一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法。

背景技术

腺苷蛋氨酸，又称为腺苷甲硫氨酸，是甲硫氨酸的活性形式，其结构为：

在动物、植物和微生物体内，腺苷蛋氨酸是一种小分子重要代谢产物。同时，作为一种重要的生理活性物质存在于人体内，对生物的生长、代谢和发育起着重要的作用。腺苷蛋氨酸是通过提供基团和作为酶的诱导剂参与体内重要的生化反应的各种代谢途径，如脂类、蛋白质、核酸甲基化反应，转硫反应及多氨合成反应等，因其具有消炎及组织修复等功能，因此多用于关节炎的治疗；由于甲基化作用可以促进大脑和血液代谢多巴胺及复合胺，因此对抑郁症有很好的治疗作用；同时，腺苷蛋氨酸对哺乳动物合成腺苷蛋氨酸的主要场所肝脏也有着缓解作用和修复作用，因此也多用于肝病的治疗。此外，腺苷蛋氨酸对一些疾病，如癌症，神经递质的合成和代谢，在生物体内质膜的流动性保持具有十分重要的作用。

但是腺苷蛋氨酸在生产和应用中最关键的问题是稳定性差、易发生失活反应，在很大程度上限制了其在临床上的应用，经研究发现将其制备成盐可以在一定程度上提高腺苷蛋氨酸的稳定性。

目前，腺苷蛋氨酸的生产制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法三种，化学法合成的腺苷蛋氨酸产物中含有少量的(+)腺苷蛋氨酸，分离难度大；酶促转化法合成腺苷蛋氨酸的成本比较大；发酵法为某些微生物可以在细胞内积累腺苷蛋氨酸，通过对这些微生物的发酵，尤其是在培养基中添加一定量的甲硫氨酸，可以获得大量的腺苷蛋氨酸，通过微生物发酵，再从中提取精制腺苷蛋氨酸是目前工业化生产腺苷蛋氨酸的主要途径。

发酵法得到的腺苷蛋氨酸需要经过分离纯化才能得到纯度较高的腺苷蛋氨酸，一般产品得分离纯化工艺为：发酵液预处理、固液分离、产品初提取和产品精制。由于腺苷蛋氨酸属于小分子，并且主要存在于酵母细胞内，因此需要将细胞进行一定程度的破碎使胞内产物释放出来后才能进行下一步分离。

中国专利申请201910112234.8中公开了一种从S-腺苷蛋氨酸发酵液中提取分离S-腺苷蛋氨酸的方法，使得S-腺苷蛋氨酸总收率达到70％以上，该方法按如下步骤进行：a.破壁：发酵液通过碟片离心机，收集酵母菌，并加入发酵液体积30％-100％的纯水洗菌体，获得的菌液采用淀粉喷射液化装置，瞬时高温破壁后快速降温，使细胞破碎率达到99％以上；b.粗提：将a步骤获得的破壁液过孔径50-200μm的微滤膜，收集滤液，控制微滤膜对S-腺苷蛋氨酸的截留率≤5％，将透析液过超滤膜(材质为PVDF，截留分子量为3000-10000D)，除去蛋白等大分子物质，获得S-腺苷蛋氨酸粗提液；c.精制：将b步骤获得的粗提液经弱酸型阳离子交换树脂纯化，洗脱液过脱色树脂脱色后获得S-腺苷蛋氨酸精制液；d.成盐：将c步骤的精制液过纳滤膜(材质为PVDF，截留分子量为100-500D)浓缩5-15倍，与一定摩尔比例的硫酸和对甲苯磺酸合成双盐，获得腺苷蛋氨酸对甲苯磺酸硫酸盐，该申请中使用淀粉喷射液化装置对发酵液进行破壁处理，由于在处理过程中会出现高温，会在一定程度上使腺苷蛋氨酸分解，并且会在破壁的时候使细胞中的其他杂质释放出来，从而增加了后续处理的步骤，因此影响腺苷蛋氨酸的收率和纯度。

因此需要开发一种既能够提高腺苷蛋氨酸分离提纯效率，又能不引入其他杂质的分离纯化方法。

发明内容

基于现有技术中的不足，本发明旨在提供一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法，该方法通过选用合适的溶剂，并控制pH值和反应温度能够有效提高细胞破碎率，并且不会引入其他杂质，不会对腺苷蛋氨酸的稳定性产生影响，造成腺苷蛋氨酸收率降低。

