改进的Aβ初原纤维结合抗体

本申请是申请号为201580036189.2、发明名称为“改进的Aβ初原纤维结合抗体”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2015年7月8日提交的PCT国际专利申请PCT/EP2015/065633进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及淀粉样蛋白β肽(amyloid beta peptide，Aβ)，更具体地涉及结合Aβ初原纤维(protofibrils)的抗体及其在医疗和/或预防性治疗阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症中的用途。此外，本发明可以涉及这些疾病的诊断以及通过使用本发明的抗体监测疾病进展。此外，本发明可以涉及本发明抗体的兽医用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)属于一组神经退行性疾病，并且引起认知、记忆和行为损伤。阿尔茨海默病的标志包括细胞外淀粉样蛋白斑、神经元内神经原纤维缠结(intraneuronal neurofibrillary tangle)、神经元功能障碍和最终的脑萎缩。发生AD的风险随着年龄增加而升高，并且在达到高龄的人中数量增加，该病症对老年人的生活质量的影响不断增加。此外，社会面临着其费用加速增加的情况。

尽管已知该疾病多年并且已经进行了几种治疗建议，但即使在今天，也没有目前可用的有效疾病改善疗法，最多仅可提供针对症状治疗的药物。对该疾病背后的机理已经进行了大量的研究。简言之，由于某些原因，Aβ开始聚集并且通过几种中间体形式，最终在脑中产生难溶的原纤维/斑块沉积物。早期认为，该斑块因此影响神经元和由其传递的信号，但是现在广泛研究的结果表明Aβ的可溶的、聚集的中间体形式最有可能是疾病和在患者中所观察到的症状的主要原因。

在从Aβ单体到不溶性Aβ原纤维的聚集形式级联中，一种这样的中间体形式是可溶的高分子量Aβ初原纤维，其首先由Walsh于1997年在The Journal of BiologicalChemistry中描述(Vol.272(35)p.22364-72)。Aβ初原纤维对于AD发生的重要性由Uppsala大学的Lars Lannfelt领导的科学家小组在其对Arctic突变的研究中确定，其是淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)中的E693G突变，引起Aβ初原纤维的形成增加。发现在瑞典北部携带该突变的家族在生命早期会发生严重的阿尔茨海默病，并且这种组合的发现为新的治疗提供了基本的思路。因此，Aβ初原纤维被鉴定为与该疾病密切相关并且是治疗的重要靶标。基于他们对包含Arctic突变的Aβ肽的研究，Lannfelt等能够在体外产生足够量的Aβ初原纤维(Arctic以及野生型)用于免疫，以及用于随后选择与Aβ系统中的其他种类相比对Aβ初原纤维具有高亲和力的抗体。用于产生Aβ初原纤维和结合这些初原纤维的抗体的方法的实例公开于WO02/03911和WO2005/123775中。

特别重要的是小鼠单克隆抗体mAb158(一种与Aβ初原纤维结合的抗体，其公开于EP2004688中)的开发，其包含以下CDR序列：

人源化形式的mAb158(BAN2401)的高亲和力和选择性使其成为特别用于治疗和/或预防阿尔茨海默病的非常重要的候选物，并且目前正在进行临床试验以准备用作药物产品。BAN2401的特征描述于EP2004688中。

抗体的效力取决于几种药代动力学和药效动力学因素，参见例如Deng等，ExpertOpin.Drug Metab.Toxicol 8(2)(2012)：p.141-160；Boswell等，Bioconjugate Chem.21(2010)：p.2153-2163；Konterman，Current Opinion in Biotechnology 22(2011)：p.1-9和Igawa等，mAbs 3：3(2011)：p.243-252。其中，具有提升的系统暴露的延长血清半衰期通常对改进显著治疗价值提供相当大的可能性。其还提供了减少剂量的机会，这具有系统性的重要意义。

发明内容

本发明提供了结合Aβ初原纤维的抗体及其在治疗和/或预防性治疗阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症中的用途。此外，本发明可以涉及用于诊断这样的疾病的抗体，以及它们在监测这些疾病的疾病进展中的用途，以及所述抗体的兽医用途。已经发现，令人惊讶的是，主要通过在BAN2401抗体的可变轻链的某些位置即17、79和/或82(Kabat位置17、74和77)中分别引入一个或更多个突变，基于mAb158的人源化抗体(即BAN2401)的半衰期以及暴露显著增强例如约两倍或更多倍，另参见图9，其中这些位置被称为x

任选地，根据本发明的抗体的另外的改进可以通过将每个提供增加的半衰期的突变分别与一个或更多个相邻突变相组合来实现，即抗体的可变轻链的13、21、81和/或84(Kabat位置13、21、76和79)，另见图9，其中这些位置分别称为y

本发明如下：

[1]对Aβ初原纤维具有亲和力的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有根据SEQ ID NO：8的可变轻链，其中

x

x

x

y

y

y

y

根据SEQ ID NO：14的可变重链，其中

z

z

z

排除x

[2]根据[1]所述的抗体或抗原结合片段，其中

x

x

x

y

y

y

y

根据SEQ ID NO：14的可变重链，其中

z

z

z

排除x

[3]根据[1]或[2]所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链a包含选自以下的突变的组合：

x

x

x

x

x

x

x

排除x

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述可变轻链包含一个或更多个选自以下的突变：

x

x

x

x

x

x

x

其中y

y

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

排除其中y

[6]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

[7]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

[8]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

[9]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

[10]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

[11]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

[12]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

[13]根据[1]所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

[14]根据[1]至[13]中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段包含IgG重链恒定区。

[15]根据[1]至[14]中任一项的抗体，其用于医疗。

[16]根据[1]至[14]中任一项的抗体，其用于治疗和/或预防阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症。

