一种多糖磁性纳米生物炭粒子及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化学材料领域，特别是一种多糖磁性纳米生物炭粒子及其制备方法和应用。

背景技术

超顺磁性纳米颗粒以其独特的晶粒尺寸和磁学特性而备受材料界关注。近年来人们对铁基超顺磁性纳米颗粒的研究表明，当Fe

多种植物中药富含天然多糖成份，例如白子菜多糖、黄芪多糖、刺五加多糖。植物多糖可以通过增大巨噬细胞体积来提高机体免疫力。植物多糖对巨噬细胞吞噬活性的影响与其浓度有一定关系，在适当的浓度范围内能促进巨噬细胞的吞噬作用。植物多糖可以通过调节巨噬细胞细胞因子的分泌量来调节巨噬细胞功能。植物多糖可以通过调节巨噬细胞内酶的活性进而影响巨噬细胞的功能。

磁性纳米颗粒与多糖结合可以制备高分子磁性纳米粒子，高分子磁性纳米粒子是指通过适当的制备方法使有机高分子与无机磁性颗粒结合形成具有一定磁性及特殊结构的复合粒子。由于纳米粒子较小的尺寸、大的比表面积产生的量子效应和表面效应，赋予其许多特殊的性质。复合粒子具有磁响应性和特异的表面官能团，能与其它小分子、大分子或细胞等结合，然后在磁场的作用下做出某些响应，因此，高分子磁性纳米粒子广泛用于临床诊断、造影成像、靶向药物、生物标记和分离以及酶的固定化等领域。但是，由于有机物和无机物的亲和性较差，将磁性颗粒均匀地分散在高分子粒子内是一项较难的工作。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种多糖磁性纳米生物炭粒子及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种多糖磁性纳米生物炭粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1、将Fe

S2、制备羧基化生物炭纳米粒子cNDs；

S3、将聚乙烯亚胺PEI修饰的Fe

S4、制备多糖纳米粒子；

S5、制备多糖磁性纳米生物炭纳米粒子：将生物炭外壳的磁性复合物Fe

进一步，所述S2中制备羧基化生物炭纳米粒子cNDs的具体步骤为：

S21、将生物炭置于马弗炉中，在425℃下退火4h，得到纳米生物炭粉末；

S22、将退火的纳米生物炭粉末分散于强氧化性混合酸液中，并在200W的功率下超声分散1h；然后将其转移到100mL圆底烧瓶中于80℃恒温搅拌48h；

S23、搅拌结束后，待混合液冷却至室温，以8000r/min离心5min得到纳米生物炭沉淀；

S24、所得纳米生物炭沉淀先用反渗透水洗涤两次后，再分别用0.1MNaOH溶液和HCl溶液在100℃下各搅拌洗涤2h，最后将沉淀离心干燥得到羧基化生物炭纳米粒子。

进一步，所述S4中制备多糖纳米粒子的具体步骤为：

S41、取多糖溶于水中得液体A；

S42、取聚丙交酯-乙交酯-氨基(二胺)NH

S43、将液体A和液体B按照体积比为1:5-1:10混合，冰浴条件下超声处理30-80min，得液体C；

S44、将液体C与泊洛沙姆混合继续超声乳化30-80min，离心，收集沉淀即得多糖纳米粒子。

优选地，所述S1中Fe

优选地，所述S1中的聚乙烯亚胺PEI的分子量为4000～130000，聚乙烯亚胺PEI溶液的浓度为0.1mg/mL-10mg/mL。

优选地，所述S22中强氧化性混合酸液为体积比为3:1的H

优选地，所述羧基化生物炭纳米颗粒的粒径范围为50-200nm。

优选地，所述多糖为白子菜多糖、黄芪多糖、刺五加多糖中的一种。

另外，本发明还提供了一种由上述多糖磁性纳米生物炭粒子的制备方法制得的多糖磁性纳米生物炭粒子，所述多糖磁性纳米生物炭粒子粒径为200～500nm。

本发明的多糖磁性纳米生物炭粒子可以在制备免疫增强药物中应用。

与现有技术相比，本发明用Fe

附图说明

图1为本发明制备过程中固体颗粒的TEM图：(a)为Fe

图2为实施例4中的白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子高(H-GDP-MBN/OVA)、中(M-GDP-MBN/OVA)、低剂量(L-GDP-MBN/OVA)、白子菜多糖(GDP-OVA)、磁性生物炭纳米粒子(MBN-OVA)、阳性对照(F/OVA)、白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子对照(GDP-MBN)和PBS对照(Control)对抗体水平以及对血清中细胞因子的整体影响图。

