CrePR1-P2A与CrePR1-IERS2质粒构建效率的比较方法

技术领域

本发明属于生物分子技术领域，涉及利用百奥赛图质粒的构建与转染技术来比较P2A，IERS质粒构建效率的方法。

背景技术

IERS2与P2A属于连接工具片段的连接域，不同的连接域有着不同的效率。由于市场中的工具小鼠大多为CrePR1-IERS2质粒构建，而P2A在市场的工具小鼠非常少。传统现有技术没有看到CrePR1-P2A与CrePR1-IERS2质粒构建效率的比较。

顺反子是在自然界中是单表达的，如果同时让基因工程编辑的多个顺反子表达，必须要有内部核糖体进入位点(internal ribosome entry"site,IRES)与自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide,2A)连接。多个顺反子表达可以达到鼠或人的细胞同时表达两个及以上的基因。Cre基因是基因工程鼠中最常用的工具系统，在细胞核内翻译成Cre-mRNA,在细胞质翻译成Cre酶来在细胞核内工作，具有催化活性。Cre酶可以特异性识别loxPDNA识别位点，使得loxP位点识别或重组。Td-tomato是红色荧光蛋白，其序列可以通过连接序列连接Cre位点，使得申请人在质粒中看到Cre酶的原位表达区域。而本申请可以连接mROSA-LSL-EGFP Vector使得Cre酶看到追踪的区域，来显示其表达效率。

发明内容

本发明的目是：为了解决P2A和IERS2在蛋白连接域的效率比较问题。提出一种CrePR1-P2A与CrePR1-IERS2质粒构建效率的比较方法，实现这个问题可以在构建各个转基因的模式物种(小鼠，大鼠，兔子，猴子等)中发挥非常大的作用。

本发明的技术方案如下：

CrePR1-P2A与CrePR1-IERS2质粒构建效率的比较方法，其特征在于：

在细胞系NIH3T3中转染mROSA-LSL-EGFP质粒，并且同时转染LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato或LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato，在RU486米非司酮诱导下激活PR1孕激素受体，即可激活转染有两个质粒的细胞内mTmG体系，从而可以进行P2A与IERS2的体系比较。

所述的转染成功的细胞在溶解有2.33umol/ml RU486药物米非司酮的二甲亚砜中激活PR1孕激素受体。

进行P2A与IERS2的体系比较后，决定在构建转基因的蛋白连接域中连接哪一个连接域。通过用膜蛋白中表达mT的新生鼠即mTmG小鼠来分表皮，建立mTmG纤维细胞。

所述细胞系NIH3T3在传代之后转染质粒。

本发明所采用的技术方案是与百奥赛图合作的质粒利用mROSA-LSL-EGFP，LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato和LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato来控制用一定量的RU486来控制表达效率。通过mROSA-LSL-EGFP质粒在Cre酶的激活下才可以实现激活EGFP，所以在细胞系NIH3T3中转染mROSA-LSL-EGFP质粒，并且同时转染LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato或LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato，在药物米非司酮的诱导下可以激活PR1(孕激素)受体。横向比较P2A与IERS，我们可以决定在构建转基因的蛋白连接域中连接哪一个连接域。

本发明的效果是：本发明提供了一个工具质粒转染之后药物启动控制(在某一个特定的RU486浓度可以激活系统)的方法，可以横向判断不同的连接域的效率并且进行比较。本方法可以为转基因的动物模型创建奠定了一定的基础。

附图说明

图1是Cre病毒转染到mTmG过程图。

图2是Cre病毒的感染mTmG成纤维细胞效率图。

A，C，E.培养的mTmG纤维细胞只加入1微升PBS作为对照，正常培养，A，对照组红色通道，C，对照组绿色通道，E图为红绿两通道叠加图。B，D，F.实验组培养的mTmG成纤维细胞加入1微升Ad-cre病毒，正常培养；B.实验组红色通道，D.实验组绿色通道，F.实验组红绿两通道叠加图。

图3是小鼠细胞NIH3T3传代之后转染两种质粒过程图。

图4是本实验IRES2和P2A在药物诱导之前的形态变化图。

图5为本实验对照在24小时之后IRES和P2A在药物诱导的形态变化。

图6为本实验IRES2实验组在24小时之后药物诱导的形态变化图。

图7为本实验P2A实验组在24小时之后药物诱导的形态变化图。

图8为LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步说明，但应该理解本发明的保护范围并不受具体实施例的限制。

图1是用膜蛋白中表达mT的新生鼠(mTmG小鼠)来分表皮，建立mTmG纤维细胞的建立，可以使得Cre病毒可以转染到mTmG中，来验证mTmG系统的可用性。

具体实验步骤如下

1、取新生mTmG品系小鼠(杰克逊小鼠)来分表皮、用50ml离心管装新生小鼠。

2、细胞间tap water×2,用75％酒精消毒×2，超净台中泡入PBS，涮洗2遍。

3、泡入10cm皿中PBS，并且拿手术剪在皿盖上剪取背部皮肤。剪下的皮放入新PBS中，死胎放入50ml离心管中。

4、用镊子将脂肪组织剃走，再涮PBS。

5、在干净的皿中，加入0.3％CollagenasedispaseII，滴状，将皮放上，铺展开，37℃孵育60-80min。

6、加入等量加血清的培养基终止反应，过滤网过滤细胞并计数，4℃，1300rpm，5min。

7、冻存部分细胞后把另一部分接种在另一个24孔板上，加Ad-cre病毒(10

图2表示了感染效率，在对照中，mTmG成纤维细胞没有被感染。但是在Cre病毒的感染下，mTmG成纤维细胞细胞膜由红色变为绿色。

A，C，E.培养的mTmG纤维细胞只加PBS作为对照，A.对照组红色通道，C.对照组绿色通道，E图为红绿两通道叠加图。B，D，F.实验组培养的mTmG成纤维细胞加入1微升Ad-cre病毒，B为实验组红色通道，D.为实验组绿色通道。F图为实验组红绿两通道叠加图。病毒处理12h后，实验组mTmG成纤维细胞表达绿色荧光，且红色荧光表达变弱，证明了Ad-cre病毒感染后确实能使mTmG成纤维细胞的红色荧光转变为绿色荧光。

