一种单光束近简并四波混频显微镜装置及方法

技术领域

本发明属于非线性光学显微技术领域，具体涉及一种单光束近简并四波混频显微镜装置及方法。

背景技术

四波混频的过程中当探测波和泵浦光具有相同的频率时，即四列波的频率相同时被叫做简并四波混频。在实际的应用中探测波和泵浦波往往具有一定的频率差，而当他们的频率差比任意一列参与混频的频率都小的多的时候被称为近简并四波混频过程。

现有单光束近简并四波混频显微镜由一台飞秒激光器作为光源输出激光，在通过脉冲整形器时用黑色挡板将部分波长比较短的激光过滤掉后，然后通过两个倒置的三棱镜后可以有效补偿激光在光路中产生的色散。所得到的激光通过一组透镜后导入扫描显微镜，并将光束聚焦于样品上，然后通过透镜以光谱的形式记录到光谱仪上，进而实现检测实验样本的目的。近简并四波混频显微镜在优化相位匹配条件时提供了两种不同的机制。首先，由于近简并，折射率可以被视为在如此窄的频率范围内几乎不变。这种近乎完美的相位匹配条件导致相干长度比焦距长，并导致整个聚焦体积中几乎完全的相长干涉。

现有单光束近简并四波混频显微镜由于采用脉冲整形的方法实现短波长的滤波，该装置结构复杂、体积庞大，不方便人们的使用，成本也高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种单光束近简并四波混频显微镜装置及方法，利用长通超陡滤波片简化单光束近简并四波混频显微镜的方法，以解决现有单光束近简并四波混频实验装置存在的系统复杂、体积庞大所引起的不方便使用以及成本高的问题，从而实现进一步简化单光束近简并四波混频实验装置、减少成本的目的。

本发明采用以下技术方案：

一种单光束近简并四波混频显微镜装置，包括钛宝石激光器，自制钛宝石激光器发射的激光脉冲经过一对棱镜对进行色散补偿后，通过一个超陡长通滤波片在781nm处截断，然后再经二向色镜反射后经物镜聚焦于待测样品上，待测样品上的反射信号被物镜收集并依次透过二向色镜和带通滤波片后导入第一光电倍增管；待测样品上的透射信号通过聚光透镜汇聚，然后经分束镜分成透射光束和反射光束，透射光束经第一超陡短通滤波片滤掉入射激光，然后通过透镜聚焦并导入高分辨集成光谱仪记录光谱数据；反射光束经反射镜反射后透过第二超陡短通滤波片滤波，最后导入第二光电倍增管进行四波混频成像。