具体的，本发明的目的可通过如下技术方案来实现：

一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1、破壁处理：取发酵液进行离心处理，去除上清液，洗涤后再次离心去上清液，取沉淀加入溶剂，常温震荡30-60min后离心，经0.22μm滤膜过滤，保留滤液，备用；

S2、调整步骤S1中得到的滤液的pH值，然后过弱酸性离子交换树脂，使用硫酸洗脱，得到腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液；

S3、将步骤S2中得到的腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液进行沉淀析出，得到腺苷蛋氨酸硫酸盐。

上述步骤S1中所述的离心处理的速率为6000-8000r/min；优选为6500-7500r/min；再优选为7000r/min。

上述步骤S1中所述的加入溶剂为体积比5-10:1的乙酸和硫酸；优选为6-9:1；再优选为7-8:1；进一步优选为8:1。

所述的乙酸的浓度为0.1-0.3mol/L，所述的硫酸的浓度为0.6-1.0mol/L。

优选地，所述的乙酸的浓度为0.2mol/L，所述的硫酸的浓度为0.8mol/L。

本发明通过控制乙酸和硫酸的体积比和浓度，既能够保证小分子的腺苷蛋氨酸能够穿过细胞壁流出，又能保证细胞内大分子杂质被截留，从而提高了腺苷蛋氨酸的纯度，减少了后续处理的步骤。

上述步骤S2中所述的过弱酸性离子交换树脂为D113树脂和D115树脂的混合树脂，所述的D113树脂和D115树脂的体积比为2-3:1；优选为3:1。

所述的洗脱液为硫酸，所述的硫酸的流速为2-3BV/h，优选为2.5BV/h。

所述的洗脱过程中硫酸的浓度为0.25-0.3mol/L；优选为0.25mol/L。

上述步骤S3中所述的沉淀析出步骤为：将步骤S2中得到的洗脱液缓慢滴加到甲醇溶液中，所述的甲醇溶液的体积分数为60-80％，优选为70％；所述的滴加速度为1分钟20-30滴，优选为28滴。

所述的甲醇溶液中添加有盐酸，所述的盐酸与甲醇的体积比为5-10mL:50mL；优选为8-10mL:50mL，进一步优选为10mL:50mL。

所述的盐酸的浓度为1-2mol/L；优选为1.5mol/L。

一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1、破壁处理：取发酵液进行离心处理，离心速率为6000-8000r/min，去除上清液，洗涤后再次以6000-8000r/min的速率离心去上清液，取沉淀加入体积比5-10:1的乙酸和硫酸溶液，常温震荡后30-60min以6000-8000r/min的速率离心，经0.22μm滤膜过滤，保留滤液，备用；

S2、调整步骤S1中得到的滤液的pH值为3-5，然后过体积比为2-3:1的D113树脂和D115树脂串联的混合弱酸性离子交换树脂，使用浓度为0.25-0.3mol/L的硫酸以2-3BV/h的流速进行洗脱，得到腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液；

S3、将步骤S2中得到的腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液缓慢滴加到含盐酸的甲醇溶液中，所述的甲醇溶液的体积分数为60-80％，所述的滴加速度为1分钟20-30滴，得到腺苷蛋氨酸硫酸盐。

本发明在实施过程中使用混合溶剂进行细胞破壁处理，能够有效地使小分子的腺苷蛋氨酸能够穿过细胞壁流出，又能保证细胞内大分子杂质被截留，从而提高了腺苷蛋氨酸的纯度，减少了后续处理的步骤，从而提高了腺苷蛋氨酸的收率，使腺苷蛋氨酸的收率能够达到80％以上，纯度能够达到99.5％以上，符合产品相关标准。

本发明与现有技术相比的有益效果在于：

(1)本发明在实施过程中使用混合溶剂进行细胞破壁处理，通过控制混合溶剂的体积比为5-10:1的乙酸和硫酸，能够有效地提高腺苷蛋氨酸的溶出率，从而提高腺苷蛋氨酸的收率；

