一种动物外周血红细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及红细胞制备技术领域，特别涉及一种动物红细胞的制备方法。

背景技术

红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。血红蛋白中有铁元素，所以贫血的人宜多吃铁含量丰富的食物和蛋白质，来补血。血红蛋白能和空气中的氧结合，因此红细胞能通过血红蛋白将吸入肺泡中的氧运送给组织，而组织中新陈代谢产生的一部分二氧化碳也通过红细胞运到肺部通过肺泡同体外的氧气进行气体交换，将二氧化碳排出体外。

红细胞呈红色，那是因为红细胞富含血红蛋白。血红蛋白含铁，它在含氧量高的地方容易与氧结合，在含氧量低的地方又容易与氧分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞具有运输氧的功能。红细胞在肺部获取氧，然后随血液流动，在全身各处毛细血管将氧释放，供细胞利用。

目前制备动物外周血红细胞方法很多。但是提取率均较低，比较耗时，成本较高。制备的红细胞的有效保存时间短，导致需要经常配制和造成小鼠红细胞的浪费。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便、成本低、稳定性高、提取率高的红细胞提取工艺及红细胞保存的方法。

本发明提供一种红细胞的提取工艺，包括以下步骤 ：

(1)准备：准备新鲜动物新鲜全血（宰杀0.5-2h以内）；

(2) 预处理：将新鲜动物新鲜全血用离心力在200-800g下，离心20-40min后使用0.22-0.45nm滤膜进行过滤。加入0.01-0.5%的抗氧剂，0-10℃下静止8-12h；

(3) 粗提取：将（2）中样本用离心力在200-800g下，离心20-40min。离心后出现分层，除去最上层1-3.0ml样本，剩下的样本小心吸取2-4.5ml样本。然后将吸取的样本混匀。重复上述操作2-5次；

(4) 阻断过程：在离心管中吸取上述（3）样本，加入2-5倍体积细胞阻断剂。温度在4-10℃下，离心力为400-900g，离心15-45min。除去离心管上方2.5-4.5ml样本，小心吸取剩余样本2-3ml。重复上述操作1-3次；

(5) 溶解过程：在离心管中吸取（4）样本，加入适量体积的细胞溶解剂。在0-4℃下静止放置1-3h。混匀，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液，再向样本中加入适量原体积的细胞溶解剂，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液；

(6) 保存：向（5）中添加细胞固定剂和稳定剂。

本发明新鲜动物全血来源为猪、羊、牛中的一种全血。

本发明的细胞阻断剂为0.1-50mM/L丙三醇缓冲液、丙二醇缓冲液、TRIS缓冲液、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠中的一种或两种，pH在6.5-8.0之间。

本发明的抗氧剂为10-25mM/L亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、抗坏血酸、硫代硫酸钠中的一种。

本发明的细胞溶解剂为50-200mM/L磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼酸、甘氨酸-柠檬酸、Tris、PIPES、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠中的一种或两种。pH在7.0-8.5之间。

本发明的细胞溶解剂添加量为细胞溶解剂：样本在2.5-5.0:1之间。

本发明的细胞固定剂为EDTA-2K、EDTA-2Na、吐温系列、曲拉通系列中的一种，浓度为5-50g/L。

本发明的稳定剂为DDT、蔗糖、AES、海藻糖、甘露醇、甘油、葡萄糖中的一种或两种。

本发明的红细胞的提取工艺具有以下优点 ：

(1) 操作简便，即可实现对全血进行半机械化处理，克服了现有技术操作繁琐、时间较长、细胞澄清度较差、杂质率高等问题的缺点；

(2) 纯度高，利用抗氧剂、细胞阻断剂、细胞溶解剂等得到的目标红细胞，其纯度在75-83.6%。克服了现有技术中无法准确的、可重复的做到目标纯度值、且对浓度值无法控制的不足的难题；

(3) 稳定性好，与现有技术相比，通过抗氧剂、细胞阻断剂、细胞溶解剂等技术手段得到的红细胞样本保存时间长达40天，比现有的技术中制备的红细胞悬液保存时间更长，具有延长红细胞的有效保存时间，减少红细胞的浪费和经常配制带来的麻烦。

附图说明：

图1是刚制备出来的小鼠红细胞在显微镜下的视图；

图2是制备出来第10天的小鼠红细胞在显微镜下的视图；

图3是制备出来第15天的小鼠红细胞在显微镜下的视图；

图4是制备出来第24天的小鼠红细胞在显微镜下的视图；

图5是制备出来第32天的小鼠红细胞在显微镜下的视图；

图6是制备出来第40天的小鼠红细胞在显微镜下的视图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

根据本发明提取牛全血红细胞制备的步骤是：

（1）准备：准备新鲜动物新鲜全血（宰杀0.5-2h以内）；

（2） 预处理：将新鲜动物新鲜全血用离心力在200-800g下，离心20-40min后使用0.22-0.45nm滤膜进行过滤。加入0.01-0.5%的抗氧剂，0-10℃下静止8-12h；