[17]根据[16]所使用的抗体，其中所述与Aβ蛋白聚集相关的其他病症选自创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)、路易体痴呆(Lewy body dementia，BD)、唐氏综合征(Downs syndrome，DS)、肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病(tauopathies)、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(Parkinson’s disease dementia，PDD)。

[18]根据[1]至[14]中任一项所述的抗体在制备用于治疗和/或预防阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症的药物中的用途。

[19]根据[18]所述的用途，其中所述与Aβ蛋白聚集相关的其他病症选自创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。

[20]减少对象中Aβ初原纤维的量的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的根据[1]至[14]所述的抗体或抗原结合片段。

[21]用于在患有阿尔茨海默病或有发生阿尔茨海默病之风险的对象中治疗和/或预防所述疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的根据[1]至[14]所述的抗体或抗原结合片段。

[22]用于在患有创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)或有发生所述疾病之风险的对象中治疗和/或预防所述疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的根据[1]至[14]所述的抗体或抗原结合片段。

[23]用于测量人中Aβ初原纤维和/或聚集的Aβ蛋白的量的方法，其包括在体内或体外使所述人的组织或体液与根据[1]至[14]所述的抗体或抗原结合片段接触，并测量与所述Aβ初原纤维和/或聚集的Aβ蛋白结合的所述抗体或抗原结合片段的量。

[24]用于在患有阿尔茨海默病或有发生阿尔茨海默病之风险的人中诊断所述疾病的方法，其包括在体内或体外使所述人的组织或体液与根据[1]至[14]所述的抗体或抗原结合片段或其片段接触，并测量与聚集的Aβ蛋白结合的所述抗体的量。

[25]用于在患有创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)中任一种或有发生所述疾病之风险的人中诊断所述疾病的方法，其包括在体内或体外使所述人的组织或体液与根据[1]至[14]所述的抗体或抗原结合片段或其片段接触，并测量与聚集的Aβ蛋白结合的所述抗体的量。

[26]药物组合物，其包含根据[1]至[14]中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及可药用赋形剂和/或稀释剂。

[27]根据[1]至[14]中任一项的抗体，其用于兽医用途。

附图说明

图1提供了与BAN2401(对照)相比，对于A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S，与Aβ单体相比对Aβ初原纤维的结合和选择性的分析。通过空心圆和空心正方形表示溶液中Aβ1-42初原纤维的结合抑制，并且通过实心圆和实心正方形表示溶液中Aβ1-40单体的结合抑制。

图2提供了以时间相对于浓度图呈现的小鼠中BAN2401和本发明抗体的血浆药物暴露。图中示出了以BAN2401、A17D、A17D/R79T和A17D/R79T/R82S单次静脉内注射后在施用后0.5小时、2天、7天、15天和29天的时间点收集的血浆水平；以及以A17D/R82S单次静脉内注射后在施用后0.5小时、2天、7天、14天和28天的时间点收集的血浆水平。A17D/R82S未包括在与本文所示的其他抗体相同的PK研究中，而是在单独的情况下给出。然而，除了两个血浆取样时间点以外，对于这两个单独的研究使用相同的研究设计。在相同的情况下通过ELISA分析所有血浆样品，以避免测定间变异。以μg/ml表示的血浆药物浓度显示在y轴(对数标度)上，以小时(h)表示的施用后时间显示在x轴上。显示的平均组值带有指示标准偏差的误差条。通过使用Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)的非隔室分析计算平均AUC

图3提供了以时间相对于浓度图呈现的大鼠中BAN2401和本发明抗体的血浆药物暴露。图中示出了以BAN2401、A17D、A17D/R79T和A17D/R79T/R82S单次静脉内注射后在施用后0.5小时、2小时、7小时、24小时、2天、4天、7天、14天和29天的时间点收集的血浆水平。以μg/ml表示的血浆药物浓度显示在y轴(对数标度)上，以小时(h)表示的施用后时间显示在x轴上。显示的平均组值带有指示标准偏差的误差条。通过使用Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)的非隔室分析计算平均AUC

图4提供了与BAN2401相比，对于A17D/R79T的去免疫化(deimmunized)变体(A17D/R79T_DI 1-8)，与Aβ单体相比，对Aβ初原纤维的结合和选择性的分析的数据。通过空心圆和空心正方形表示溶液中Aβ1-42初原纤维的结合抑制，并且通过实心圆和实心正方形表示溶液中Aβ1-40单体的结合抑制。A)A17D/R79T_DI 1，B)A17D/R79T_DI2，C)A17D/R79T_DI 3，D)A17D/R79T_DI 4，E)A17D/R79T_DI 5，F)A17D/R79T_DI 6，G)A17D/R79T_DI 7，H)A17D/R79T_DI 8。

图5提供了以时间相对于浓度图呈现的小鼠中BAN2401和本发明抗体的血浆药物暴露。以BAN2401、A17D/R79T和A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)单次静脉内注射后在施用后0.5小时、2天、7天、14天和28天的时间点收集的的血浆水平。以μg/ml表示的血浆药物浓度显示在y轴(对数标度)上，以小时(h)表示的施用后时间显示在x轴上。显示的平均组值带有指示标准偏差的误差条。通过使用Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)的非隔室分析计算平均AUC

图6提供了以时间相对于浓度图呈现的大鼠中BAN2401和突变体的血浆药物暴露。以BAN2401、A17D/R79T和A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)单次静脉内注射后在施用后0.5小时、2天、7天、14天和28天的时间点收集的血浆水平。以μg/ml表示的血浆药物浓度显示在y轴(对数标度)上，以小时(h)表示的施用后时间显示在x轴上。显示的平均组值带有指示标准偏差的误差条。通过使用Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)的非隔室分析计算平均AUC

