芸香草挥发油的功效成分及其应用

技术领域

本发明涉及芸香草挥发油的攻效成分及其应用，尤其涉及芸香草挥发油在抑制植物病原菌中的应用。

背景技术

我国食用菌在种植业中，仅次于粮，棉，油，果，菜，是第六大类产品，是农业和农村经济中的支柱产业和优势产业，但食用菌产业在生产中常常因为一些杂菌而造成产量下降，同时有些杂菌产生毒素而造成我国在进出口遭遇危机。在食用菌的试剂生成中常见的真菌类杂菌主要有：绿色木霉、链孢霉、毛霉、曲霉、黑根霉、酵母菌等。这些杂菌大部分生长快速，如果预防不及时会严重影响食用菌的品质。虽然现阶段化学合成的杀灭植物病原真菌药物在植物病害防治中起着不可代替的作用，但是，大家对农药毒性和农药对环境的污染问题越来越重视，一些毒性高，残留长的杀菌剂品种，如有机氯汞制剂(艾氏剂、六六六)等相继禁用。从植物中寻找新的无毒、无污染、可持续利用的生物源杀菌剂已成为现代农药研究开发的一个热点。

植物源杀菌剂是指利用植物及其代谢产物来防治植物病原真菌。目前，该类型杀菌剂已成为农药发展的主要趋势。我们知道禾本科牧草中很多草已经成为优良牧草，说明在家畜可食用剂量内的牧草不会引起家畜中毒或者毒性很低，并且其还可产生具有抗菌活性的次生代谢物，如野大麦，中华羊茅等。如果能从禾本科牧草中找到对食用真菌中的杂菌具有抑制作用的挥发油或者次生代谢物，一来低毒，二来可以充分利用丰富的牧草资源。同时这类植物源杀菌剂不会对生态环境产生污染，还具有可持续性，这将是抗菌药物研制与生产单位重要的工作方向。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了芸香草挥发油在抑制植物病原菌中的应用。

本发明提供芸香草挥发油在抑制植物病原菌或制备植物源杀菌剂中的应用；所述植物病原菌为黄曲霉、葡枝根霉、总状毛霉、绿色木霉、小扁豆刺盘孢、尖孢镰刀菌和/或马铃薯晚疫病菌。

作为优选，所述芸香草挥发油是将芸香草用水蒸馏提取得到的。

作为优选，所述植物病原菌为葡枝根霉、总状毛霉、绿色木霉和/或小扁豆刺盘孢。

作为优选，所述芸香草挥发油的浓度为50ppm-400ppm。

作为更优选，所述芸香草挥发油的浓度为100ppm-400ppm。

作为最优选，所述芸香草挥发油的浓度为400ppm。

本发明还提供芸香草挥发油中主要次生代谢物的制备方法，所述芸香草挥发油中主要次生代谢物为甲基丁香酚,丁基化羟基甲苯,Δ-杜松烯和榄香素；

所述芸香草挥发油中主要次生代谢物的制备方法具体为：

将芸香草挥发油过硅胶柱色谱，使用正己烷和乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，分别得到Fr.1-Fr.9 9个部分；所述梯度洗脱时，正己烷和乙酸乙酯的体积比依次为100:0、50:1、20:1、10:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1；

对其中FR.2部分采用硅胶柱色谱，洗脱剂为体积比为100:1的石油醚和二氯甲烷，得到化合物Δ-杜松烯；

对其中FR.3部分进行薄层色谱制备，展开剂为体积比为15:1的石油醚和乙酸乙酯，得到化合物甲基丁香酚和榄香素；

对其中FR.4部分采用硅胶柱色谱，洗脱剂为体积比为20:1的石油醚和乙酸乙酯，得到化合物丁基化羟基甲苯。

本发明还提供芸香草挥发油中主要次生代谢物在抑制植物病原菌或制备植物源杀菌剂中的应用；所述植物病原菌为黄曲霉、葡枝根霉、总状毛霉、绿色木霉、小扁豆刺盘孢、尖孢镰刀菌和/或马铃薯晚疫病菌；所述芸香草挥发油中主要次生代谢物为甲基丁香酚,丁基化羟基甲苯,Δ-杜松烯和榄香素。

