用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法。

背景技术

随着生活方式的改变，久坐或强迫体位造成的椎间盘突出已经成为一个在世界范围内影响人类健康的重要问题。而椎间盘突出易导致神经系统、心血管系统等一系列疾病的并发。已有许多研究证实，椎间盘突出可以引起感觉异常、脑供血障碍，甚至引起高位截瘫或马尾神经症状等。目前，这种由椎间盘突出而导致的多种疾病在世界范围内的广泛流行使得人们越来越关注其相关的机制研究。因而，阐明椎间盘细胞的发生过程，揭示椎间盘细胞分化及调控中的细胞分子水平的机理，可以为椎间盘细胞退化所引起的相关疾病的预防和治疗提供坚实的理论基础，特别是针对上述疾病进行细胞分子水平的药物筛选，具有重要的现实意义。

作为再生医学和组织工程领域的研究热点之一，椎间盘组织再生技术是重建和修复由老化和病理因素等导致的椎间盘组织丢失和损伤的重要技术手段。而间充质干细胞作为椎间盘再生工程的种子细胞来源，可大大地驱动新生组织的重建。

当前已有的基于脐带、骨髓等间充质干细胞提取方法，并不能很好的提供和椎间盘相同或相近的间充质细胞来源，并且效率低下，同时还需要几周的时间来获得成熟的定向分化细胞，不仅仅是诱导周期长，还在一定程度上增加了成本花费。因此，传统的技术手段一定程度上削弱了其在临床治疗和组织工程中的应用价值。

研究表明，椎间盘干细胞易于获取，是非常有前途的细胞治疗椎间盘退化用细胞来源。然而，目前的培养体系，不能保证其高效的扩增，因而降低了其大规模基础、临床试验以及临床应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法，以解决上述背景技术中存在的至少一项技术问题。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一方面，本发明提供一种用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基，包括如下成分：低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、抗生素、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸和甲状腺原氨酸。

优选的，低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基与DMEM/F12培养基的体积比为1:1，低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基与DMEM/F12培养基的体积之和占所述椎间盘间充质干细胞的培养基总体积的百分比为89％。

优选的，添加胎牛血清的体积百分比为6％、抗生素体积百分比为1％、重组成纤维生长因子浓度为2-10ng/ml、表皮生长因子浓度为2-10ng/ml、胰岛素浓度为10ug/ml、乙酰半胱氨酸浓度为2mM、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。

优选的，所述抗生素为青霉素和链霉素的混合物。

第二方面，本发明提供一种如商所述的用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基的制备方法，在445ml低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基中加入50ml胎牛血清、抗生素青霉素和链霉素5ml、重组人成纤维生长因子2.5ug、表皮生长因子2.5ug、胰岛素5mg、乙酰半胱氨酸2.5ml、甲状腺原氨酸5ug，0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。

第三方面，本发明提供一种利用如商所述的用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基进行椎间盘间充质干细胞培养方法，包括如下步骤：

步骤S110：将无菌条件下获取的人椎间盘组织剪碎后用冰磷酸盐缓冲液 PBS混合后离心；

步骤S120：加入用I型和II胶原酶混合物消化、离心；

步骤S130：使用用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基重悬单个细胞后水浴；

步骤S140：再次用用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基重悬、过滤后移入培养瓶中；

步骤S150：连续培养5-7天后，干细胞成克隆生长后，用普通培养基可传代持续培养。

优选的，步骤S110中，用4℃的冰磷酸盐缓冲液混合切碎的椎间盘组织后低速离心。

优选的，步骤S120中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶质量比为1:1.

优选的，混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1:1000，每克椎间盘组织使用1ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，振荡水浴消化时间为0.5-2小时，消化时水浴温度为37℃。

优选的，所述步骤S130中，消化后的单细胞用用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基重悬，放入37℃水浴中静置15分钟。

本发明有益效果：本发明提出的提取方法和提取专用培养基能在较小损伤干细胞的情况下，快速获得大量人的椎间盘干细胞。所提取的原代脂肪干细胞在传代前的活力较强，干细胞纯度高。经过传代以后，该椎间盘干细胞依然具有较高的增殖和分化能力。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例所述的原代细胞接种后3天的光学显微镜下的细胞形态图。