图7提供了以时间对浓度图呈现的食蟹猴中BAN2401、A17D/R79T_DI 3、A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8的经剂量修正的血浆药物暴露。以BAN2401单次静脉内输注施用后5分钟、1小时、2小时、8小时、24小时、2天、4天、7天、14天、21天和28天的时间点收集的抗体血浆水平，以及以A17D/R79T_DI 3、A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8单次静脉内输注施用后5分钟、2小时、8小时、24小时、3天、7天、14天、21天和28天的时间点收集的抗体血浆水平。与BAN2401(5mg/kg)相比，本发明的抗体在不同的研究中以不同的剂量(10mg/kg)施用于猴。因此，血浆暴露图已经经过剂量调整。以μg/ml每mg/kg注射剂量表示的剂量修正的血浆药物浓度显示在y轴(对数标度)上，以小时(h)表示的施用后时间显示在x轴上。显示的平均组值带有指示标准偏差的误差条。通过使用Phoenix WinNonlin 6.3(Pharsight)的非隔室分析计算剂量调整的平均AUC

图8提供了与本发明相关的氨基酸序列。

图9提供了分成两页的表，其中轻链可变链的氨基酸序列中VL-CDR1-3序列为灰色。BAN2401：SEQ ID NO：7。具有根据本发明的轻链可变链的新抗体：SEQ ID NO：8。这种可变轻链的具体实例：i)：SEQ ID NO：9；ii)：SEQ ID NO：10；iii)：SEQ ID NO：11；和iv)：SEQID NO：12。

图10提供了分成三页的表，其中重链可变链的氨基酸序列中VH-CDR1-3序列为灰色。BAN2401：SEQ ID NO：13。具有根据本发明的重链可变链的新抗体：SEQ ID NO：14。这种可变重链的具体实例：i)：SEQ ID NO：15；ii)：SEQ ID NO：16；iii)：SEQ ID NO：17；和iv)：SEQ ID NO：18。

图11提供了包括临床前的物种小鼠、大鼠和食蟹猴的BAN2401、A17D/R79T_DI 3、A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8的中心清除率(central clearance，CL)的简单异速生长尺度(allometric scaling)。将不同物种的CL分别对其重量(菱形)作图。回归线已被外推以指示在体重为70kg的男性中的CL。对于BAN2401，所测量的真实中心CL由空心正方形表示，并且偏离基于小鼠、大鼠和食蟹猴中BAN2401的CL的线性回归线。与本发明抗体的CL的优异的线性相关性相反，BAN2401显示出不良的CL的线性相关性，其表示不确定的半衰期预测。

具体实施方式

突变A17D、R79T和R82S代表BAN2401抗体中的位置，其中位置17、79和82中的氨基酸在可变轻链中被突变。

“BAN2401”是指小鼠抗体mAb158的人源化单克隆抗体，其包含具有如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的可变轻链和如SEQ ID NO：13所示的可变重链。BAN2401和mAb158二者及其特征，包括VL-CDR1-3和VH-CDR1-3描述在EP2004688中。BAN2401不包括在本发明中。

以下缩写意指：

BAN2401：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：7中所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的可变重链。

A17D：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T/R82S：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R82S：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 1：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 2：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 3：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 4：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 5：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 6：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 7：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

A17D/R79T_DI 8：包含以下部分的抗体：含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含：在轻链可变链位置17(Kabat位置17)处的氨基酸A、D、E、Q或功能类似物，在位置79(Kabat位置74)处的氨基酸R、T、K、A、G或功能类似物和在位置82(Kabat位置77)处的氨基酸R、S、C、G、N或功能类似物。功能类似物是与A(位置17)且分别与R(位置79和82)相比提供更低的pI值，而不会负面影响与抗原的结合的氨基酸。

本公开内容中的氨基酸序列如下所示：

SEQ ID NO：1：BAN2401的可变重链VH-CDR1。

SEQ ID NO：2：BAN2401的可变重链VH-CDR2。

SEQ ID NO：3：BAN2401的可变重链VH-CDR3。

SEQ ID NO：4：BAN2401的可变轻链VL-CDR1。

SEQ ID NO：5：BAN2401的可变轻链VL-CDR2。

SEQ ID NO：6：BAN2401的可变轻链VL-CDR3。

SEQ ID NO：7：BAN2401的可变轻链。

SEQ ID NO：8：本发明抗体中的通用可变轻链序列。

SEQ ID NO：9：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：10：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：11：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：12：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：13：BAN2401的可变重链。

SEQ ID NO：14：本发明抗体中的通用可变重链序列。

SEQ ID NO：15：本发明抗体中的特定可变重链序列。

SEQ ID NO：16：本发明抗体中的特定可变重链序列。

SEQ ID NO：17：本发明抗体中的特定可变重链序列。

SEQ ID NO：18：本发明抗体中的特定可变重链序列。

SEQ ID NO：19：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：20：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：21：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：22：本发明抗体中的特定可变轻链序列。

SEQ ID NO：23：包含在本发明抗体中的人IgG1恒定区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24：包含在本发明抗体中的人κ链恒定区的氨基酸序列。

BAN2401的可变轻链(SEQ ID NO：7)和本发明的抗体包含三个CDR-序列(VL-CDR1-3)：

VL-CDR1：RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO：4

VL-CDR2：KVSNRFS SEQ ID NO：5

VL-CDR3：FQGSHVPPT SEQ ID NO：6，

并且BAN2401的可变重链(SEQ ID NO：13)和本发明的抗体包含三个CDR-序列(VH-CDR1-3)：

VH-CDR1：SFGMH SEQ ID NO：1

VH-CDR2：YISSGSSTIYYGDTVKG SEQ ID NO：2

VH-CDR3：EGGYYYGRSYYTMDY SEQ ID NO：3。

根据本发明的一个方面，提供了结合Aβ初原纤维的抗体，其具有以下CDR序列组合：

并且包含具有SEQ ID NO：8的可变轻链，其中x

功能类似物是与A(x

可变重链具有SEQ ID NO：14所示氨基酸序列，其包含z

z

z

z

排除z

应当指出，基于本教导，本领域技术人员容易进行在每个位置对上述定义的特定氨基酸的功能类似物的鉴定，因为公开了根据本发明在特定位置引入氨基酸，以及测试所得产物的方法，例如关于对Aβ初原纤维的亲和力和其他重要的特征，参见下文。

