kDa、100kDa、125kDa、150kDa、175kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1,000kDa、1,500kDa、1,600kDa、2,000kDa、2,200kDa、2,500kDa或3,000kDa。本文记载的方法中所考虑的生物试剂的分子量可大于10kDa、25kDa、50kDa、75kDa、100kDa、125kDa、150kDa、175kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、500kDa且小于约3000kDa、2500kDa、2200kDa、2000kDa、1600kDa、1500kDa或1000kDa。

在一个实施方案中，所述生物试剂是梭菌衍生物，如肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，如BoNT/A、BoNT/B等。这些毒素通过阻断神经分泌物质(如神经递质)的释放而作用于神经系统。BoNT的作用是由它与细胞表面的受体分子结合而启动的，然后毒素受体复合体经历内吞作用。一旦进入细胞内，BoNT使负责神经递质对接的胞吐特异性蛋白裂解，并使其从细胞中释放出，这种蛋白称为SNARE蛋白(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体)。由此产生的暂时的化学去神经法已在医学上用于阻断神经肌肉接点处的运动神经传递，从而产生了各种治疗应用。

在一些实施方案中，所述梭菌衍生物包括天然的重组梭菌毒素、重组经修饰的毒素、其片段、TEM或它们的组合。在一些实施方案中，所述梭菌衍生物是肉毒杆菌毒素。在一些实施方案中，所述肉毒杆菌毒素可以是A型、B型、C

在一些实施方案中，所述肉毒杆菌神经毒素可以是经修饰的神经毒素，即与天然毒素相比，至少有一个氨基酸缺失、改变或替代的肉毒杆菌神经毒素，或者经修饰的肉毒杆菌神经毒素可以是以重组方式产生的肉毒杆菌神经毒素或其衍生物或片段。在某些实施方案中，所述经修饰的毒素对目标神经元细胞或非神经元细胞的细胞靶向能力发生改变。这种能力改变是通过将肉毒杆菌毒素中天然存在的靶向结构域替换为针对存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞中的非肉毒杆菌毒素受体显示出选择性结合活性的靶向结构域来实现的。这种对靶向结构域的修饰产生了经修饰的毒素，其能够与存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞上的非肉毒杆菌毒素受体(靶受体)进行选择性地结合(重新靶向)。对非肉毒杆菌毒素靶细胞具有靶向活性的经修饰的肉毒杆菌毒素可以与存在于非肉毒杆菌毒素靶细胞上的受体结合，易位到细胞质中，并对靶细胞的SNARE复合体发挥其蛋白水解作用。本质上，包含酶结构域的肉毒杆菌毒素轻链通过选择合适的靶向结构域，在细胞内被递送到任何所需的细胞。

根据本方法使用的梭菌衍生物(如肉毒杆菌毒素)可在真空压力下以冻干的、真空干燥的形式储存在容器中或作为稳定的液体。在冻干前，肉毒杆菌毒素可与药学上可接受的赋形剂、稳定剂和/或载体(如白蛋白等)组合。可接受的赋形剂或稳定剂包括蛋白质赋形剂(如白蛋白或明胶等)或非蛋白赋形剂(包括泊洛沙姆(poloxamer)、糖类、聚乙二醇等)。在含有白蛋白的实施方案中，白蛋白可以是例如人血清白蛋白或重组白蛋白等。冻干材料可用适当的液体(例如生理盐水、水等)复水，以产生待给予患者的含有肉毒杆菌毒素的溶液或组合物。

在一些实施方案中，所述梭菌衍生物以包含包封梭菌衍生物的聚合物基质的控释系统(controlled release system)提供，其中在一段长的时段内以受控方式将一部分的量的梭菌衍生物从聚合物基质中释放。控释神经毒素系统已公开于美国专利6,585,993、6,585,993、6,306,423和6,312,708中，其中每一篇均以引用的方式全文纳入本说明书。

在替代实施方案中，将所述梭菌衍生物以适合局部给药的软膏、凝胶、霜或乳液提供。

根据本方法所给予的梭菌衍生物(例如肉毒杆菌毒素)的治疗有效量，可根据毒素的效力和正在治疗的疼痛的特定特征(包括其严重程度)和其他的多种患者变量(包括大小、体重、年龄和对治疗的反应程度)而变化。将毒素的效力表示为小鼠LD