图2为本发明实施例所述的原代细胞接种后7天的光学显微镜下的细胞形态图。

图3为本发明实施例所述的流式细胞仪检测阳性结果示意图。

图4为本发明实施例中小室细胞迁移实验对照组细胞培养状态示意图。

图5为本发明实施例中小室细胞迁移实验实验组细胞培养状态示意图。

图6为本发明实施例中为对照组和实验组的小室细胞迁移实验结果示意图。

图7为本发明实施例所述的细胞增值实验中对照组和实验组的细胞增殖结果示意图。

图8为本发明实施例中伤口愈合实验中对照组的伤口愈合状态示意图。

图9为本发明实施例中伤口愈合实验中试验组的伤口愈合状态示意图。

图10为本发明实施例中伤口愈合实验中对照组和实验组的伤口愈合结果示意图。

具体实施方式

下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或模块，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、模块和/或它们的组。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语 (包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例做进一步的解释说明，且实施例并不构成对本发明实施例的限定。

本领域普通技术人员应当理解的是，附图只是一个实施例的示意图，附图中的部件或装置并不一定是实施本发明所必须的。

实施例1

本发明实施例1提供一种本发明提供的一种分离提取人的椎间盘干细胞的方法，该方法包括如下步骤：

步骤1:无菌条件下通过外科手术取人椎间盘，剪碎成1-3mm3大小碎块后用冰磷酸盐缓冲液(PBS)混合后摇晃清洗，静置吸取上清液，此步骤重复3-5 次，直到上清液无血色，下沉淀成黄白色颗粒；

步骤2:用I型和II胶原酶混合物，37℃水浴锅消化1小时，每10-20分钟手动摇晃重悬；

步骤3:待时间充足，上层应为混悬液，1000g离心上混悬液。用提取专用培养基重悬单个细胞后水浴，提取专用培养基中含有特定化学成分和生长因子；

步骤4:再次用提取专用培养基重悬、过滤后移入培养瓶中；

步骤5:连续培养5-7天后，干细胞成克隆生长后，用普通培养基可传代持续培养；

步骤1中，用4℃的冰磷酸盐缓冲液混合切碎的椎间盘组织后低速离心。

步骤2中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶质量比为 1:1，混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1:1000，每克椎间盘组织使用1ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，振荡水浴消化时间为0.5-2小时，消化时水浴温度为37℃。

步骤3中，消化后的单细胞用提取专用培养基重悬，放入37℃水浴中静置15分钟。

实施例2

本发明实施例2中，提供一种提取专用培养基，用于分离提取人的椎间盘干细胞的专用培养基，提取专用培养基包括低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、胎牛血清、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸、甲状腺原氨酸。具体成分配比为低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基体积百分比位89％、添加胎牛血清的体积百分比为10％、抗生素(青霉素和链霉素) 体积百分比为1％、重组成纤维生长因子浓度为5ng/ml、表皮生长因子浓度为 5ng/ml、胰岛素浓度为10ug/ml、乙酰半胱氨酸浓度为2mM、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。

在本实施例2中，人的椎间盘干细胞的提取培养步骤包括：

人的椎间盘组织来源间充质干细胞的提取专用培养基配制：在445ml低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基中加入50ml胎牛血清、抗生素(青霉素和链霉素)5ml、重组人成纤维生长因子2.5ug、表皮生长因子2.5ug、胰岛素5mg、乙酰半胱氨酸(400nM的储存液)2.5ml、甲状腺原氨酸5ug，0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。

人的椎间盘干细胞提取与培养步骤为：

步骤1、取人外科手术取出的椎间盘组织，质量大概为10g左右，放入预冷的PBS中，24h内使用。

步骤2、将椎间盘组织剪碎至l-3mm

步骤3、加入25ml的I型和II胶原酶以及PBS混合物，密封后放入37℃振荡水浴箱内消化lh，消化过程中不断振荡组织块(每10-20分钟一次)以促进消化。

步骤4、消化后1000rmp离心5分钟去除上部未被消化的椎间盘组织，加入 40ml的PBS重悬后，800rmp离心5分钟；剩余组织块如果仍然较大，可以收集后继续消化，以提高提取效率。

步骤5、用40ml的提取专用培养基重悬，37℃水浴静置15分钟，

步骤6、1000rmp离心5分钟去上清,再用提取专用培养基重悬,经孔径为 100μm的无菌尼龙网过滤，过滤后单细胞细胞悬液进行计数，按照浓度为105 个/ml将单细胞悬液转移到T25培养瓶中放入培养箱温度为37℃、5％CO

步骤7、12h后，更换一半体积的提取专用培养基，1天后全部更换培养基，第4天全部更换培养基。观察细胞生长情况，一般7天后细胞成克隆生长；椎间盘细胞为短梭型细胞，常生长为同心圆形；

