一种磁珠法提取全血DNA的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种磁珠法提取全血DNA的试剂盒及其使用方法。

背景技术

核酸作为一种重要的生物分子广泛存在于各类生命体中，不同的核酸具有不同的核苷酸排列顺序及化学组成，从而对生物体的不同生命活动产生了不同的决定作用。在实践方面，许多疾病的发生均与核酸有关，因此对核酸的结构、功能有完整的认知是人类在分子水平进行疾病诊断和研究的基础。而随着基因检测技术在生物学研究领域的广泛应用，对核酸样品的要求也随之越来越高。

全血中DNA的提取使我们可以更加简便的获取基因组DNA，提取原理是在保证生物体DNA分子完整性下将其与蛋白质、脂类和糖类分离。但传统从全血中提取DNA的方法要对全血样本进行预处理，且操作过程复杂，耗时长。

基于目前从全血中提取DNA的方法存在的缺陷，有必要对此进行改进。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种磁珠法提取全血DNA的试剂盒及其制使用方法，以解决现有技术中存在的技术缺陷。

第一方面，本发明提供了一种磁珠法提取全血DNA的试剂盒，包括裂解结合液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；

其中，所述裂解结合液包括以下原料：盐酸胍、尿素、乙酸钠、氯化钠和曲拉通X-100。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒，所述第一洗涤液包括以下原料：盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、盐酸和异丙醇；

所述第二洗涤液包括以下原料：乙酸钠、乙酸铵和冰乙酸。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒，所述裂解结合液中盐酸胍的浓度为4～8mol/L、尿素的浓度为5～10mmol/L，乙酸钠的浓度为80～100mmol/L，氯化钠的浓度为800mmol/L，曲拉通X-100的体积浓度为1％；优选的，所述盐酸胍的浓度为6mol/L、尿素的浓度为8mmol/L，乙酸钠的浓度为85mmol/L。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度为3～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为15～25mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2～3mmol/L、盐酸的体积浓度为0.1％～0.2％、异丙醇的体积浓度为20％～30％；优选的，所述盐酸胍的浓度为4mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2.5mmol/L、盐酸的体积浓度为0.15％、异丙醇的体积浓度为25％。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒，所述第二洗涤液中乙酸钠浓度为150～200mmol/L、乙酸铵的浓度为200～300mmol/L，冰乙酸的体积浓度为1％～2％；优选的，所述乙酸钠浓度为180mmol/L、乙酸铵的浓度为250mmol/L，冰乙酸的体积浓度为1.5％。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为5～15mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1～2mmol/L；优选的，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为10mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1.5mmol/L。洗脱液的PH调为8.0。

第二方面，本发明还提供了一种所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、提供全血样本，向全血样本中加入所述裂解结合液、乙醇和蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀，得到混合液；

S2、向混合液中加入磁珠，混合均匀，孵育；

S3、将装有混合液的离心管置于磁力架上，待磁珠被吸附至管壁吸取上清液并丢弃，然后加入所述第一洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S4、然后加入所述第二洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S5、将磁珠晾干然后，加入所述洗脱液重悬磁珠以洗脱核酸，收集上清液并保存。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒的使用方法，S1具体包括：提供200ul全血样本，向全血样本中加入200ul的所述裂解结合液、200ul的乙醇和200ul的蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀，然后于70℃下水浴加热10min，得到混合液；

S2具体包括：向混合液中加入20ul的磁珠，混合均匀，孵育5min；

S3具体包括：将装有混合液的离心管置于磁力架上，待磁珠被吸附至管壁吸取上清液并丢弃，然后加入500ul的所述第一洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S4具体包括：然后加入700ul的所述第二洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S5具体包括：将磁珠晾干然后，加入100ul的所述洗脱液重悬磁珠以洗脱核酸，收集上清液并保存。

可选的，所述的磁珠法提取全血DNA的试剂盒的使用方法，S5中收集上清液于-18～-22℃下保存。

本发明的一种磁珠法提取全血DNA的试剂盒及其使用方法相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明的磁珠法提取全血DNA的试剂盒，利用磁珠与核酸结合大大提高核酸纯度，该试剂盒可以高效提取全血中基因组DNA，提取产物可用于下游进一步实验；

(2)本发明试剂盒中裂解结合液含有盐酸胍和尿素，可使天然蛋白转变为复合物导致蛋白质完全变性，且对氨基酸具有增溶作用，浓度高时可破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，因此可达到较好裂解效果；第二洗涤液中乙酸铵、乙酸钠均有利于溶解残留蛋白；洗脱液中加入乙二胺四乙酸可去除干扰离子影响，更稳定溶解核酸。

(3)本发明的磁珠法提取全血DNA的试剂盒的使用方法，无需对全血样本进行预处理，减少提取时间；提取过程中未使用有毒试剂，操作安全。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

一种磁珠法提取全血DNA的试剂盒，包括裂解结合液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；

其中，裂解结合液包括以下原料：盐酸胍、尿素、乙酸钠、氯化钠和曲拉通X-100。

具体的，本申请实施例中，显然裂解结合液中使用的溶剂为水，其中，裂解结合液中盐酸胍的浓度为4～8mol/L、尿素的浓度为5～10mmol/L，乙酸钠的浓度为80～100mmol/L，氯化钠的浓度为800mmol/L，曲拉通X-100的体积浓度为1％。

