一种小鼠ACE2基因真核表达质粒pVAX1-ACE2的构建

技术领域

本发明属于分子克隆技术领域，具体涉及一种小鼠ACE2(Angiotensinconverting enzyme 2)基因的克隆，真核载体的连接及过表达载体在乳腺上皮细胞中的验证。

背景技术

血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是2000年发现的一种多效单羧肽酶，从2000年至今的研究已证实：ACE2在体内广泛分布，主要分布在心脏、肾脏、睾丸、肺、肝脏、消化道、脑等器官组织，并且证实其介导的ACE2-Ang1-7-Mas通路在正常的心脏、肝脏、肾脏等组织中表达量较低，更多地参与了许多特殊生理或病理情况下的调节，不仅在高血压和心血管疾病方面发挥着重要作用，还参与了肝、肾、肺、肠道等局部组织的抗炎症、抗氧化应激、抗纤维化等的损伤和抗损伤过程。

研究中，常添加ACE2活性蛋白来治疗肠道炎症和乳腺炎症，但活性蛋白价格过高，制备过程较为复杂，故研究人员一般通过构建重组质粒来达到过量表达ACE2的作用，一般选用真核载体pcDNA3.1，本研究中选用真核载体pVAX1。pVAX1是在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的一种新型真核表达载体，大小为3.0kb。该质粒用卡那霉素抗性筛选基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性筛选基因，最大程度地减少抗性筛选基因和小鼠基因组发生重组的可能性。pVAX1含有多个克隆酶切位点允许同时克隆多个大片段的目的基因，强启动子pCMV和BGH poly A信号可以在哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白。

在本发明研究中，根据NCBI公布的小鼠ACE2序列(NM_001130513.1)，通过PCR扩增得到了小鼠的ACE2基因，利用真核表达系统表达了pVAX1-ACE2重组质粒，通过将重组质粒pVAX1-ACE2转入乳腺上皮细胞，通过Western blot技术检测ACE2蛋白表达量鉴定该重组质粒。本发明研究有望用于治疗小鼠乳腺炎症，为小鼠乳房炎的研究提供了基础资料。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是根据ACE2作为RAS系统的负调节分子，通过靶向降解AngII，发挥抗损伤、抗纤维化等机体保护功能；作为急性严重呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)主要功能性受体，具有保护肺损伤的功能；协同氨基酸转运载体转运，与氨基酸吸收不良、肠道微生态平衡和胃肠道炎症乳腺炎症中所发挥着关键作用，本研究通过构建过表达质粒pVAX1-ACE2来治疗乳腺炎症，不仅在经费上节约了成本，还为ACE2在小鼠乳房炎研究方面的研究提供基础资料。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种小鼠的ACE2克隆载体或过表达载体的制备方法，其包括以下步骤：

S1、选取小鼠肾脏组织，经生理盐水漂洗后迅速放入液氮速冻。提取组织RNA，使用随机引物将RNA反转录为cDNA。提取组织RNA，使用随机引物将RNA反转录为cDNA。设计ACE2的上下游引物用于ACE2全长基因扩增，并在ACE2基因片段两侧分别加入BamHI和Xho1两个酶切位点，以cDNA为模板，扩增获得ACE2基因全长，扩增条件为：95℃，3min→95℃，15s→66℃，15s→72℃，1min 50s→72℃，5min；35个循环。

S2、切胶纯化目的片段，PCR产物4℃保存，配制1％琼脂糖凝胶进行电泳验证，将目的条带用胶回收试剂盒进行回收。将获得的小鼠ACE2目的片段纯化产物和载体pVAX1在快切酶QuickCut BamH1和QuickCut Xho1共同作用下于37℃酶切30min，1％琼脂糖凝胶进行电泳验证。

如上所述的制备方法，优选地，还包括对酶切目的片段的回收，小鼠ACE2基因双酶切目的片段与pVAX1酶切片段的连接。连接体系(20uL)；2uL pVAX1-ACE2载体，8uL目的序列，10uL DNA Ligation连接酶，混匀后在PCR仪器上运行16℃，进行过夜连接，经转化、菌液PCR鉴定、酶切、测序验证获得重组质粒pVAX1-ACE2。

一种小鼠的ACE2重组质粒的制备方法，将上述小鼠的ACE2真核表达载体，转入小鼠乳腺上皮细胞中，经Western blot技术检测ACE2蛋白后，获得小鼠ACE2基因重组质粒pVAX1-ACE2。

如上所述的制备方法，将构建好的过表达载体pVAX1-ACE2菌液37℃，180r摇床中扩大培养6h进行质粒提取。将提取的质粒转入小鼠乳腺上皮细胞中，培养42h后收取细胞蛋白样品。BCA法测定蛋白浓度后，12％SDS-PAGE分离蛋白，电转移至PVDF膜，5％脱脂乳封闭2h，以1∶1000倍加入ACE2一抗，1∶10000倍β-actin一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，1∶10000倍稀释加入羊抗兔二抗，37℃孵育2h，TBST洗涤5次后用化学发光法检测。经过鉴定该重组质粒成功转入小鼠乳腺上皮细胞中，其在乳腺细胞中过量表达，此发明得到效果较好的重组质粒pVAX1-ACE2。

