一种簕草石方冻干粉及其在治疗乙肝中的应用

技术领域

本发明属于海洋中药领域，具体涉及一种簕草石方冻干粉及其在治疗乙肝中的应用。

背景技术

肝脏是维持人类健康的重要器官，在代谢食物、药物和内源性、外源性物质方面起着关键作用。代谢的压力和一些外源性物质使肝脏很容易受到疾病的侵扰，比如由HBV的侵入导致的乙型病毒性肝炎(乙肝)。HBV是一种包膜性嗜肝DNA病毒，包含部分双链病毒基因组，与病毒聚合酶和蛋白激酶一起包裹在核衣壳中，以RNA中间体为模板进行复制。近年来，疫苗接种计划和预防措施极大地降低了乙肝的发病率，但是由于新的感染不断发生，乙肝仍然是一个严重的公众健康问题，尤其是在东南亚和撒哈拉以南非洲等乙肝高发地带。因此，迫切需要开发一种治疗效果显著、毒副作用小的抗乙肝药。

申请人前期研究发现(中国专利申请号：201910227022.4、201910227021.X)一种簕草石方95％乙醇提取物和水提取物对肝损伤具有保护作用。为了扩展簕草石方在肝脏疾病中的治疗范围，本发明提供上述簕草石方水提取物冻干粉在治疗HBV感染中的应用。

技术内容

本发明提供一种簕草石方水提取物冻干粉，其特征在于所述簕草石方水提取物冻干粉由包括如下步骤的方法制备：

(1)按重量份计，将老鼠簕4-6份、排钱草1-3份、穿破石2-4份，粉碎混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水浸泡1-3h后，回流提取2-3h，过滤收集提取液；滤渣再用水回流提取1.5-2h；合并两次提取液，浓缩至浓度为1.0g/mL生药量；冷冻干燥，装瓶，密封，即得所述簕草石方水提取物冻干粉。

步骤(1)所述粉碎优选粉碎至20-100目；步骤(2)中第一次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的10倍，第二次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的8倍。上述簕草石方水提取物冻干粉的制备方法中，按重量份计，优选使用老鼠簕5份，排钱草2份，穿破石3份。

本发明的另一实施方案提供一种簕草石方水提取物冻干粉在制备预防和/或治疗由乙型肝炎病毒HBV感染引起的疾病的药物中的应用；所述簕草石方水提取物冻干粉由包括如下步骤的方法制备：

(1)按重量份计，将老鼠簕4-6份、排钱草1-3份、穿破石2-4份，粉碎混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水浸泡1-3h后，回流提取2-3h，过滤收集提取液；滤渣再用水回流提取1.5-2h；合并两次提取液，浓缩至浓度为1.0g/mL生药量；冷冻干燥，装瓶，密封，即得所述簕草石方水提取物冻干粉。

步骤(1)所述粉碎优选粉碎至20-100目；步骤(2)中第一次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的10倍，第二次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的8倍。上述簕草石方水提取物冻干粉的制备方法中，按重量份计，优选使用老鼠簕5份，排钱草2份，穿破石3份。

本发明的另一实施方案提供一种簕草石方水提取物在制备预防和/或治疗由乙型肝炎病毒HBV感染引起的疾病的药物中的应用；所述簕草石方水提取物由包括如下步骤的方法制备：

(1)按重量份计，将老鼠簕4-6份、排钱草1-3份、穿破石2-4份，粉碎混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水浸泡1-3h后，回流提取2-3h，过滤收集提取液；滤渣再用水回流提取1.5-2h；合并两次提取液，浓缩至浓度为1.0g/mL生药量；装瓶，密封，即得所述簕草石方水提取物。

步骤(1)所述粉碎优选粉碎至20-100目；步骤(2)中第一次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的10倍，第二次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的8倍。上述簕草石方水提取物的制备方法中，按重量份计，优选使用老鼠簕5份，排钱草2份，穿破石3份。

本发明提供上述簕草石方水提取物冻干粉、簕草石方水提取物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗乙肝药物中的应用，簕草石方水提取物冻干粉、簕草石方水提取物或其药学上可接受的盐优选使用的剂量浓度为50-400μg/mL。

本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物以上述簕草石方水提取物冻干粉、簕草石方水提取物或其药学上可接受的盐作为有效成分。该药物组合物还可包括其他用于治疗乙肝的药物。该药物组合物还可包括适量的药学上可接受的药用辅料(例如药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。该药物组合物的剂型可以是固体制剂、液体制剂或半固体制剂，优选片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、膏剂、散剂、口服液体制剂、滴丸剂或注射剂(含粉针剂)。