图3为实施例4中首免后的第35天白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子高(H-GDP-MBN/OVA)、中(M-GDP-MBN/OVA)、低剂量(L-GDP-MBN/OVA)、白子菜多糖组(GDP-OVA)、磁性生物炭纳米粒子组(MBN-OVA)、阳性对照组(F/OVA)、白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子对照组(GDP-MBN)和PBS对照组(Control)的TNF-α、IL-4对抗体水平以及对血清中细胞因子的整体影响图。

图4为实施例4中白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子高(H-GDP-MBN/OVA)、中(M-GDP-MBN/OVA)、低剂量(L-GDP-MBN/OVA)、白子菜多糖(GDP-OVA)、磁性生物炭纳米粒子(MBN-OVA)、阳性对照(F/OVA)、白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子对照(GDP-MBN)和PBS对照(Control)分别对小鼠淋巴细胞中CD4/CD8促进效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1

一种多糖磁性纳米生物炭粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1、将10mgFe

S2、制备粒径为50nm羧基化生物炭纳米粒子cNDs：

S21、将10g生物炭置于马弗炉中，在425℃下退火4h，得到纳米生物炭粉末；

S22、将退火的纳米生物炭粉末分散于强氧化性混合酸液中，并在200W的功率下超声分散1h；强氧化性混合酸液为体积比为3:1的H

S23、搅拌结束后，待混合液冷却至室温，以8000r/min离心5min得到纳米生物炭沉淀；

S24、所得纳米生物炭沉淀先用反渗透水洗涤两次后，再分别用0.1MNaOH溶液和HCl溶液在100℃下各搅拌洗涤2h，最后将沉淀离心干燥得到粒径为50nm羧基化生物炭纳米粒子；

S3、将10mg聚乙烯亚胺PEI修饰的Fe

S4、制备白子菜多糖纳米粒子：

S41、取1000mg多糖溶于水中得液体A；

S42、取0.5ml聚丙交酯-乙交酯-氨基(二胺)NH

S43、将10ml液体A和50ml-100ml液体B混合，冰浴条件下超声处理30min，得液体C；

S44、将液体C与泊洛沙姆混合继续超声乳化30min，离心，收集沉淀即得多糖纳米粒子；

S5、制备多糖磁性纳米生物炭纳米粒子：将10mg生物炭外壳的磁性复合物Fe

实施例2

一种多糖磁性纳米生物炭粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1、将10mgFe

S2、制备粒径为200nm羧基化生物炭纳米粒子cNDs：

S21、将10g生物炭置于马弗炉中，在425℃下退火4h，得到纳米生物炭粉末；

S22、将退火的纳米生物炭粉末分散于强氧化性混合酸液中，并在200W的功率下超声分散1h；强氧化性混合酸液为体积比为3:1的H

S23、搅拌结束后，待混合液冷却至室温，以8000r/min离心5min得到纳米生物炭沉淀；

S24、所得纳米生物炭沉淀先用反渗透水洗涤两次后，再分别用0.1MNaOH溶液和HCl溶液在100℃下各搅拌洗涤2h，最后将沉淀离心干燥得到粒径为200nm羧基化生物炭纳米粒子；

S3、将10mg聚乙烯亚胺PEI修饰的Fe

S4、制备黄芪多糖纳米粒子：

S41、取1000mg多糖溶于水中得液体A；

S42、取0.5ml聚丙交酯-乙交酯-氨基(二胺)NH

S43、将10ml液体A和100ml液体B混合，冰浴条件下超声处理30min，得液体C；

S44、将液体C与泊洛沙姆混合继续超声乳化30min，离心，收集沉淀即得多糖纳米粒子；

S5、制备多糖磁性纳米生物炭纳米粒子：将10mg生物炭外壳的磁性复合物Fe

实施例3

一种多糖磁性纳米生物炭粒子的制备方法，包括以下步骤：

S1、将10mgFe

S2、制备粒径为100nm羧基化生物炭纳米粒子cNDs：

S21、将10g生物炭置于马弗炉中，在425℃下退火4h，得到纳米生物炭粉末；

S22、将退火的纳米生物炭粉末分散于强氧化性混合酸液中，并在200W的功率下超声分散1h；强氧化性混合酸液为体积比为3:1的H

S23、搅拌结束后，待混合液冷却至室温，以8000r/min离心5min得到纳米生物炭沉淀；

S24、所得纳米生物炭沉淀先用反渗透水洗涤两次后，再分别用0.1MNaOH溶液和HCl溶液在100℃下各搅拌洗涤2h，最后将沉淀离心干燥得到粒径为100nm羧基化生物炭纳米粒子；