本发明的有益效果在于：极大程度上减少了成本的开支，且制备方法简单快捷，作用效果较好。

本发明是首次得到了小鼠ACE2真核重组质粒，不仅替代了ACE2活性蛋白，且为ACE2在乳腺细胞中的过量表达的研究提供了基础资料。

本发明中扩增得到的ACE2基因，目前ACE2的功能研究只要集中在以下三个方面：ACE2作为RAS系统的负调节分子，通过靶向降解AngII，发挥抗损伤、抗纤维化等机体保护功能；作为急性严重呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)主要功能性受体，具有保护肺损伤的功能；ACE2协同氨基酸转运载体转运，与氨基酸吸收不良、肠道微生态平衡和胃肠道炎症发挥重要作用。ACE2可能为小鼠乳腺疾病治疗提供新的思路，为畜牧业的可持续发展奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实例中利用RT-PCR方法扩增ACE2基因鉴定结果(2434bp)；其中，M：DNAMaker；泳道1：从小鼠肾脏组织通过RT-PCR扩增得到ACE2片段；

图2为阳性菌液PCR扩增ACE2基因产物结果图；其中，M：DNA Maker，注：泳道1-10：单克隆菌落pVAX1-ACE2；

图3为pVAX1-ACE2重组质粒双酶切鉴定结果图；其中，M：DNA Maker；泳道1：pVAX1-ACE2酶切产物；

图4为pVAX1-ACE2重组质粒测序结果图；

图5为重组质粒pVAX1-ACE2转染EpH4-Ev细胞后ACE2的表达结果图，其中，1：空质粒pVAX1；2：重组质粒pVAX1-ACE2；

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。

实施例1 ACE2基因的扩增，以及连接载体的构建

根据GenBank中的小鼠ACE2基因序列(NM_001130513.1)设计引物，上下游引物分别插入BamHI和Xho1酶切位点由南京擎科生物科技有限公司合成引物。将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系：cDNA模板2uL，反应条件：95℃，3min→95℃，15s→66℃，15s→72℃，1min 50s→72℃，5min；35个循环。PCR扩增结果如图1，有单一条带出现(见泳道1)，条带大小2500bp左右，与预期(2434bp)大小一致。

利用DNA胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，具体步骤参照DNA胶回收试剂盒试剂盒说明书进行。回收产物和pVAX1载体分别用BamHI和Xho1酶进行酶切，酶切后进行连接(16℃，过夜)，将连接产物转化至感受态细胞DH5α中。将菌体重悬涂布在LB固体培养基平板上，37℃培养16h。挑取培养皿上的单克隆接种于含有卡那的液体培养基中，培养过夜。利用质粒大型提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用BamHI和Xho1酶切(37℃，14h)进行验证，将鉴定的阳性质粒送南京擎科生物技术有限公司测序。菌落PCR验证结果如图2，2000-3000bp之间出现单一条带(泳道1-10)。PCR鉴定插入载体的片段大小与PCR扩增片段一致。提示阳性菌落中目的片段插入成功。酶切验证结果如图3所示：pVAX1-ACE2双酶切菌落重组质粒，在3000bp和2434bp左右出现明亮的目的条带，证明酶切成功。测序结果如图4所示：重组质粒核苷酸序列无突变，得到大小为2418bp的核苷酸序列，与设计引物大小一致，此结果证实已成功构建pVAX1-ACE2重组质粒。

实施例2 重组质粒pVAX1-ACE2转染乳腺上皮细胞

利用脂质体3000将重组质粒pVAX1-ACE2转染至乳腺上皮细胞中，脂质体转染48h后弃掉培养液，PBS洗涤2次后，每孔加入RIPA强裂解液70μL，冰上孵育5min，4℃ 12000g离心15min得到细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，12％SDS-PAGE分离蛋白，电转移至PVDF膜，5％脱脂乳封闭2h，以1∶1000倍加入ACE2一抗，1∶10000倍β-actin一抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后，1∶10000倍稀释加入羊抗兔二抗，37℃孵育2h，TBST洗涤5次后用化学发光法检测。

结果如图5所示，转染重组质粒pVAX1-ACE2相比于转染空质粒pVAX1组在97kDa处可见一显著性增加的条带，ACE2蛋白表达量极显著上升，证明pVAX1-ACE2真核表达载体成功转入乳腺上皮细胞EpH4-Ev，并在其细胞内过量表达。该结果也进一步证实了本实验所制备的小鼠重组质粒pVAX1-ACE2有良好的表达效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。