(2)本发明在破壁过程中使用混合溶剂，能够有效保证小分子溶出，而使细胞中的大分子截留，从而有效地减少了后续处理中的除杂步骤，从而提高了腺苷蛋氨酸的纯度；

(3)在纯化步骤中使用混合大孔径树脂，通过控制大孔径树脂的体积比，能够有效去除杂质，使得到的腺苷蛋氨酸纯度高，在洗脱过程中通过控制硫酸的浓度以及流速，能够有效地使腺苷蛋氨酸解脱，从而得到纯度较高的腺苷蛋氨酸洗脱液；

(4)本发明使用有机溶剂沉淀的方法使腺苷蛋氨酸从硫酸洗脱液中结晶出来，本发明通过控制甲醇的体积分数以及滴加速度使腺苷蛋氨酸能够有效结晶，另外本发明在实施过程中意外地发现在甲醇中添加一定量的盐酸能够使腺苷蛋氨酸在结晶过程中析出率高，减少杂质的析出。

(5)本发明提供的腺苷蛋氨酸分离纯化方法，最终得到的腺苷蛋氨酸的收率为80％以上，纯度为99.5％以上。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本发明中所述的发酵液为酒酿酵母BNCC186832制备腺苷蛋氨酸的发酵液。

实施例1一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法

包括以下步骤：

S1、破壁处理：取5mL的发酵液进行离心处理，离心速率为6000r/min，去除上清液，洗涤后再次以6000r/min的速率离心去上清液，取沉淀加入6mL体积比5:1的0.1mol/L乙酸和0.6mol/L硫酸溶液，常温震荡60min后以6000r/min的速率离心，经0.22μm滤膜过滤，保留上清液，备用；

S2、调整步骤S1中得到的上清液的pH值为3，然后过体积比为2:1的D113树脂和D115树脂串联的混合弱酸性离子交换树脂，使用浓度为0.25mol/L的硫酸以2BV/h的流速进行洗脱，得到腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液；

S3、将步骤S2中得到的腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液缓慢滴加到体积比为5mL:50mL的1mol/L盐酸和60％甲醇混合溶液中，所述的滴加速度为1分钟20滴，得到腺苷蛋氨酸硫酸盐。

实施例2一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法

包括以下步骤：

S1、破壁处理：取5mL的发酵液进行离心处理，离心速率为8000r/min，去除上清液，洗涤后再次以8000r/min的速率离心去上清液，取沉淀加入5mL体积比10:1的0.3mol/L乙酸和1.0mol/L硫酸溶液，常温震荡30min后以8000r/min的速率离心，经0.22μm滤膜过滤，保留上清液，备用；

S2、调整步骤S1中得到的上清液的pH值为5，然后过体积比为3:1的D113树脂和D115树脂串联的混合弱酸性离子交换树脂，使用浓度为0.3mol/L的硫酸以3BV/h的流速进行洗脱，得到腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液；

S3、将步骤S2中得到的腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液缓慢滴加到体积比为8mL:50mL的1mol/L盐酸和80％甲醇混合溶液中，所述的滴加速度为1分钟30滴，得到腺苷蛋氨酸硫酸盐。

实施例3一种腺苷蛋氨酸的分离纯化方法

包括以下步骤：

S1、破壁处理：取5mL的发酵液进行离心处理，离心速率为7000r/min，去除上清液，洗涤后再次以7000r/min的速率离心去上清液，取沉淀加入9mL体积比8:1的0.2mol/L乙酸和0.8mol/L硫酸溶液，常温震荡50min后以7000r/min的速率离心，经0.22μm滤膜过滤，保留上清液，备用；

S2、调整步骤S1中得到的上清液的pH值为4，然后过体积比为3:1的D113树脂和D115树脂串联的混合弱酸性离子交换树脂，使用浓度为0.25mol/L的硫酸以2.5BV/h的流速进行洗脱，得到腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液；

S3、将步骤S2中得到的腺苷蛋氨酸硫酸洗脱液缓慢滴加到体积比为10mL:50mL的1.5mol/L盐酸和70％甲醇混合溶液中，所述的滴加速度为1分钟28滴，得到腺苷蛋氨酸硫酸盐。