作为优选，所述植物病原菌为葡枝根霉、总状毛霉、绿色木霉和/或小扁豆刺盘孢，所述芸香草挥发油中主要次生代谢物为Δ-杜松烯。

作为优选，所述植物病原菌为葡枝根霉和/或总状毛霉，所述芸香草挥发油中主要次生代谢物为丁基化羟基甲苯；作为优选，所述丁基化羟基甲苯的浓度为50ppm-200ppm。

作为优选，所述植物病原菌为绿色木霉和/或小扁豆刺盘孢，所述芸香草挥发油中主要次生代谢物为甲基丁香酚或榄香素；作为优选，所述甲基丁香酚或榄香素的浓度为200ppm。

本发明还提供一种植物源杀菌剂，其有效成分为芸香草挥发油或芸香草挥发油中主要次生代谢物；所述芸香草挥发油中主要次生代谢物为甲基丁香酚,丁基化羟基甲苯,Δ-杜松烯或榄香素。

本申请人首次采用平板菌丝抑制法测试了芸香草挥发油及主要化学成分对7种病原菌的抑制活性。通过活性抑制实验，芸香草挥发油对葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)、总状毛霉(Mucor racemosus)、绿色木霉(Trichoderma viride)以及小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)这四种植物病原菌的抑制率强；另外申请人对芸香草植物中的主要化学成分也分别测试了对这7种植物病原菌的抑制活性，结果表明同一化合物对不同病原菌表现出不同程度的抑制作用，对于同一病原菌不同的化合物显示出不一样的抑制作用，其中化合物甲基丁香酚,丁基化羟基甲苯,Δ-杜松烯和榄香素表现出明显的抑制作用，因此芸香草挥发油及主要化学成分可作为极有前景的植物源杀菌剂。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)抑制活性。

图2为不同浓度芸香草挥发油对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的抑制率。

图3为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制活性。

图4为不同浓度芸香草挥发油对总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制率。

图5为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制活性。

图6为不同浓度芸香草挥发油对绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制率。

图7为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对小扁豆刺盘孢(Colletotrichumlentis)抑制活性。

图8为不同浓度芸香草挥发油对小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)的抑制率。

图9为化合物2和多菌灵在不同浓度梯度下对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)抑制活性

图10为不同浓度化合物2和多菌灵对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的抑制率。

图11为化合物2和多菌灵在不同浓度梯度下对总状毛霉(Mucor racemosus)抑制活性。

图12为不同浓度化合物2和多菌灵对总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制率。

图13为化合物1和4以及多菌灵在不同浓度梯度下对绿色木霉(Trichodermaviride)抑制活性。

图14为不同浓度化合物1、4和多菌灵对绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制率。

图15为化合物1和4在不同浓度梯度下小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)抑制活性。

图16为不同浓度化合物1、4和多菌灵对小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)的抑制率。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1

供试病原真菌：黄曲霉(Aspergillus flavus)、葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)、总状毛霉(Mucor racemosus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和马铃薯晚疫病菌(Phytophythora infestans)。

供试的植物：芸香草(Cymbopogon distans)，即夹在书本中使其散发香气的植物。

芸香草挥发油的制备方法为：将芸香草植物250克的芸香草放进圆底烧瓶，加入350g的蒸馏水，采用水蒸气蒸馏来收集挥发油，收集的油水混合物用正己烷萃取，然后用无水硫酸钠进行干燥，最后用冷冻干燥机进行冷冻干燥得到挥发油，放进4℃冰箱进行保存。

实验方法：

采用含毒介质的生长速率法测定芸香草挥发油对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用。

将芸香草挥发油称取8毫克，用100微升的DMSO溶解；加入到20毫升的熔融的PDA培养基中，配成含芸香草挥发油一定浓度的含药PDA平板。将培养活化好的直径是4mm的各病原真菌(黄曲霉、葡枝根霉、总状毛霉、绿色木霉、小扁豆刺盘孢、尖孢镰刀菌和马铃薯晚疫病菌)的菌丝块移到含药平板中央，每个浓度设三次重复。置18℃(马铃薯晚疫病菌)和25℃(除马铃薯晚疫病菌外)恒温培养。用十字交叉法测量菌落直径，并校正，计算抑菌百分率。

实验结果：

通过活性抑制实验，在挥发油浓度为400ppm下，芸香草挥发油对葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)、总状毛霉(Mucor racemosus)、绿色木霉(Trichoderma viride)以及小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)这四种病原菌的表现出较为优异的抑制活性，其抑制率大于70％。特别是对葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)、总状毛霉(Mucorracemosus)以及绿色木霉(Trichoderma viride)表现出非常有意义的抑制活性，其抑制率分别为96.9％，95.1％，85.0％。对于黄曲霉(Aspergillusflavus)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和马铃薯晚疫病菌(Phytophythora infestans)，抑制率也在43.1％以上。