S3、将10mg聚乙烯亚胺PEI修饰的Fe

S4、制备刺五加多糖纳米粒子：

S41、取1000mg多糖溶于水中得液体A；

S42、取0.5ml聚丙交酯-乙交酯-氨基(二胺)NH

S43、将10ml液体A和800ml液体B混合，冰浴条件下超声处理30min，得液体C；

S44、将液体C与泊洛沙姆混合继续超声乳化30min，离心，收集沉淀即得多糖纳米粒子；

S5、制备多糖磁性纳米生物炭纳米粒子：将10mg生物炭外壳的磁性复合物Fe

以实施例1为例，如图1中：(a)为Fe

实施例4

白子菜多糖磁性纳米生物炭纳米粒子免疫增强活性比较

以实施例1中制备的白子菜多糖磁性纳米生物炭纳米粒子(GDP-MBN)为研究对象，以阳性对照(FCA)和磁性生物炭纳米粒子(Magnetic biochar nanoparticles，MBN)及白子菜多糖(Gynura divaricata Polysaccharide，GDP)作为对照，测定了它们对模式抗原(OVA)免疫后机体特异性IgG抗体水平、淋巴细胞的活化、淋巴结中OVA抗原及细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6含量的影响。

(1)动物分组及处理

80只6-8周龄的Blab/c小鼠随机均分为8组，分别为白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子高(H-GDP-MBN/OVA)、中(M-GDP-MBN/OVA)、低剂量组(L-GDP-MBN/OVA)、白子菜多糖组(GDP-OVA)、磁性生物炭纳米粒子(MBN-OVA)、阳性对照组(F/OVA)、白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子对照(GDP-MBN)和PBS对照组(Control)。皮下免疫小鼠3次，每次免疫间隔1周。分别于首免后14、28和35天检测机体OVA特异性IgG抗体水平，首免后14天淋巴结树突状细胞的活化，首免后35天检测淋巴结中OVA抗原及血清中细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6含量变化。

(2)白子菜多糖磁性纳米生物炭纳米粒子对抗体水平以及对血清中细胞因子的影响

就总体免疫球蛋白而言，首免后第14天，GDP-MBN/OVA高、中、低剂量各组高于阳性对照组，并且直到35天仍高于或与阳性对照组效果相同(参照图2)。。

首免后的第35天GDP-MBN/OVA高、中、低剂量各组及阳性对照组(F/OVA)的TNF-α、IL-4显著高于其他组，并且IFN-γ与IL-6极显著高于F/OVA组(参照图3)。

注：*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001相比于对照组。

(3)白子菜多糖磁性纳米生物炭纳米粒子对小鼠淋巴结中成熟树突状细胞比例的影响

作为最主要初级免疫反应场所的淋巴结在疫苗免疫过程中发挥着及其重要的作用。抗原在注射进动物机体后，其迁移至淋巴结的效率与诱导机体产生有效的免疫反应息息相关。有效的疫苗递载系统类佐剂能够明显的提高抗原递呈细胞摄取抗原、运载抗原至淋巴结及递呈抗原到T淋巴细胞。首免后的14天，白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子组显著地促进了小鼠淋巴细胞中CD4/CD8的比例，且显著高于白子菜多糖组(参照图4)，表明了白子菜多糖磁性生物炭纳米粒子组能有有效的促进成熟树突状细胞的归巢从而更加有效的将抗原递呈给淋巴细胞，进一步引起强烈的免疫反应。

根据上述动物试验结果可以得出白子菜多糖磁性纳米生物炭纳米粒子可以提高小鼠机体特异性IgG抗体水平、淋巴细胞的活化、淋巴结中OVA抗原及细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-6含量，从而提高机体免疫功能，说明本发明涉及的白子菜多糖磁性纳米生物炭纳米粒子可用于提高动物机体免疫功能以达到抵抗疾病的目的。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。