因此，在本发明的一个方面，提供了对Aβ初原纤维具有亲和力的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有根据SEQ ID NO：8的可变轻链，其中

x

x

x

y

y

y

y

根据SEQ ID NO：14的可变重链，其中

z

z

z

排除x

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中

x

x

x

y

y

y

y

根据SEQ ID NO：14的可变重链，其中

z

z

z

排除x

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链包含选自以下的突变的组合：

x

x

x

x

x

x

x

排除x

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述可变轻链包含一个或更多个选自以下的突变：

x

x

x

x

x

x

x

其中y

y

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中y

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

排除其中y

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中，

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

根据本发明的一个方面，每个突变x

当x

当x

提供这样的可变轻链，与SEQ ID NO：7相比其包含以下的突变体组合：

x

x

x

x

x

x

x

其中参数x和y如上所定义。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体的轻链(SEQ ID NO：8)或其抗原结合片段在轻链可变链中仅包含突变X

A17D；或者

A17D和R79T；或者

A17D和R79T和R82S；或者

A17D和R82S；或者

R79T；或者

R79T和R82S；或者

R82S；

其中y

根据另一个实施方案，引入突变y

A17D和(y

A17D和(y

A17D和(y

A17D和(y

R79T(y

R79T和R82S和(y

R82S和(y

其中y

y

其他具体组合公开于SEQ ID NO：9-12。

根据本发明的抗体的重链可变链(VH)具有氨基酸序列SEQ ID NO：14，其中z

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NO：9-12中任一个所示氨基酸序列的可变轻链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NO：15-18中任一个所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自SEQ ID NO：9-12中任一个所示氨基酸序列的可变轻链；和选自SEQ IDNO：15-18中任一个所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

在该方面的一个实施方案中，提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或抗原结合片段包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA和IgE恒定区的重链恒定区或其任何等位基因变体，如讨论于Kabat等(Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)中的，其通过引用包括于本文中。任何这样的序列可以用于本发明。在一个更优选的实施方案中，抗体重链恒定区是IgG1。人IgG1恒定区的氨基酸序列是本领域已知的，并且在SEQ ID NO：23中示出。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体或抗原结合片段包含选自κ-和λ-链恒定区的轻链恒定区或其任何等位基因变体，如讨论于Kabat等(Kabat，E.A.，等(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH出版号91-3242)中的，其通过引用包括于本文中。任何这样的序列可以用于本发明。在一个更优选的实施方案中，抗体轻链恒定区是κ。人κ链恒定区的氨基酸序列是本领域已知的，并且在SEQ ID：24中示出。

在一个实施方案中，根据本发明的抗原结合片段是Fab片段，或F(ab′)

根据本发明的抗体或抗原结合片段可以包含上述定义的可变轻链和重链的任意组合。

根据本发明的一个方面，提供了改进的抗体或抗原结合片段，其对Aβ初原纤维具有高亲和力以用于治疗，例如通过向患有阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症或有发生这些疾病之风险的患者施用根据本发明的一种或更多种抗体或抗原结合片段，所述与Aβ蛋白聚集相关的其他病症例如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(dementia with Lewybody，DLB)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。合适的剂量可以在宽范围内变化，例如0.01至100mg/kg/剂，这取决于医学适应症和患者状态，施用途径，例如静脉内、皮下输注或通过局部施用，此外还有所选择的频率，例如单剂量、每日、每周、每季或甚至更低频率施用。

在一个方面，提供了用于治疗用途的本发明的抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，提供了用于治疗和/或预防阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症的本发明的抗体或其抗原结合片段。通常，这种其他病症可选自创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。

在一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症的药物中的用途。通常，这样的其他病症可选自创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。

在一个方面，提供了在人中减少Aβ初原纤维的量的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，提供了用于在患有阿尔茨海默病和其他与Aβ蛋白聚集相关的病症或有发生所述疾病之风险的对象中治疗和/或预防所述疾病的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。通常，这样的其他病症可选自创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。

“对象”通常是哺乳动物，例如人。其他哺乳动物代表这样的哺乳动物，其中兽医用途/治疗/预防将对其适用。

在一个方面，可以提供用于测量人中的Aβ初原纤维和/或聚集的Aβ蛋白的量的方法，其包括使所述人的组织或体液在体内或体外与本发明的标记抗体或其抗原结合片段接触，并测量与所述Aβ初原纤维和/或聚集的Aβ蛋白结合的抗体或抗原结合片段的量。所述抗体或抗原结合片段可以用放射性配体如I

在一个方面，可以提供用于在患有阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症或有发生所述疾病之风险的人中诊断所述疾病的方法，所述与Aβ蛋白聚集相关的其他病症例如创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)，所述方法包括使所述人的组织或体液在体内或体外与本发明的抗体或其抗原结合片段接触，并测量与聚集的蛋白结合的抗体或抗原结合片段的量。通常，所述与Aβ蛋白聚集相关的其他病症可选自创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(DLB)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。通常，通过将人的体液或组织与本发明的一种或更多种抗体或抗原结合片段的制剂接触，并测量与Aβ初原纤维结合的抗体或抗原结合片段的量，从而在体内或体外(在取自患者的样品中)进行分析。初原纤维的定量将用于上述疾病的诊断、各种治疗的跟进以及新药的开发。任选地，在这种制剂中的抗体或其抗原结合片段将用试剂标记，其将通过本领域已知的任何技术检测和测量，例如通过ELISA、Biacore分析和/或使用SPECT、PET、MRI成像。该抗体或抗原结合片段可以用放射性配体如I