具体的，激光脉冲的脉冲宽度为10～30fs，中心波长为793～808nm，带宽为40～65nm。

具体的，将棱镜对中的一个放置于一维精密平移台上，通过一维精密平移台调节棱镜对之间的距离实现对激光色散的精密补偿。

具体的，待测样品设置在二维精密平移台上，通过二维精密平移台移动待测样品实现二维扫描。

具体的，聚光透镜置于三维精密平移台上，通过三维精密平移台调节聚光透镜的位置。

本发明的另一个技术方案是，一种单光束近简并四波混频显微镜装置的实验方法，包括以下步骤：

S1、粗调钛宝石激光器的光路直至从光谱仪或光电倍增管看到四波混频信号；

S2、优化脉冲压缩器中棱镜对的相对位置，使得待测样品上激光的色散被完全补偿，四波混频信号增大至不能增大为止；

S3、通过高分辨集成光谱仪观测四波混频信号的变化，调节反射镜的角度使激光与显微物镜匹配，直至四波混频信号不再增大；

S4、调节光谱仪的光纤角度使光耦合效率达到最高值，通过逐点移动二维平移台实现待测样品的成像。

具体的，步骤S2中，调节放置棱镜的一维精密平移台的距离，同时通过高分辨集成光谱仪观测四波混频信号的变化，直至四波混频信号不能被增大，优化脉冲压缩器中棱镜对位置。

具体的，步骤S3中，调节放置聚光透镜的三维精密平移台，同时通过高分辨集成光谱仪观测四波混频信号的变化，直至四波混频信号不再增大。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明一种单光束近简并四波混频显微镜装置，利用了超陡长通滤波片具有的多功能特性，即不仅具有普通长通滤波片除去入射激光波长较短的部分谱的特性，而且可以利用超陡长通滤波片在入射飞秒脉冲光谱上锐利地“截断”产生超陡“边缘”的频率附近产生最大的四波混频信号。进而可以代替现有近简并四波混频显微镜装置中起着过滤短波作用的脉冲整形器的部分，这样将脉冲整形器部分换成超陡长通滤波片后，不仅简化了单光束近简并四波混频显微镜系统，使其更加紧凑、灵巧易操作，同时大大地降低了实验装置的成本，为商业化应用铺平了道路。另外伴随系统体积的缩小，由于一组超陡长通滤波片和短通滤波片的结合使用使得整个系统的信噪比也会有所提升。这种显微技术可以实现高灵敏度和高的空间分辨率的无标记生物样品成像。

进一步的，激光脉冲的参数设置中脉冲宽度为10～30fs，中心波长为793～808nm，带宽为40～60nm，平均功率约1mW，是所需激光功率小，因而对生物样品的光毒性小，同时由于是近红外激光，具有较高空间分辨率。

进一步的，棱镜放置于一维精密平移台便于精密调节棱镜对之间的距离，从而补偿激光在光学元件上的色散。

进一步的，待测样品设置在二维精密平移台上设置的目的是便于精密控制待测样品的位置，以便进行二维扫描成像。

进一步的，聚光透镜置于三维精密平移台设置的目的是可以精密调节其位置，以便将产生的四波混频信号尽可能多地收集起来。

一种单光束近简并四波混频显微镜装置的实验方法，整个方法步骤设置的目的是逐渐、有序地获得四波混频信号，并将之增大，最后优化。

综上所述，本发明具有结构简单、廉价、易操作的特点。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为利用超陡长通滤波片简化后的单光束近简并四波混频显微镜实验装置示意图；

图2为小鼠大脑的近简并四波混频光谱图；

图3为利用超陡滤波片简化的单光束近简并四波混频显微镜实现小鼠大脑的显微成像图。

其中：1.钛宝石激光器；2.棱镜对；3.超陡长通滤波片；4.二向色镜；5.物镜；6.待测样品；7.带通滤波片；8.第一光电倍增管；9.聚光透镜；10.分束镜；11.第一超陡短通滤波片；12.透镜；13.高分辨光谱仪；14.反射镜；15.第二超陡短通滤波片；16.第二光电倍增管。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“一侧”、“一端”、“一边”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在附图中示出了根据本发明公开实施例的各种结构示意图。这些图并非是按比例绘制的，其中为了清楚表达的目的，放大了某些细节，并且可能省略了某些细节。图中所示出的各种区域、层的形状及它们之间的相对大小、位置关系仅是示例性的，实际中可能由于制造公差或技术限制而有所偏差，并且本领域技术人员根据实际所需可以另外设计具有不同形状、大小、相对位置的区域/层。

请参阅图1，本发明提供了一种单光束近简并四波混频显微镜装置，包括钛宝石激光器1、棱镜对2、超陡长通滤波片3、二向色镜4、物镜5、待测样品6、带通滤波片7、第一光电倍增管8、聚光透镜9、分束镜10、第一超陡短通滤波片11、透镜12、高分辨光谱仪13、反射镜14、第二超陡短通滤波片15和第二光电倍增管16。

自制钛宝石激光器1发射的激光脉冲经过一对棱镜对2进行色散补偿后，通过一个超陡长通滤波片3在781nm处截断，然后经过一个二向色镜4反射后经物镜5聚焦于待测样品6上，待测样品6上的反射信号被物镜5收集并依次透过二向色镜4和带通滤波片7后导入第一光电倍增管8；待测样品6上的透射信号通过聚光透镜9汇聚，然后经分束镜10分成透射光束和反射光束，透射光束经第一超陡短通滤波片11将入射激光滤掉，然后通过透镜12聚焦并导入高分辨集成光谱仪13，通过Labview软件记录光谱数据，并利用Matlab软件进行数据处理；反射光束经反射镜14反射后透过第二超陡短通滤波片15滤波，最后导入第二光电倍增管16进行四波混频成像。