与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种簕草石方水提取物冻干粉，并成功扩展了簕草石方水提取物的应用范围，簕草石方水提取物不仅可以用于治疗急性肝损伤，而且对于HBV感染引起的疾病具有显著疗效，在鸭乙肝病毒模型实验中，能显著降低鸭血清中乙肝病毒抗原并降低转氨酶及HBV-DNA含量，改善肝脏细胞坏死，细胞浸润及空泡样变性等病理状况；在HepG2.2.15细胞模型实验中，簕草石方能够显著抑制乙肝病毒抗原的表达；(2)本发明不仅对簕草石方水提取物冻干粉的疗效进行了体内、体外评价，而且对其安全性进行了评价，簕草石方水提取物冻干粉在6.25至400μg/mL浓度下，对HepG2.2.15细胞活力基本无影响，有望开发成为用于治疗乙肝的海洋中药。

附图说明

图1是簕草石方水提取物冻干粉A的HPLC化学指纹图谱；色谱条件：测定仪器：Waters 1525；色谱柱：YMC HPLC Column-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇(A)，0.1％磷酸水溶液(B)；梯度洗脱(A％)：0-5min(5-5)，5-10min(5-20)，10-40min(20-40)，40-55min(40-50)，55-58min(50-100)，58-70min(100-100)；流量：1.0mL/min；柱温25℃；进样量20μL；检测器：Waters 2996；紫外检测波长λ＝260nm。

图2是各组实验鸭肝组织病理切片图(200×)；注：A正常对照组；B模型组；C阳性药对照组；D高剂量组；E中剂量组；F低剂量组。

具体实施方式

实施例1

配方：老鼠簕50g、排钱草20g、穿破石30g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料(100g)，用水(1000g)浸泡1h后，回流提取2h，过滤收集提取液；滤渣再用水(800g)回流提取1.5h；合并两次提取液，浓缩至浓度为1.0g/mL生药量；冷冻干燥，装瓶，密封，即得所述簕草石方水提取物冻干粉(以下简称簕草石方冻干粉A，其HPLC化学指纹图谱见图1)。

实施例2

配方：老鼠簕50g、排钱草20g、穿破石30g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料(100g)，用水(1000g)浸泡3h后，回流提取3h，过滤收集提取液；滤渣再用水(800g)回流提取2h；合并两次提取液，浓缩至浓度为1.0g/mL生药量；冷冻干燥，装瓶，密封，即得所述簕草石方水提取物冻干粉(以下简称簕草石方冻干粉B)。

实施例3

配方：老鼠簕40g、排钱草10g、穿破石20g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料(100g)，用水(1000g)浸泡1h后，回流提取3h，过滤收集提取液；滤渣再用水(800g)回流提取2h；合并两次提取液，浓缩至浓度为1.0g/mL生药量；冷冻干燥，装瓶，密封，即得所述簕草石方水提取物冻干粉(以下简称簕草石方冻干粉C)。

实施例4

配方：老鼠簕60g、排钱草30g、穿破石40g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料(100g)，用水(1000g)浸泡1h后，回流提取3h，过滤收集提取液；滤渣再用水(800g)回流提取2h；合并两次提取液，浓缩至浓度为1.0g/mL生药量；冷冻干燥，装瓶，密封，即得所述簕草石方水提取物冻干粉(以下简称簕草石方冻干粉D)。

实施例5体内抗乙肝实验

1材料与仪器

1.1受试物及药品

簕草石方冻干粉A-D；拉米夫定(3TC)(湖南千金湘江药业股份有限公司)；乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)；乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)；鸭乙型肝炎病毒荧光定量PCR试剂盒(联迈生物工程有限公司)；鸭天门冬氨酸转氨酶(AST)酶联免疫试剂盒(上海樊克生物科技有限公司)；鸭丙氨酸转氨酶(ALT)酶联免疫试剂盒(上海樊克生物科技有限公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；苏木精-伊红(H&E)染液(武汉塞维尔生物科技有限公司)；分化液(武汉塞维尔生物科技有限公司)；返蓝液(武汉塞维尔生物科技有限公司)；中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2动物

1日龄广西桂林五通麻鸭，购自广西桂林林贵区两江市场。自由进食水，在环境温度23-27℃，12h光照周期的动物室内饲养。适应性喂养3d后开始从颈静脉采血，用荧光定量PCR法筛选先天感染鸭乙型病毒肝炎(DHBV)的鸭。