步骤8、用0.25％的胰酶消化后，按照1:3的比例正常传代培养，正常培养用常用培养基(DMEM：F12＝1：1基础培养基加6％胎牛血清)。

如图1、图2所示，人椎间盘干细胞12小时后，细胞有贴壁，培养7天后干细胞成克隆生长。

实验一：人原代椎间盘来源间充质干细胞的细胞纯度鉴定：

步骤1、取原代细胞用0.25％的胰酶消化2分钟后移入2ml离心管，800rmp 离心5分钟；去除上清；

步骤2、每管加入2mlPBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清；

步骤3、加入Iml的PBS重悬细胞，计数，再加入PBS调整细胞数为1×106 个/ml；

步骤4、将细胞悬液分成多管，每管500μl，选其中一管作为流式对照组；

步骤5、按组分别加入带有FITC标记的CD29、CD44、CD73、CD90、 CD105、CD34、CD45流式抗体，4℃避光孵育30分钟，800rmp离心5分钟去除上清；

步骤6、加入1mlPBS重悬，800rmp离心5分钟去除上清。

步骤7、加入500μlPBS重悬细胞；

步骤8、流式细胞仪检测样品。

如图3所示，经流式细胞术检测，使用本发明方法和专用提取培养基所提取的原代脂肪来源间充质干细胞的几个标志物CD29、CD44、CD73阳性表达率很高。表明提取方法和提取培养基可以从椎间盘中分离出纯度较高的干细胞。

试验二：小室迁移能力试验检验不同培养基增殖能力：

步骤1、不同组细胞在培养瓶中共同孵育24小时。

步骤2、移除原培养基，用无血清培养基洗涤几次；用胰酶消化并用无血清培养基收集细胞。

步骤3、向Transwell(8微米孔径)下室加600微升含10％FBS的培养基，上室加入200微升细胞悬液；孵育24小时。

步骤4、移除上、下室的液体。

步骤5、下室加入600微升4％多聚甲醛固定细胞半小时。

步骤6、移除多聚甲醛，用棉签擦除未穿过膜的细胞。

步骤7、下室加入600微升0.1％结晶紫染色10分钟。

步骤8、用PBS洗涤小室。

步骤9、在显微镜下观察细胞并计数。

如图4至图6所示，经小室迁移实验验证，本实施例2提供的培养基培养的椎间盘细胞相较普通的培养基具有较高的增殖能力。

试验三：伤痕修复试验验证细胞增殖能力差异。

步骤1、先用记号笔在6孔板背后，用直尺均匀得划横线，大约每隔 0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

步骤2、在空中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。

步骤3、第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

步骤4、用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。

步骤5、放入37度5％CO2培养箱，培养。24小时取样，拍照。

如图8至图10所示，经小室迁移实验验证，本实施例提供的培养基培养的椎间盘细胞相较普通的培养基具有较高的迁移能力。

试验四：细胞计数CCK-8试验检验不同培养基培养的细胞的增殖能力：

先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

按1/2比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。

接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK试剂培养一定时间后测定OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK后的培养时间。)

在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃,5％CO2)，向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)，将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

用酶标仪测定在450nm处的吸光度。若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。1、3、5、7天测定，吸光度变化。

如图7所示，细胞计数CCK-8验证，本实施例2提供的培养基培养的椎间盘细胞相较普通的培养基具有较高的增殖能力。

综上所述，本发明实施例提供的人椎间盘来源干细胞的提取方法以及提取专用培养基可以从椎间盘组织中快速提取间充质干细胞，且提取的干细胞的纯度，活力较高。能有效的丰富脂肪来源干细胞的种类，提高干细胞原代提取的效率，为干细胞的近一步的科学研究和临床应用提供相关依据。

使用本发明实施例所述的椎间盘干细胞提取方法以及提取专业培养基可以从人椎间盘中提取大量脂肪来源间充质干细胞，原代培养的细胞内干细胞纯度较高，且干细胞活性较强。该干细胞再经过普通培养基多次传代培养后干细胞活力和分化能力依然较强。在人的椎间盘中经过特定提取步骤和提取专用培养基提取了椎间盘来源的间充质干细胞，在提取的方法可以减少干细胞损伤，同时使用提取专用培养基(添加特定的化学成分和生长因子)可以解决干细胞在体外培养原代细胞培养纯度低、传代后干细胞容易衰老分化、不能长时间连续培养等问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。