激光脉冲的脉冲宽度为10～30fs，优选20fs，中心波长为793～808nm，优选800nm，带宽为40～65nm，优选60nm。

棱镜对2(Thorlabs，AFS-SF10)放置于一维精密平移台(Thorlabs，PT1B)上。

超陡长通滤波片3为Semrock LP02-785RE；二向色镜4为Semrock FF735-Di01，物镜5为Newport，20，0.4NA。

待测样品6被固定于一个二维精密平移台上，二维精密平移台的型号为Mad CityLabs,Inc.Nano-Bios。

带通滤波片7为Chroma ET520/40m；

聚光透镜9置于三维精密平移台上，聚光透镜9的型号为Edmund Optics，0.5NA，第三三维精密平移台的型号为Mad City Labs，Inc.Nano-Bios。

第一超陡短通滤波片11的型号为Semrock SP01-785RU，高分辨集成光谱仪13的型号为Jobin Yvon Triax 320；第二超陡短通滤波片15的型号为Semrock SP01-785RU。

本发明一种单光束近简并四波混频显微镜装置的实验方法，包括以下步骤：

S1、粗调光路直至从光谱仪或光电倍增管看到四波混频信号；

S2、优化脉冲压缩器中棱镜对的相对位置使得样品上激光的色散被完全补偿，这时四波混频信号逐渐增大，直到不能增大为止；

S3、调节反射镜使得激光与显微物镜匹配到最佳，同时观测四波混频信号的变化；该过程还需要辅助地调节聚光透镜的位置使其达到最佳位置；

S4、调节光谱仪的光纤角度使其光耦合效率达到最高值。这时光路调节到了最优状态，可以通过逐点移动二维平移台实现样品的成像。

对于每个扫描点，设置像素停留时间200微秒，空间分辨率为1微米。然后记录每个点的电压值并将其通过数值/模拟信号转换器导入电脑进行数据处理实现二维成像。然后设置层间步长1微米，扫描多层后将所有二维图像按照相等步长叠加起来构建成三维立体图形，这样就可以观测样品结构的空间分布。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中的描述和所示的本发明实施例的组件可以通过各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图2和图3，利用超陡滤波片简化的单光束近简并四波混频光谱以及显微成像方法具体为：

(1)启动激光，待激光稳定后，将约1mW的激光脉冲1导入待测样品6；调节棱镜对2(置于脉冲压缩器中)之间的相对距离优化光谱仪13测量的四波混频光谱，直到最强，这时色散得到补偿；调节物镜6的位置和聚光透镜9的位置，以及调节透镜12的位置使得四波混频光谱强度最大；同时移动第一、第二光电倍增管的位置，使得所测信号电压、电流最大。

(2)利用高分辨集成光谱仪13记录待测样品6(小鼠大脑组织，100微米厚的薄片)的的四波混频光谱，积分时间为500ms，然后利用Matlab软件进行数据处理并画图，如图2所示，积分时间为500ms，入射激光功率为1mW；

(3)同时记录第一光电倍增管8和第二光电倍增管15的信号，并将待测样品6(小鼠大脑组织)上任意一点的电压/电流值，转化为数字信号。其中，得到的模拟信号通过PCI卡(National Instruments DAQ-6024E)转换为数字信号，然后利用Labview软件进行记录并用Matlab进行数据处理。

当物镜与待测样品6的相对距离不变时，并且以待测样品6所在水平面为坐标平面建立xoy坐标系，光斑在样品上位置的坐标就可以一一确定下来。当光斑所在样品位置坐标的y值是某恒定值时，逐渐增加施加给待测样品6所在精密平移台x轴方向的电压值，光斑的x值以步长为1微米平移，同时记录100个x值时的第一光电倍增管8和第二光电倍增管15的信号。同样地，y＝y+1微米时，再次同时记录100个不同x值时的值时的第一光电倍增管8和第二光电倍增管15的信号。一直到y＝y+100微米时，再次同时记录100个不同x值时的值时的第一光电倍增管8和第二光电倍增管15的信号。这样，我们扫描了100微米

综上所述，本发明一种单光束近简并四波混频显微镜装置及方法，具有简单、廉价和易操作的优势，以及具有较高空间分辨率和信号灵敏度。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。