1.3仪器

Multiskan Spectrum酶标仪(美国Thermo公司)；TGL-18M高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)；脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；冻台(武汉俊杰电子有限公司)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；正置光学显微镜(日本尼康公司)；成像系统(日本尼康公司)。

2方法

2.1体内抗乙肝实验

2.1.1动物分组及处理

将筛选出的先天感染DHBV的鸭随机分为5组(n＝10)：簕草石方冻干粉A低、中、高剂量组，阳性药对照组(3TC)和模型组。另外随机选择10只未感染DHBV病毒的鸭作为正常对照组。簕草石方冻干粉A低、中、高剂量组分别按3g/kg、6g/kg、12g/kg(生药/体重)给药(1mL/kg)，阳性对照组按0.2g/kg3TC给药(1mL/kg)，模型组和正常对照组分别灌胃1mL/kg生理盐水。连续给药3周。

在给药前(T

2.1.2血清生化指标测定

取血清，按照试剂盒的方法分别测定鸭乙肝病毒表面抗原(DHBsAg)和鸭乙肝病毒e抗原(DHBeAg)的含量；鸭乙肝病毒DNA(DHBV-DNA)的复制量；天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性。

2.1.3肝脏组织病理学观察

取鸭肝右叶固定部位组织块，采用甲醛固定液固定鸭肝组织切片48h，在酒精脱水之后用石蜡处理包埋切片，采用H&E染液染色，用显微镜观察肝组织结构及其变化。

2.2统计学分析

采用SPSS 22.0统计分析软件进行t-检验，实验数据以平均值±标准差

3结果

3.1簕草石方冻干粉A-D对DHBsAg和DHBeAg表达的抑制作用

与模型组相比，簕草石方冻干粉A在测试时间点T

表1簕草石方冻干粉A对DHBsAg表达的抑制作用(OD值，

注：冻干粉A高、中、低剂量组剂量单位为g生药/kg/d；与正常对照组相比，显著性差异

表2簕草石方冻干粉A对DHBeAg表达的抑制作用(OD值，

注：冻干粉A高、中、低剂量组剂量单位为g生药/kg/d；与正常对照组相比，显著性差异

3.2簕草石方冻干粉A-D对DHBV-DNA复制的抑制作用

与模型组相比，簕草石方冻干粉A中剂量组对DHBV-DNA的复制有抑制作用，在T

表3簕草石方冻干粉A对DHBV-DNA复制的抑制作用(HBV-DNA拷贝数log值，

注：冻干粉A高、中、低剂量组剂量单位为g生药/kg/d；与正常对照组相比，显著性差异

3.3簕草石方冻干粉A-D对AST和ALT的抑制作用

模型组鸭血清中天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)活性明显高于正常对照组(表4和5)，表明模型组的鸭具有严重的肝损伤。与模型组相比，簕草石方冻干粉A组对AST具有显著的抑制作用。簕草石方冻干粉A中剂量组在药物处理第21d(T

表4簕草石方冻干粉A对AST的抑制作用(U/L，

注：冻干粉A高、中、低剂量组剂量单位为g生药/kg/d；与正常对照组相比，显著性差异

表5簕草石方冻干粉A对ALT的抑制作用(U/L，

注：冻干粉A高、中、低剂量组剂量单位为g生药/kg/d；与正常对照组相比，显著性差异

3.4组织病理切片图，见图2。

与模型组相比，簕草石方冻干粉A能够很好的改善鸭肝脏组织的损伤，表现为降低肝细胞病灶性坏死、炎性浸润和空泡性变样严重程度。簕草石方冻干粉B-D的组织病理切片图与簕草石方冻干粉A的组织病理切片图基本一致。

4讨论

本次实验表明簕草石方冻干粉A-D对乙肝疾病具有治疗作用，可明显抑制鸭血清乙肝病毒抗原DHBsAg和DHBeAg的表达，降低氨基转氨酶AST和ALT的活性，抑制DHBV-DNA的复制，并改善肝脏细胞病灶性坏死、炎性浸润和空泡性变样等病理状态。

实施例6体外抗乙肝实验

1材料与仪器

1.1受试物及药品

簕草石方冻干粉A-D；替诺福韦(TDF)(上海源叶生物科技有限公司)；DMEM细胞培养液(北京索莱宝科技有限公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，青霉素-链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)(北京索莱宝科技有限公司)，噻唑蓝(MTT)(赛国生物科技有限责任公司)，乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司)，乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR-荧光探针法)(中山大学达安基因股份有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)(德国Sigma公司)。