肉毒杆菌毒素的治疗有效量可以根据特定的肉毒杆菌毒素的效力而变化，因为市售的肉毒杆菌毒素制剂没有同等的效力单位。据报告，一个单位的

在人类治疗应用中使用的剂量可以变化。通常，给予患者的梭菌衍生物的剂量可从约0.01个单位增加到约1000个单位；例如，最高达约500个单位，优选每位患者每次治疗在约80个单位至约460个单位的范围内，尽管在适当情况下可以给予更小或更大的剂量。

在一些实施方案中，本申请方法包括将包含约1-500个单位的A型肉毒杆菌毒素(如

以下非限制性实施例为本领域普通技术人员提供了在本申请方法的实施方案的范围内的具体的优选方法，并且不意欲限制其范围。

实施例1

透明质酸擦洗剂处理对150kDa生物试剂的皮肤渗透性的影响

将冷冻的人尸体皮肤样本在室温(22-25℃)下完全解冻，用水简单冲洗，平放在硬板上的湿纸巾上，用两个PBS湿棉签清洁，并用棉签擦干。在皮肤上均匀施用透明质酸擦洗剂(MITI Systems，Korea)(～30mg/～2x2cm

施用FITC-IgG(100μL的200μg/0.5mL溶液)以覆盖所处理的区域(～4cm

实施例2

皮辊处理对150kDa生物试剂的皮肤渗透性的影响

将人尸体皮肤样本在室温(22-25℃)下完全解冻，用水简单冲洗，平放在硬板上的湿纸巾上。按照供应商提供的指南使用正常压力用微针装置

实施例3

皮辊处理对功能性肉毒杆菌毒素的皮肤渗透性的影响

用针长为0.25mm、0.50mm或1.0mm的微针装置(

还进行了在单一皮辊处理)后和在BoNT/A局部处理后的SNAP25

实施例4

在用皮辊进行微穿孔后的皮肤中，制剂对于功能性肉毒杆菌神经毒素的皮肤渗透性的影响

用大鼠DAS模型作为BoNT/A的功能性经皮递送的读出，用微针装置对无毛大鼠进行预处理以递送150kDa BoNT/A穿过皮肤。使用微针装置(具有0.50mm针的

实施例5

分析皮辊的递送功效

对两种不同的微针装置进行头对头(head-to-head)评估，以评价将BoNT/A递送穿过皮肤的潜在差异。通过用DRS50皮辊系统辊滚过皮肤区域两次，或用MTS MR5辊滚过皮肤区域2-5次，比较DRS50皮辊系统装置(0.5mm针长，540针；中国)和MTS MR5辊(0.5mm针长，200针；Clinical Resolution Laboratories公司)。考虑到DRS50辊具有多于两倍的针数，该实验目的是确定是否会需要增加滚过数或经过数以实现与MR5辊相当的渗透性。还应注意的是，这两种辊类型之间的针的形状也不同。DRS50辊的针具有更扁平的、刀片状外观，而MR5辊的针则具有更典型的圆柱的、锥形的针形状。结果如图5所示。

实施例6

功能性肉毒杆菌神经毒素复合体(900kDa)在用皮辊微穿孔后的皮肤中的有效递送

使用大鼠DAS模型作为功能性经皮递送BoNT/A的读出，将无毛大鼠用皮辊预处理，以递送150kDa BoNT/A(n＝3)或900kDa BoNT/A复合体(n＝6)穿过皮肤。在施用局部测试物品之前，用MTS MR5辊(0.5-mm针长；Clinical Resolution Laboratories公司)在TA肌肉上经过五次。150kDa BoNT/A和900kDa BoNT/A复合体都是以同样的方式配制的，并且在用皮辊调理皮肤后，将剂量施用于大鼠。含有150kDa BoNT/A的制剂的浓度为10ng/mL，施用50μL至剂量为0.5ng的BoNT/A。含有900kDa BoNT/A的制剂的浓度为65ng/mL，施用50μL至剂量为3.25ng的BoNT/A。在以质量计的施用剂量差异是显著的，然而以摩尔计的剂量是相似的。从摩尔角度来看，900kDa复合体的剂量略多。将每种测试剂以50μL总体积进行施用，这通过将其逐滴施用于TA肌肉上方的皮肤上并且在每一滴之后进行摩擦来实施的。在局部施用后，在第1-4天和第7天进行DAS读数，并绘制每组的DAS得分最大均值。按照上文和其他处所记载的进行DAS试验，并评分(Broide，R.S.等人，Toxicon，71∶18-24(2013))。结果如图6所示。