A.对照组(只加1ul PBS)的红色通道；B.实验组(加1ulAd-cre病毒)的红色通道；C.对照组(只加1ul PBS)的绿色通道；D.实验组(加1ulAd-cre病毒)的绿色通道；E.对照组(只加1ul PBS)的红绿两通道叠加图；F.实验组(加1ulAd-cre病毒)的红绿两通道叠加图；

图3显示取小鼠细胞NIH3T3，在六孔板中传代之后转染两种质粒。1.为mROSA-LSL-EGFP，LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato，2.为mROSA-LSL-EGFP和LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato。根据实验建造的mTmG的细胞，可以看到被转染的细胞表达的情况。具体过程如下：

1.取NIH3T3细胞品系来进行转染实验，解冻细胞铺在细胞6孔皿板上。并选择一部分来冻存。

2.取另一部分的NIH3T3细胞来做转染实验。NIH3T3中用lippo2000转染试剂来mROSA-LSL-EGFP质粒，并且同时转染LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato或LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato。得到分别为mROSA-LSL-EGFP；LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato与mROSA-LSL-EGFP；LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato。看到细胞由无色变为红色，代表着Tdtomato已经转染成功。

3.在转染成功的细胞加入RU486溶于二甲亚砜中，浓度2.33umol/ml浓度中，即可可以激活转染有两个质粒的细胞内mTmG体系，从而可以进行P2A与IERS2的体系比较。

图4是本实验IRES2和P2A在药物诱导之前的形态变化。

左上和左下图分别为IRES转染之后药物诱导之前的红色通道和绿色通道，可以看到细胞诱导成为了红色。右上和右下图分别为P2A转染之后药物诱导之前的红色通道和绿色通道，可以看到细胞诱导成为了红色。

图5为本实验对照在24小时之后IRES和P2A在药物诱导的形态变化。左上和左下图分别为IRES转染，经过实验对照(DMSO)之后药物诱导之前的红色通道和绿色通道，可以看到细胞红色没有变为绿色。右上和右下图分别为P2A转染之后药物诱导之前的红色通道和绿色通道，可以看到细胞红色没有变为绿色。

图6为本实验IRES2实验组在24小时之后药物诱导的形态变化(此图有三个分图，请说明每个分图的含义及其能说明什么问题)左上图分别为IRES转染后被DMSO溶解RU486激活的红色通道图。左下图分别为绿色通道图。右图为整合通道图。

图7为本实验P2A实验组在24小时之后药物诱导的形态变化。左上图分别为P2A转染后被DMSO溶解RU486激活的红色通道图。左下图分别为绿色通道图。右图为整合通道图。

图8为LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato的示意图。

这是本说明书的质粒图谱：可以看到LR跟RR是同源臂:克隆方法:多克隆位点，限制性内切酶。载体标签:Tdtomato。载体抗性:氨苄青霉素(Ampicillin)含loxP，CrePR1元件。

实施例1由于DMEM完全培养基的选择作用，在幼鼠分的真表皮混和物种留下真皮中的成纤维细胞。利用Cre病毒的感染特性，用1ul 10八次方IFU感染六孔板的细胞，在两天之后进行观察发现Cre病毒的感染特性。证明mTmG在细胞层面的实用性。在本实验中申请人可以把mT(Tdtomato)转化成为mG(GFP)。

实施例2本申请发明人从序列数据进行分，MuzumdarMD,TasicB,MiyamichiK,LiL,Luo LQ.A global double-fluorescent cre reporter mouse.Genesis(New York,NY:2000).2007；45(9):593-605.PubMed PMID:WOS:0002503656，结果结构如图所示。根据结构申请人调用三款在百奥赛图的质粒来模拟MTMG的条分别为mROSA-LSL-EGFP，LScKO-SG-CrePR1-IERS2-tdtomato：和LScKO-SG-CrePR1-P2A-tdtomato。最后得到的结果是根据序列构建，把本实验的mTmG序列运用于质粒构建中，分为LScKO-SG-CrePR1-IRES/P2A-tdtomato与mROSA-LSL-EGFP。

实施例3根据质粒的不同，申请人根据自己所摸索的RU486米非司酮浓度来判断P2A和IERS2的效率。由于溶于溶剂二甲亚砜里，是具有一定毒性的，所以溶解合适量的米非司酮和低剂量的二甲亚砜，也是本申请的创新点之一。本实验摸索出RU486的最佳浓度为2.33umol/ml(溶剂为二甲基亚砜)，即可激活转染有两个质粒的细胞内mTmG体系，从而可以进行P2A与IERS2的体系比较。最后得到了P2A的体系确实优于IERS2。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进。这些改进也将落入本发明权利要求的保护范围内。