根据本发明的另一方面，制备包含有效量的根据本发明的一种或更多种抗体或其抗原结合片段的药物组合物。包含根据本发明的抗体的医疗组合物除了有效量的抗体之外，还可以包含已知用于这种制剂的其他组分，例如缓冲剂、用于保存和稳定的组分。

在另一方面，可以提供本发明的抗体，以用于兽医用途。通常，所述兽医用途包括治疗和/或预防与Aβ蛋白聚集相关的病症。

根据本发明的另一方面，可以利用根据本发明的抗体与针对症状的治疗(例如乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂和5HT6抑制剂)相组合地提供治疗。

与其他疾病改善性治疗，如γ-分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitor，GSI)、γ-分泌酶调节剂(γ-secretase modulator，GSM)、β-分泌酶(β-secretase，BACE)抑制剂、BACE调节剂、疫苗、其他抗体、靶向tau或神经炎性进展的药物、抗高血压药等的组合为有效治疗提供了额外的可能性。

与营养产品的组合可以为有效治疗提供额外的可能性。

在一个方面，提供了包含本发明抗体以及可药用赋形剂和/或稀释剂的药物组合物，所述组合物还可包含另外的治疗剂。通常，所述另外的治疗剂可以选自乙酰胆碱酯酶抑制剂、NMDA拮抗剂、5HT6抑制剂、GSI、GSM、BACE抑制剂、BACE调节剂、疫苗、其他抗体、靶向tau或神经炎症进展的药物、抗高血压药和营养产品。该组合物可以以单一剂量或顺序剂量提供。

本发明将通过多个非限制性实施例来说明：

实施例1.抗体的产生和所使用的方法

参照抗体的产生

参照抗体BAN2401根据EP2004688中的前述方法产生。

本发明的抗体的产生

分别使用CHOK1SV GS和CHOK1SV GS-KO Xceed

通过使用常规方法合成突变体的轻链和重链编码区的序列。

对于CHOK1SV GS-KO Xeed

基本上根据制造商的建议在CHOK1SV GS-KO Xeed

为了使用CHOK1SV GS表达系统(Lonza)进行稳定转染，将重链基因连接到pEE6.4载体中并将轻链基因连接到pEE12.4载体中。将两个载体连接以形成双基因载体。用线性化的双基因载体通过电穿孔转染CHOK1SV细胞。实质上，根据制造商的建议进行转染。通过ELISA分析克隆的筛选和死亡培养物的生产力筛选。用补充有15％养料A和15％养料B(LifeTechnologies)的CD-CHO培养基进行生产。通过离心和无菌过滤收获上清液。使用蛋白G色谱法纯化澄清的细胞培养上清液，并将缓冲液交换为Dulbecco PBS(Gibco)。使用所产生的所有突变体的纯化材料通过尺寸排阻HPLC和SDS-PAGE进行产物的质量分析。

通过抑制ELISA进行的靶标结合分析

使用抑制ELISA分析本发明的抗体与BAN2401相比对Aβ初原纤维和Aβ单体的结合特性，其中抗体在溶液中与Aβ初原纤维或Aβ单体预孵育，然后转移到以Aβ包被的ELISA板，如Tucker等J Alzheimers Dis.2015；43(2)：575-88.doi：10.3233/JAD-140741.PubMedPMID：25096615及其中所引用的参考文献所述。

野生型小鼠的药代动力学研究

将8-10周龄雌性C57BL/6小鼠分组，并以10mg/kg的剂量单次静脉内(i.v.)注射BAN2401或本发明的抗体。在注射后30分钟至29天的不同时间点收集来自所有动物的血浆，并用于测量抗体浓度和随后计算药代动力学(pharmacokinetic，PK)参数。在终末血浆收集时间点处死小鼠。

大鼠的药代动力学研究

将8周龄雌性Sprague Dawley大鼠分组并以10mg/kg的剂量单次静脉内注射BAN2401或本发明的抗体。在注射后30分钟至29天的不同时间点收集来自所有动物的血浆，并用于测量抗体浓度和随后计算PK参数。在终末血浆收集时间点处死大鼠。

猴的药代动力学研究

将雄性食蟹猴分组(N＝3)并以5mg/kg BAN2401或10mg/kg本发明抗体进行单次静脉内输注。在注射后5分钟至28天的不同时间点收集所有动物的血清，并用于测量抗体浓度。通过ELISA测定BAN2401和本发明抗体的血清水平。将生物素化的Aβ1-42初原纤维加入到用于包被的固定有亲和素的微板上。封闭后，将猴血清样品加入孔中。洗去任何未结合的物质后，将碱性磷酸酶(alkaline Phosphatase，AP)标记的山羊抗人IgG加入孔中。在洗涤以除去任何未结合的试剂后，将对硝基苯基磷酸酯(用作AP的底物)加入到孔中。用氢氧化钠溶液终止反应，并在405nm和492nm处测量吸光度。以405nm处的吸光度减去492nm处的吸光度。通过标准曲线将该值转化为浓度，并用于随后计算PK参数。

用于测量Aβ抗体的直接ELISA

通过用于测量抗Aβ抗体的直接ELISA测量细胞培养基、纯化的抗体产物和在小鼠和大鼠PK研究中所收集的血浆中的BAN2401和本发明抗体的水平。将样品连续稀释，并在用Aβ1-40包被的微量滴定板孔中孵育，以允许BAN2401以及本发明抗体结合。使用辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)缀合的山羊抗人IgG作为检测抗体，并加入TMB(HRP的底物)。通过加入2M H