实施例7

胶带剥离对功能性肉毒杆菌神经毒素的皮肤渗透性的影响

用胶带剥离对无毛大鼠进行处理以破坏角质层，来促进功能性BoNT/A从皮肤表面递送到下面的肌肉。对大鼠进行几次胶带剥离，而对照组不接受胶带剥离。在用或不用胶带剥离进行预处理后，将50μL 7000U/mL(共350U)的150kDa BoNT/A逐滴施用于TA肌肉上方的皮肤区域。使用皮内注射10U/kg 150kDa BoNT/A作为阳性对照。局部施用后，收集所处理的TA肌肉，并对其进行加工用于通过如上文记载的免疫组织化学的SNAP25

实施例8

使用皮辊破坏屏障，并局部施用BONT以改善细纹和松弛度

一名II光型皮肤的45岁女性希望使光老化的面部皮肤的迹象——包括细纹和松弛度——最小化。因为相关的停机时间，她拒绝分段式激光处理以改善她的皮肤质量。相反，她要求使用基于肉毒杆菌神经毒素的产品(例如BoNT/A)进行局部处理。在处理前，在皮肤上施用局部麻醉霜(2.5％利多卡因和2.5％丙胺卡因)30分钟，然后处理，随后用无菌擦将其完全去除。

然后将面部的约20cm

在基线处和处理后12周进行评估。与基线相比，在处理后12周，她的面部皮肤具有医生更高的整体评估和受试者更高的满意度得分，同时在粗糙度、含水量、皮肤弹性和经表皮水分流失(TEWL)方面都有显著改善。

实施例9

用研磨擦洗剂破坏屏障并且局部施用以改善细纹和松弛度

一名II光型皮肤的45岁女性希望使光老化的面部皮肤的迹象——包括细纹和松弛度——最小化。因为相关的停机时间，她拒绝进行分段式激光处理来改善她的皮肤质量。相反，她要求使用基于肉毒杆菌神经毒素的产品(例如BoNT/A)进行局部处理。在处理前，将皮肤用无菌擦清洁。

通过用透明质酸微针(HA微晶)擦洗剂进行微皮肤擦破，以事先准备好面部约20cm

在基线处和处理后12周进行评估。与基线相比，在处理后12周，她的面部皮肤具有医生更高的整体评估和受试者更高的满意度得分，同时在粗糙度、含水量、皮肤弹性和经表皮水分流失(TEWL)方面都有显著改善。

实施例10

使用微皮辊破坏屏障，然后局部施用BoNT/A以减少油性、皮脂和毛孔大小

一名III光型皮肤的35岁男性的额头油性(皮脂溢)，接受BoNT/A局部处理。

在处理前，在皮肤上施用局部麻醉霜(2.5％利多卡因和2.5％丙胺卡因)30分钟，然后处理，随后用无菌擦完全去除。将面部的约20cm

在基线处和处理后12周进行评估，并用皮脂仪测量皮脂量。与基线相比，在处理后12周，他的额头具有医生的更高的整体评估，并且据患者报告，他对结果感到满意，油性、皮脂和毛孔大小显著降低，皮脂降低的百分比(％)用皮脂仪测量。

实施例11

使用透明质酸微针擦洗剂破坏屏障，然后局部施用BoNT/A以减少油性、皮脂和毛孔大小

一名III光型皮肤的35岁男性的额头油性(皮脂溢)，接受BoNT/A局部处理。

在处理前，用无菌擦清洁皮肤。然后通过用透明质酸微针(HA微晶)擦洗剂进行微皮肤擦破，以事先准备好面部的约20cm

在基线处和处理后12周进行评估，并用皮脂仪测量皮脂量。与基线相比，在处理后12周，他的额头具有医生的更高的整体评估，并且据患者报告，他对结果感到满意，油性、皮脂和毛孔大小显著降低，皮脂降低的百分比(％)用皮脂仪测量。

在不脱离本公开内容的主旨和范围的情况下，本领域普通技术人员可以做出许多改变和修改。因此，必须理解，所述的实施方案仅出于示例的目的而列出，并且不应将这些实施方案视为对以下权利要求书范围的限制。因此，以下权利要求应视为不仅包括从字面上阐述的要素的组合，而且还包括用于以基本上相同的方式进行基本上相同的功能以获得基本上相同的结果的所有等同要素。因此，权利要求书应理解为包括上文描述的内容，概念上等同的内容以及包含本公开内容的思想的内容。