1.2细胞株

HepG2.2.15细胞株由北京大学医学院第一附属医院病毒研究所提供。细胞在含有100mL/L磷酸盐缓冲液(PBS)，100IU/mL青霉素和0.1μg/mL链霉素的DMEM细胞培养液中培养，培养条件为温度37℃，5％的CO

1.3仪器

DNP-9272恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，XSP-C204显微镜(CIC公司)，超净工作台(天津市尘埃净化设备厂)，酶联免疫检测仪(BioTek)，荧光定量PCR仪(基因有限公司)，Sunrise酶标仪(奥地利Tecan公司)，TGL-18M高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)，细胞培养瓶(美国Corning公司)，96孔板(美国Corning公司)，移液枪(大龙兴创实验仪器有限公司)。

2.方法

2.1体外抗乙肝实验

2.1.1细胞分组及处理

将簕草石方冻干粉A及替诺福韦(TDF)分别溶于0.1％二甲基亚砜(DMSO)中，加入DMEM细胞培养液混匀。首先分别配制成4mg/mL浓度的溶液，再用DMEM细胞培养液按梯度稀释法稀释成2mg/mL、1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL和62.5μg/mL 6个浓度梯度。

将HepG2.2.15细胞以1×10

2.1.2HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量测定

在第3、6和9d收集细胞培养的上清液，检测乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)和乙肝病毒DNA(HBV-DNA)的含量。HBsAg和HBeAg含量测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法，按照HBsAg、HBeAg试剂盒说明书逐条进行操作。HBV-DNA含量的测定采用PCR-荧光探针法，根据乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒说明书步骤操作。

2.1.3细胞毒性检测

采用MTT方法对簕草石方冻干粉A对HepG2.2.15细胞的细胞毒性进行评价。在含有HepG2.2.15细胞的96孔板中每孔中加入100μL的DMEM细胞培养液和20μL的噻唑蓝(MTT)，持续细胞培养4h；去除上清，加入DMSO溶解MTT形成的紫色甲臜。与此同时，设立仅有培养液的空白对照组以消除溶剂效应。用酶标仪在490nm处读取吸光度OD值，细胞生长抑制率计算公式如下：

细胞生长抑制率(％)＝(OD

2.2统计学分析

采用SPSS 22.0统计分析软件进行t-检验，实验数据以平均值±标准差

3结果

3.1簕草石方冻干粉A-D对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用

实验结果显示，阴性对照组乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)水平持续增长。簕草石方冻干粉A组在第3、6、9d对以上两个抗原均具有很强的抑制作用。总的来看，簕草石方冻干粉A对HBsAg抑制作用呈现剂量依赖性，尤其是在第9d(表6)。与阴性对照组相比，冻干粉A对HBeAg的抑制作用较阳性药替诺福韦(TDF)较好，尤其是浓度在50到200μg/mL的高浓度组(表7)。在第9d，200μg/mL的冻干粉A对HBeAg显示了最强的抑制作用。簕草石方冻干粉B-D显示出对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用，与簕草石方冻干粉A具有相同趋势。

表6簕草石方冻干粉A对HepG2.2.15细胞HBsAg表达的影响(OD值，

注：与阴性对照组比较，**P<0.01,*P<0.05；“-”未加药。

表7簕草石方冻干粉A干燥粉末对HepG2.2.15细胞HBeAg表达的影响(OD值，

注：与阴性对照组比较，**P<0.01,*P<0.05；“-”未加药。

3.2簕草石方冻干粉A-D对HepG2.2.15的细胞毒性

采用MTT法检测簕草石方对HepG2.2.15细胞活力的影响，结果显示簕草石方冻干粉A在浓度梯度为6.25至400μg/mL时，对HepG2.2.15细胞活力基本无影响，细胞活力在94.75±3.21至104.93±12.47％之间。表明簕草石方冻干粉A在6.25至400μg/mL时可保持较高的细胞活力并与正常对照组相当，表明簕草石方对HepG2.2.15细胞无细胞毒性，详见表8。簕草石方冻干粉B-D同样对HepG2.2.15细胞无细胞毒性。

表8簕草石方冻干粉A对HepG2.2.15细胞的毒性作用(

注：与阴性对照组比较，**P<0.01,*P<0.05；“-”未加药。

4.讨论

本次实验表明簕草石方冻干粉A-D在HepG2.2.15细胞水平上能够显著抑制HBeAg和HBsAg的表达且对HepG2.2.15细胞无细胞毒性。