对比例1

与实施例3的区别在于：步骤S1中仅使用乙酸作为溶剂，其他操作和步骤与实施例3相同。

对比例2

与实施例3的区别在于：步骤S1中仅使用硫酸作为溶剂，其他操作和步骤与实施例3相同。

对比例3

与实施例3的区别在于：步骤S2中仅使用D113树脂进行纯化，其他操作和步骤与实施例3相同。

对比例4

与实施例3的区别在于：步骤S2中仅使用D115树脂进行纯化，其他操作和步骤与实施例3相同。

对比例5

与实施例3的区别在于：步骤S3仅使用70％甲醇进行结晶提取，其他操作和步骤与实施例3相同。

效果试验：

试验例1、对实施例1-3以及对比例1-5得到的腺苷蛋氨酸硫酸盐进行收率、纯度和S-S型异构体检测，检测结果见下表1。

表1

根据上表1的检测数据可以看出，实施例1-3采用本发明公开的方法进行腺苷蛋氨酸的纯化提取能够明显提高腺苷蛋氨酸的收率和纯度，使收率高于80％，纯度高于99.5％，S-S型异构体高于66％，而对比例1和对比例2改变破壁过程中溶剂的种类，仅使用一种溶剂进行破壁，根据数据可以看出得到腺苷蛋氨酸的收率明显降低，因此可知仅使用一种溶剂的破壁效果明显降低，不能使腺苷蛋氨酸全部溶出，从而使腺苷蛋氨酸的收率降低；对比例3-4为纯化过程中只使用一种树脂，不能很好地对腺苷蛋氨酸进行除杂，因此会明显影响产物腺苷蛋氨酸的纯度，使纯度明显降低，对比例5中在提取液过程中仅使用甲醇溶液，得到的腺苷蛋氨酸的收率明显降低，纯度也出现了一定程度的降低，说明仅使用甲醇不能使腺苷蛋氨酸提取液中的产物全部结晶，因此会造成产物浪费。

为了进一步证明本发明采用的破壁溶液具有很好的破壁效果，设置了对比例6和对比例7。

对比例6

与实施例3的区别在于：步骤S1中使用体积比3:1的0.2mol/L乙酸和0.8mol/L硫酸溶液作为溶剂，其他操作和步骤与实施例3相同。

对比例7

与实施例3的区别在于：步骤S1中使用体积比12:1的0.2mol/L乙酸和0.8mol/L硫酸溶液作为溶剂，其他操作和步骤与实施例3相同。

试验例2、对实施例1-3以及对比例1-2、6-7的细胞破壁率进行检测，检测结果见下表2。

以实施例3的腺苷蛋氨酸的细胞破壁率为100％，进行比较研究对比例1-2、6-7的细胞破壁率，使用HPLC进行检测。

表2

根据上表2的检测数据可知只有控制0.2mol/L乙酸和0.8mol/L硫酸的体积比5-10:1的时候，尤其是体积比8:1的时候细胞的破壁率最高，从而使腺苷蛋氨酸的溶出度最高，得到的腺苷蛋氨酸产物的收率才能达到最高，最终使腺苷蛋氨酸得收率能够达到80％以上。

进一步研究了结晶过程中不同盐酸加入量对产物收率和纯度的影响，设置了对比例8和对比例9，检测结果见下表3。

对比例8

与实施例3的区别在于：步骤S3中使用体积比为2mL:50mL的1.5mol/L盐酸和70％甲醇混合溶液，其他操作和步骤与实施例3相同。

对比例9

与实施例3的区别在于：步骤S3中使用体积比为15mL:50mL的1.5mol/L盐酸和70％甲醇混合溶液，其他操作和步骤与实施例3相同。

表3

根据上表3的检测数据可知使用5-10mL:50mL的盐酸和甲醇混合溶液，尤其是使用10mL:50mL的1.5mol/L盐酸和70％甲醇混合溶液进行产物结晶能够明显提高腺苷蛋氨酸产物的收率和纯度，使腺苷蛋氨酸产物在洗脱液中高效结晶，并且不会使杂质析出，因此得到的产物纯度和收率均比较高，对比例8由于加入极少的盐酸因此效果不明显，收率和纯度均不满足要求，对比例9中加入大量的盐酸，在结晶过程中会使杂质一并结晶，因此使腺苷蛋氨酸产物得纯度明显降低。

综上，只有使用本发明提供的提取纯化方法才能满足腺苷蛋氨酸产物纯度和收率均比较高的要求。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。