表1芸香草挥发油对7种植物病原菌的抑制率(％，400ppm)

为了进一步确认芸香草挥发油是否在低浓度对葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)、总状毛霉(Mucor racemosus)、绿色木霉(Trichoderma viride)以及小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)有抑制作用，我们进一步在200ppm、100ppm以及50ppm下测试其抑菌活性。

结果发现，在200ppm的芸香草挥发油浓度下，芸香草挥发油对匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)的抑制效果为65.0％；在100ppm的浓度下，芸香草挥发油对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的抑制效果为51.0％；在50ppm的挥发油浓度下，芸香草挥发油有反抑制匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的效应(-10.0％)，具体结果如图1和图2所示。

图1为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)抑制活性。

图2为不同浓度芸香草挥发油对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的抑制率。

在200ppm的芸香草挥发油浓度下，芸香草挥发油对于总状毛霉(Mucorracemosus)的抑制效果最为显著(84.6％)；在100ppm的浓度下，芸香草挥发油对于总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制效果为35.2％；在50ppm的挥发油浓度下，芸香草挥发油对于总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制效果为12.5％；抑菌效果与浓度呈正相关，即随着浓度梯度的降低而逐渐减少，具体结果如图3和图4所示。

图3为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制活性。

图4为不同浓度芸香草挥发油对总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制率。

在200ppm芸香草浓度下，芸香草挥发油对于绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制活性为83.1％；而在较低浓度(100ppm和50ppm)时，芸香草挥发油对于绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制活性均很低(分别为6.8％和4.2％)；具体结果如图5和图6所示。

图5为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制活性。

图6为不同浓度芸香草挥发油对绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制率。

对于小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)，在200ppm的芸香草挥发油浓度下，芸香草挥发油对于小扁豆刺盘孢的抑制效果为64.0％；在100ppm的浓度下，芸香草挥发油对于小扁豆刺盘孢的抑制效果为57.8％；在50ppm的挥发油浓度下，芸香草挥发油对于小扁豆刺盘孢的抑制效果为24.0％；抑菌效果与浓度呈正相关，即随着浓度梯度的降低而逐渐减少，具体结果如图7和图8所示。

图7为芸香草挥发油在不同浓度梯度下对小扁豆刺盘孢(Colletotrichumlentis)抑制活性。

图8为不同浓度芸香草挥发油对小扁豆刺盘孢的抑制率。

实施例2

供试真菌：黄曲霉(Aspergillusflavus)、葡枝根霉(Rhizopus stolonife)、总状毛霉(Mucor racemosus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和马铃薯晚疫病菌(Phytophythora infestans)。

检测植物挥发油及主要化合物的抑菌活性强弱的方法如下：

对各个处理下的七种植物病原菌的菌丝采用十字交叉的方式测试其菌落直径，直径的值越小，抑制活性越强。

供试的化合物1-4的制备过程如下，将所得芸香草挥发油过硅胶柱色谱，按照正己烷和乙酸乙酯(体积比依次为100:0、50:1、20:1、10:1、8:1、4:1、2:1、1:1、0:1)进行梯度洗脱，分别得到Fr.1-Fr.9个部分。

对其中FR.2部分采用硅胶柱色谱(石油醚与二氯甲烷按照体积比为100:1进行洗脱)得到纯化合物3(Δ-杜松烯，1-isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,3,5,6,8a-hexahydronaphthalene)。

对其中FR.3部分进行薄层色谱制备(石油醚：乙酸乙酯的体积比为15:1)，得到纯化合物1(甲基丁香酚，methyleugenol)和4(榄香素，1,2,3-trimethoxy-5-(2-propenyl)-benzene)。