通过非隔室分析计算PK参数

使用具有Phoenix WinNonLin 6.3软件(Pharsight)的非隔室模型进行单独终末半衰期计算。用Phoenix-WinNonLin使用lin-up log-down法进行曲线下面积(AUC

统计分析

使用GraphPad Prism软件(v.6.04)进行单独确定的终末半衰期和AUC的组平均值的统计分析。在研究中使用单因素ANOVA，随后进行Bonferroni检验后多重比较。在以下显著性水平进行检验＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001和＊＊＊＊P＜0.0001。

实施例2.靶标结合特征

与BAN2401相比保留在A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S中的Aβ初原纤维的结合

如实施例1(抑制ELISA)中所述，通过抑制ELISA，在BAN2401(对照)之后分析本发明抗体的靶标结合谱。结果显示在图1中，其中显示了与Aβ单体相比，A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S以及BAN2401对Aβ初原纤维的结合和选择性的分析。结果显示与对Aβ单体的结合相比，本发明的抗体(A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S)结合Aβ初原纤维的结合和选择性得以保留。

实施例3.小鼠中抗体的药代动力学谱

在野生型小鼠中BAN2401、A17D、A17D/R79T、A17D/R82S、A17D/R79T/R82S的药代动力学研究

为了研究本发明的抗体在野生型小鼠中的药代动力学谱，对8-10周龄的C57BL/6雌性小鼠用单次静脉内注射给药10mg/kg BAN2401(N＝8)、A17D(N＝7)、A17D/R79T(N＝6)、A17D/R82S(N＝8)或A17D/R79T/R82S(N＝7)。在0.5小时、2天、7天、14或15天和28或29天后对动物取血，如实施例1所述地通过使用Aβ1-40进行捕获，并且用HRP偶联的山羊抗人IgG检测的ELISA(直接ELISA)分析BAN2401和本发明抗体的水平。与其他抗体相比，A17D/R82S在单独情况下开始的研究中施用。然而，将来自两个不同研究的血浆样品通过ELISA同时分析以避免测定间变异。

如图2中的时间相对于浓度图和表1中所示的计算的PK参数所示，本发明的抗体(A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S)的PK谱与BAN2401显著不同，特别是在注射后的前48小时内。而与BAN2401相比，对于A17D观察到作为曲线下面积(AUC

实施例4.大鼠中抗体的药代动力学谱

在大鼠中BAN2401、A17D、A17D/R79T和A17D/R79T/R82S的药代动力学研究

为了研究本发明的抗体在大鼠中的药代动力学谱，对8周龄的雌性SpragueDawley大鼠单次静脉内注射10mg/kg BAN2401(N＝3)、A17D(N＝4)、A17D/R79T(N＝6)或A17D/R79T/R82S(N＝5)。在注射后0.5小时、2小时、7小时、24小时、2天、4天、7天、14天和29天对动物取血。如实施例1所述地通过使用Aβ1-40进行捕获，并且用HRP偶联的山羊抗人IgG检测的ELISA(直接ELISA)分析BAN2401和本发明抗体的水平。在施用后的最初48小时期间野生型小鼠的血浆中导致低暴露的BAN2401水平的快速降低(图2)未在大鼠中见到，而BAN2401和本发明的抗体表现出相似的PK谱(图3)。对研究中所有大鼠单独计算的血浆半衰期和AUC

实施例5.去免疫化

BAN2401、A17D、A17D/R79T和A17D/R79T/R82S的离体全蛋白T细胞测定

为了评估在本发明抗体中引入的突变是否导致人中免疫原性应答的风险增加，通过离体全蛋白T细胞活化测定，在BAN2401之后分析A17D、A17D/R79T和A17D/R79T/R82S。EpiScreen

研究结果表明，BAN2401的免疫原性的总体潜在风险低，而A17D的总体潜在风险也大致(borderline)较低，两者应答为阳性的供体分别为8％和12％(表3)。对A17D/R79T和A17D/R79T/R82S的分析显示出某种程度预料不到的更高的免疫原性风险，因为增殖和IL-2分泌的合并频率分别是研究群组的24％和20％。

计算机模拟(in silico)的BAN2401的T细胞表位筛选

为了进一步解决由突变导致的免疫原性风险并找到用于去免疫化的相关位置，对BAN2401、A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S进行计算机模拟T细胞表位筛选。将BAN2401、A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S的可变区序列提供给AntitopeLtd(Cambridge，UK)，以通过其专有计算机模拟技术iTope

BAN2401、A17D、A17D/R79T、A17D/R82S和A17D/R79T/R82S的离体T细胞表位作图

为了验证由新突变导致的免疫原性风险并鉴定去免疫化的位置，使用EpiScreen

针对选自上一节所述的Episcreen

来自离体T细胞表位作图的数据支持了来自全抗体时程T细胞测定的结论，即A17D/R79T和A17D/R79T/R82S与免疫原性的整体风险的增加相关。此外，由于“表位8”中的R82S突变，A17D/R82S(不包括在全抗体T细胞测定中)似乎也具有增加的免疫原性风险。

通过离体T细胞表位作图鉴定为潜在T细胞表位的肽的去免疫化

通常，通过改变潜在II类MHC结合肽的重要锚定位置之一(9聚体的p1、p4、p6、p7和p9)的单个氨基酸来实现去免疫化。选择在上述离体肽作图中鉴定的三个表位(表位1、5和8)中的特定去免疫化突变。基于肽对II类MHC分子的结合口袋(binding pocket)的预期的结合亲和力的降低来选择取代。对于已被指示为潜在免疫原性的每种肽测试两个去免疫化取代，并且使用Episcreen