（3）粗提取：将（2）中样本用离心力在200-800g下，离心20-40min。离心后出现分层，除去最上层1-3.0ml样本，剩下的样本小心吸取2-4.5ml样本。然后将吸取的样本混匀。重复上述操作2-5次；

（4）阻断过程：在离心管中吸取上述（3）样本，加入2-5倍体积细胞阻断剂。温度在4-10℃下，离心力为400-900g，离心15-45min。除去离心管上方2.5-4.5ml样本，小心吸取剩余样本2-3ml。重复上述操作1-3次；

（5） 溶解过程：在离心管中吸取（4）样本，加入适量体积的细胞溶解剂。在0-4℃下静止放置1-3h。混匀，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液，再向样本中加入适量原体积的细胞溶解剂，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液；

（6）保存：向（5）中添加细胞固定剂和稳定剂。

本发明新鲜动物全血来源为猪全血。

本发明的细胞阻断剂为3.85mM/L丙三醇缓冲液、丙二醇缓冲液，pH在6.9。

本发明的抗氧剂为13.6mM/L亚硫酸氢钠。

本发明的细胞溶解剂为69.2mM/L柠檬酸钠。pH在7.2。

本发明的细胞溶解剂添加量为细胞溶解剂：样本在2.5:1。

本发明的细胞固定剂为EDTA-2K，浓度为7.5g/L。

本发明的稳定剂为甘油、葡萄糖。

实施例2

（1）准备：准备新鲜动物新鲜全血（宰杀0.5-2h以内）；

（2）预处理：将新鲜动物新鲜全血用离心力在200-800g下，离心20-40min后使用0.22-0.45nm滤膜进行过滤。加入0.01-0.5%的抗氧剂，0-10℃下静止8-12h；

（3）粗提取：将（2）中样本用离心力在200-800g下，离心20-40min。离心后出现分层，除去最上层1-3.0ml样本，剩下的样本小心吸取2-4.5ml样本。然后将吸取的样本混匀。重复上述操作2-5次；

（4）阻断过程：在离心管中吸取上述（3）样本，加入2-5倍体积细胞阻断剂。温度在4-10℃下，离心力为400-900g，离心15-45min。除去离心管上方2.5-4.5ml样本，小心吸取剩余样本2-3ml。重复上述操作1-3次；

（5）溶解过程：在离心管中吸取（4）样本，加入适量体积的细胞溶解剂。在0-4℃下静止放置1-3h。混匀，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液，再向样本中加入适量原体积的细胞溶解剂，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液；

（6）保存：向（5）中添加细胞固定剂和稳定剂。

本发明新鲜动物全血来源为牛全血。

本发明的细胞阻断剂为12.2mM/L丙三醇缓冲液、氯化钠，pH在7.1。

本发明的抗氧剂为16.6mM/L硫代硫酸钠。

本发明的细胞溶解剂为100.9mM/L硼酸、PIPES。pH在7.0。

本发明的细胞溶解剂添加量为细胞溶解剂：样本在5.0:1。

本发明的细胞固定剂为吐温-80。浓度为5.5g/L。

本发明的稳定剂为甘露醇、甘油。

实施例3

（1）准备：准备新鲜动物新鲜全血（宰杀0.5-2h以内）；

（2）预处理：将新鲜动物新鲜全血用离心力在200-800g下，离心20-40min后使用0.22-0.45nm滤膜进行过滤。加入0.01-0.5%的抗氧剂，0-10℃下静止8-12h

（3）粗提取：将（2）中样本用离心力在200-800g下，离心20-40min。离心后出现分层，除去最上层1-3.0ml样本，剩下的样本小心吸取2-4.5ml样本。然后将吸取的样本混匀。重复上述操作2-5次。

（4）阻断过程：在离心管中吸取上述（3）样本，加入2-5倍体积细胞阻断剂。温度在4-10℃下，离心力为400-900g，离心15-45min。除去离心管上方2.5-4.5ml样本，小心吸取剩余样本2-3ml。重复上述操作1-3次。

（5）溶解过程：在离心管中吸取（4）样本，加入适量体积的细胞溶解剂。在0-4℃下静止放置1-3h。混匀，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液，再向样本中加入适量原体积的细胞溶解剂，离心力为50-300g，离心5-15min，彻底去除上清液。

（6）保存：向（5）中添加细胞固定剂和稳定剂。

本发明新鲜动物全血来源为羊全血。

本发明的细胞阻断剂为14.8mM/L丙二醇缓冲液，pH在7.5。

本发明的抗氧剂为20.0mM/L抗坏血酸。

本发明的细胞溶解剂为55.5mM/L甘氨酸-柠檬酸、氯化钠。pH在7.4。

本发明的细胞溶解剂添加量为细胞溶解剂：样本在4.0:1。

本发明的细胞固定剂为EDTA-2Na。浓度为15.0g/L。

本发明的稳定剂为DDT、AES。

可从图1-6中发现，本发明技术手段得到的红细胞样本保存时间长达40天，比现有的技术中制备的红细胞悬液保存时间更长，具有延长红细胞的有效保存时间。