对其中FR.4部分利用硅胶柱色谱(石油醚：乙酸乙酯的体积比为20:1)洗脱得到纯化合物2(丁基化羟基甲苯，butylated hydroxytoluene)。

上述供试化合物1-4分别为芸香草挥发油中的主要化合物。化学结构式分别为：

实验方法：

采用含毒介质的生长速率法测定芸香草挥发油中主要化学成分对植物病原真菌菌丝生长的抑制作用。

将化合物1-4分别称取8毫克，用100微升的DMSO溶解；加入到20毫升的熔融的PDA培养基中，分别配成含一定化合物浓度的含药PDA平板。将培养活化好的直径是4mm的各病原真菌(黄曲霉、葡枝根霉、总状毛霉、绿色木霉、小扁豆刺盘孢、尖孢镰刀菌和马铃薯晚疫病菌)的菌丝块移到含药平板中央，每个浓度设三次重复。置18℃(马铃薯晚疫病菌)和25℃(除马铃薯晚疫病菌外)恒温培养。用十字交叉法测量菌落直径，并校正，计算抑菌百分率。

实验结果：

芸香草挥发油中的主要化合物1-4，表现出较强的抑制作用，化合物3除了对黄曲霉、尖孢镰刀菌和马铃薯晚疫病菌没有明显抑制作用外，对其余的四种病原菌表现出显著的抑制作用；其中化合物2分别对葡枝根霉和总状毛霉表现出非常有意义的抑制作用，其抑制率分别为94.9％和90.5％；对于绿色木霉和小扁豆刺盘孢，化合物1和4表现较为明显的抑制作用，其抑制率在83.8％-90.3％之间，芸香草挥发油中对这两种病原菌有抑制作用的是这两种化合物。

表2芸香草挥发油的主要化学成分对7种植物病原菌的抑制率(％)

为了进一步确认化合物1，2，4和抗菌药物多菌灵是否在低浓度对上述抑制作用强的病原菌有抑制作用，我们进行了进一步抗菌活性测试。

对于匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)来说(图9和图10)，化合物2的抑制活性明显优于阳性对照多菌灵，特别是在浓度200ppm时，化合物2对该菌的抑制率高达90％以上，然而多菌灵的抑制率才在20％以上；当浓度为100ppm时化合物2的抑制率也接近60％；即使浓度达到25ppm，化合物2的抑制率也达30％以上，所以对于匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)来说，化合物2可作为先到抗菌活性分子，有进一步发展为农药的可能。

图9为化合物2和多菌灵在不同浓度梯度下对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)抑制活性

图10为不同浓度化合物2和多菌灵对匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的抑制率。

对于总状毛霉(Mucor racemosus)来说(图11和图12)，化合物2的抑制活性明显优于阳性对照多菌灵，特别是在浓度200ppm时，化合物2对该菌的抑制率高达80％以上，然而多菌灵的抑制率才在接近20％；当浓度为100ppm时化合物2的抑制率也接近40％；当浓度达到25ppm，化合物2和多菌灵的抑制率相接近，不到10％。所以对于总状毛霉(Mucorracemosus)来说，化合物2可作为先到抗菌活性分子，有进一步发展为农药的可能。

图11为化合物2和多菌灵在不同浓度梯度下对总状毛霉(Mucor racemosus)抑制活性。

图12为不同浓度化合物2和多菌灵对总状毛霉(Mucor racemosus)的抑制率。

对于绿色木霉(Trichoderma viride)来说(图13和图14)，当浓度为200ppm时，化合物1和4的抑制活性相差不大，其值接近80％，然而阳性药物多菌灵的抑制表现的稍微强些。在25-100ppm之间，多菌灵的强抑制作用并未减退，其抑制率都大于90％，而化合物1和4的抑制作用相比多菌灵表现的差些，所以对于绿色木霉(Trichoderma viride)来说，化合物1和4在高浓度下可作为先到抗菌活性分子的潜力。

图13为化合物1和4以及多菌灵在不同浓度梯度下对绿色木霉(Trichodermaviride)抑制活性。

图14为不同浓度化合物1、4和多菌灵对绿色木霉(Trichoderma viride)的抑制率。

对于小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)来说(图15和图16)，当浓度为200ppm时，化合物1抑制活性与多菌灵接近，大于80％，而化合物4，其抑制率在70％左右。在25-100ppm之间，多菌灵的强抑制作用并未减退，其抑制率都大于90％，而化合物1和4随着浓度的降低，其对应的抑制作用也相应的减退。所以对于小扁豆刺盘孢(Colletotrichumlentis)来说，化合物1和4在高浓度下可作为先到抗菌活性分子的潜力。

图15为化合物1和4在不同浓度梯度下小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)抑制活性。

图16为不同浓度化合物1、4和多菌灵对小扁豆刺盘孢(Colletotrichum lentis)的抑制率。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。