使用测量

＊)未去免疫化的抗体

设计和生产A17D/R79T的去免疫化变体

基于来自上述T细胞表位作图和肽去免疫化的结果设计A17D/R79T的8个去免疫化变体。在鉴定为潜在免疫原性的所有三个表位中，在表5所示的组合中引入了显示在离体T细胞表位作图中降低免疫原性的去免疫化突变。

实施例6.去免疫化抗体的靶标结合特征

相比于BAN2401，A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)中保留的Aβ初原纤维结合

通过实施例1所述的抑制方法(抑制ELISA)在BAN2401(对照)之后分析A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)的靶标结合谱。结果示于图4中，其中显示了对于A17D/R79T_DI 1-8和BAN2401，相比于与Aβ单体结合，其与Aβ初原纤维的结合和选择性的分析。结果显在本发明的抗体(A17D/R79T_DI 1-8)中，与和Aβ单体的结合相比，其结合Aβ初原纤维的结合和选择性得以保留。

实施例7.在小鼠中去免疫化抗体的药代动力学谱

在野生型小鼠中BAN2401、A17D/R79T和A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)的药代动力学研究

为了在野生型小鼠中比较A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)的PK谱与BAN2401和A17D/R79T的PK谱，将8-10周龄的C57BL/6雌性小鼠分组(N＝5)并进行10mg/kg抗体的单次静脉内注射。在0.5小时、2天、7天、14天和28天后对动物进行取血，并如实施例1所述地通过使用Aβ1-40进行捕获，并且用HRP偶联的山羊抗人IgG检测的ELISA(直接ELISA)分析BAN2401和本发明抗体的水平。如图5中的时间相对于浓度图所示，A17D/R79T的去免疫化突变体(A17D/R79T_DI 1-8)的PK谱与A17D/R79T的PK谱相似，并且不同于BAN2401。结果表明，与BAN2401相比，A17D/R79T和去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)的AUC

实施例8.大鼠中去免疫化抗体的药代动力学谱

在大鼠中BAN2401、A17D/R79T和A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79TDI 1-8)的药代动力学谱

为了在大鼠中比较A17D/R79T的8个去免疫化变体(A17D/R79T_DI1-8)的PK谱与BAN2401和A17D/R79T的PK谱，将8周龄的雌性Sprague Dawley大鼠分组(N＝5)并进行10mg/kg抗体的单次静脉内注射。在0.5小时、2天、7天、14天和28天后对动物进行取血，并通过使用Aβ1-40进行捕获，并且用HRP偶联的山羊抗人IgG检测的ELISA(实施例1，直接ELISA)分析BAN2401和本发明的抗体的水平。

如图6所示，BAN2401、A17D/R79T和A17D/R79T的去免疫化变体(A17D/R79T_DI 1-8)在大鼠中显示出相当相似的PK谱。结果表明，在大鼠中，与BAN2401相比，A17D/R79T_DI 1具有比BAN2401显著更长的终末半衰期(p＜0.05)，而A17D/R79T、A17D/R79T_DI 1和A17D/R79T_DI 4的AUC

实施例9.猴中去免疫化抗体的药代动力学谱

在食蟹猴中BAN2401、A17D/R79T_DI 3、A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8的药代动力学谱。

为了在猴中比较A17D/R79T_DI 3、A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8的PK谱与BAN2401的PK谱，将雄性食蟹猴分组(N＝3)并进行5mg/kg BAN2401或10mg/kg本发明抗体的单次静脉内输注。对注射BAN2401的猴在施用5分钟、1小时、2小时、8小时、24小时、2天、4天、7天、14天、21天和28天后取血，而注射本发明抗体的猴在5分钟、2小时、8小时、24小时、3天、7天、14天、21天和28天后取血。如实施例1所述通过ELISA分析(直接ELISA)施用的抗体的血浆浓度。PK谱显示为图7中的时间相对于浓度图，而所有抗体的半衰期和AUC

实施例10.简单异速生长尺度-小鼠、大鼠和猴子至人

为了预测本发明的抗体(这里显示为A17D/R79T_DI 3、A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8)的人体半衰期，进行2隔室模型和简单异速生长尺度。使用Phoenix WinNonlin6.3(Pharsight)将2隔室模型应用于BAN2401和本发明抗体的血浆PK谱，以估计小鼠、大鼠和猴中的清除率(clearance，CL)和体积(volume，V)值。将CL和V值相对于体重作图，并应用简单异速生长尺度(Deng等mAbs 2011：3(1)：p.61-66.doi：10.4161/mabs.3.1.13799)。终末半衰期按下式计算：

在体积或清除率的简单异速生长尺度中，将临床前物种中的估计参数值相对于体重作图。使用来自回归线的常数和指数预测体重为70kg的人中的V和CL。回归线的指数(其优选地应为清除率约0.85，体积约为1)和依附性(adherence)两者均是对人中特定参数进行估计的置信度量度。

如图11所示，BAN2401在所测试的物种之间的中心CL具有不良线性相关性，导致不确定的简单异速生长尺度。与指数的偏差(其应接近0.85)表明，不良相关性受到小鼠中对BAN2401的高清除率的影响。这导致低估了人中的预期CL，因此高估了预测的终末半衰期。BAN2401的终末半衰期估计为41天，其与在临床中测量的半衰期(5-7天)相当偏离。BAN2401的实际CL已在图11中显示(空心正方形)。与小鼠、大鼠和食蟹猴之间BAN2401的不良线性相关性相反，本发明的抗体(A17D/R79T_DI 3、A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8)显示出极好的相关性(图11)。对于A17D/R79T_DI 3，A17D/R79T_DI 4和A17D/R79T_DI 8，根据预测的人PK参数计算的终末半衰期分别为13、15和20天的人体半衰期。对于BAN2401和本发明的抗体，体积(V)的简单异速生长尺度表现出良好的线性相关性和约为1的指数(未示出)。

本发明的抗体在物种之间显示出CL的线性相关性，具有更可信的异速生长尺度，并且它们表现得像其他治疗性IgG1一样，如贝伐单抗、奥马珠单抗和曲妥珠单抗(如Deng等，Expert Opin.Drug Metab.Toxicol8(2)(2012)：p.141-160所述)，其在人中的半衰期为约15至30天。与BAN2401(其在小鼠和人中具有与许多其他治疗性IgG1偏离的不太理想的PK谱)相反，本发明的抗体已经工程化，导致在小鼠中归一化的PK谱。其在小鼠、大鼠和食蟹猴中显示出类似于其他治疗性IgG1的PK谱和半衰期，在人中具有约15至30天的半衰期。这一发现表明，本发明的抗体在小鼠中的延长的半衰期将转化到人中。

本发明还涉及以下各项实施方案(它们对应于原申请的权利要求书)：

1.对Aβ初原纤维具有亲和力的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有根据SEQ ID NO：8的可变轻链，其中

x

x

x

y

y

y

y

根据SEQ ID NO：14的可变重链，其中

z

z

z

排除x

2.根据实施方案1所述的抗体或抗原结合片段，其中

x

x

x

y

y

y

y

根据SEQ ID NO：14的可变重链，其中

z

z

z

排除x

3.根据实施方案1或2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述轻链a包含选自以下的突变的组合：

x

x

x

x

x

x

x

排除x

4.根据实施方案1至3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述可变轻链包含一个或更多个选自以下的突变：

x

x

x

x

x

x

x

其中y

y

5.根据实施方案1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中

x

x

x

y

y

y

y

z

z

z

排除其中y

6.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

7.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

8.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

9.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

10.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：15所示氨基酸序列的可变重链。

11.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

12.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

13.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的可变轻链；和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的可变重链。

14.根据实施方案1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段包含IgG重链恒定区。

15.根据实施方案1至14中任一项的抗体，其用于医疗。

16.根据实施方案1至14中任一项的抗体，其用于治疗和/或预防阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症。

17.根据实施方案16所使用的抗体，其中所述与Aβ蛋白聚集相关的其他病症选自创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。

18.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体在制备用于治疗和/或预防阿尔茨海默病和与Aβ蛋白聚集相关的其他病症的药物中的用途。

19.根据实施方案18所述的用途，其中所述与Aβ蛋白聚集相关的其他病症选自创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)。

20.减少对象中Aβ初原纤维的量的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的根据实施方案1至14所述的抗体或抗原结合片段。

21.用于在患有阿尔茨海默病或有发生阿尔茨海默病之风险的对象中治疗和/或预防所述疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的根据实施方案1至14所述的抗体或抗原结合片段。

22.用于在患有创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)或有发生所述疾病之风险的对象中治疗和/或预防所述疾病的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的根据实施方案1至14所述的抗体或抗原结合片段。

23.用于测量人中Aβ初原纤维和/或聚集的Aβ蛋白的量的方法，其包括在体内或体外使所述人的组织或体液与根据实施方案1至14所述的抗体或抗原结合片段接触，并测量与所述Aβ初原纤维和/或聚集的Aβ蛋白结合的所述抗体或抗原结合片段的量。

24.用于在患有阿尔茨海默病或有发生阿尔茨海默病之风险的人中诊断所述疾病的方法，其包括在体内或体外使所述人的组织或体液与根据实施方案1至14所述的抗体或抗原结合片段或其片段接触，并测量与聚集的Aβ蛋白结合的所述抗体的量。

25.用于在患有创伤性脑损伤(TBI)、路易体痴呆(LBD)、唐氏综合征(DS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞痴呆、tau蛋白病、系统性淀粉样变性、动脉粥样硬化和帕金森氏病痴呆(PDD)中任一种或有发生所述疾病之风险的人中诊断所述疾病的方法，其包括在体内或体外使所述人的组织或体液与根据实施方案1至14所述的抗体或抗原结合片段或其片段接触，并测量与聚集的Aβ蛋白结合的所述抗体的量。

26.药物组合物，其包含根据实施方案1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及可药用赋形剂和/或稀释剂。

27.根据实施方案1至14中任一项的抗体，其用于兽医用途。

序列表

<110> BioArctic Neuroscience AB

Eisai R&D Management Co., Ltd.

<120> 改进的Aβ初原纤维结合抗体

<130> P141879WO00

<140> PCT

<141> 2015-07-08

<150> US 62/022952

<151> 2014-07-10

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 1

Ser Phe Gly Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 2

Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 3

Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 7

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Ala Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(13)

<223> Xaa可以是Val或Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(17)

<223> Xaa可以是Ala, Asp, Glu, Gln或其功能类似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(21)

<223> Xaa可以是Ile或Val

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (79)..(79)

<223> Xaa可以是Arg, Thr, Lys, Ala, Gly或其功能类似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (81)..(81)

<223> Xaa可以是Ser或Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (82)..(82)

<223> Xaa可以是Arg, Ser, Cys, Gly, Asn或其功能类似物

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (84)..(84)

<223> Xaa可以是Glu或Asp

<400> 8

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Xaa Thr Pro Gly

1 5 10 15

Xaa Pro Ala Ser Xaa Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile

65 70 75 80

Xaa Xaa Val Xaa Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 9

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Gln Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Val Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Asp Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 11

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Gln Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Asp Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 13

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (37)..(37)

<223> Xaa可以是Val或Ile

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> Xaa可以是Arg或Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> Xaa可以是Ala, Asn或Thr

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Asn Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Gly Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Tyr Tyr Thr Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 19

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 20

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 21

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 21

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 22

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成多肽

<400> 22

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Pro Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 23

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105