在一些实施例中，第一洗涤液包括以下原料：盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、盐酸和异丙醇；第一洗涤液中使用的溶剂为水，第一洗涤液中盐酸胍的浓度为3～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为15～25mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2～3mmol/L、盐酸的体积浓度为0.1％～0.2％、异丙醇的体积浓度为20％～30％；其中，盐酸的体积浓度指的是，将浓盐酸溶于水中形成的体积浓度为0.1％～0.2％。

在一些实施例中，第二洗涤液包括以下原料：乙酸钠、乙酸铵和冰乙酸，第二洗涤液中使用的溶剂为水，第二洗涤液中乙酸钠浓度为150～200mmol/L、乙酸铵的浓度为200～300mmol/L，冰乙酸的体积浓度为1％～2％。

在一些实施例中，洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸，洗脱液中的溶剂为水，具体的，洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为5～15mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1～2mmol/L。

在一些申请实施例中，洗脱液的pH为8，具体的可通过盐酸或氢氧化钠调节洗脱液的pH为8。

本申请的磁珠是一种新型的功能化固体载体，表面有活性基团包被，可以偶联多种生物活性物质，其既具有液体流动性又有固体磁性材料的特点，当外磁场存在时可以实现定向移动，当外磁场撤去又能分散于液体中，从而可以轻易实现固液分离，再对磁珠进行洗脱便可得到目标物质。

基于同一发明构思，本申请还提供了上述磁珠法提取全血DNA的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、提供全血样本，向全血样本中加入所述裂解结合液、乙醇和蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀，得到混合液；

S2、向混合液中加入磁珠，混合均匀，孵育；

S3、将装有混合液的离心管置于磁力架上，待磁珠被吸附至管壁吸取上清液并丢弃，然后加入所述第一洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S4、然后加入所述第二洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S5、将磁珠晾干然后，加入所述洗脱液重悬磁珠以洗脱核酸，收集上清液并保存。

在一些实施例中，S1具体包括：提供200ul全血样本，向全血样本中加入200ul的所述裂解结合液、200ul的乙醇和200ul的蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀，然后于70℃下水浴加热10min，得到混合液；

S2具体包括：向混合液中加入20ul的磁珠，混合均匀，孵育5min；

S3具体包括：将装有混合液的离心管置于磁力架上，待磁珠被吸附至管壁吸取上清液并丢弃，然后加入500ul的所述第一洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S4具体包括：然后加入700ul的所述第二洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

S5具体包括：将磁珠晾干然后，加入100ul的所述洗脱液重悬磁珠以洗脱核酸，收集上清液并保存。

在一些实施例中，S5之前还包括重复S4步骤一次。

在一些实施例中，S5中收集上清液于-18～-22℃下保存，具体的于-20℃保存。

需要说明的是，本申请实施例中的试剂盒适用于从冻全血、血浆、血清、骨髓、其他体液、淋巴细胞、培养细胞、线粒体和病毒中提取基因组DNA。本申请的试剂盒可在40min内最大限度地回收高纯度DNA，本试剂盒即可手动提取也可使用核酸自动提取仪以96孔板形式进行提取，可一次提取1～32个样本。与其他试剂盒相比本发明提供的提取办法具有提取步骤简便、操作过程安全、提取效率高、DNA产物含量高、成本低等特点。使用本试剂盒纯化的核酸可适用于各种常规操作，包括RT-PCR、荧光定量PCR等各种下游实验。

以下进一步以本发明的试剂盒的手动提取DNA说明本申请的试剂盒的使用方法。

一、实验准备

1.1、第一次使用时，在试剂瓶中加入指定体积的无水乙醇；

1.2、准备70℃温浴；

1.3、使用前检查裂解结合液是否有沉淀析出，若出现沉淀，应于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用；

1.4、配制浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。

二、操作步骤

2.1、加入200ul样本到1.5ml离心管中；注意，若样本体积少于200ul，用PBS补充到200ul；若样本为收集的细胞，应用200ul的PBS悬浮；

2.2、加入200ul的裂解结合液、200ul的乙醇和20ul的蛋白酶K溶液，立即震荡涡旋1min混合均匀，然后将离心管置于70℃下水浴10min；注意，不要将蛋白酶K直接加到裂解结合液中；

2.3、加入20ul的磁珠到步骤2.2的混合液中，充分混匀，室温孵育5min；加磁珠前将磁珠混合均匀；

2.4、将装有混合液的离心管置于磁力架上，待磁珠被吸附至管壁吸取上清液并丢弃；

2.5、加入500ul的第一洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

2.6、加入700ul的第二洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

2.7、重复操作步骤2.6；

2.8、将磁珠晾干5min；

2.9、加入100ul的洗脱液重悬磁珠以洗脱核酸，然后将上清液转移至新的离心管中。

以下进一步以具体实例来对本发明进行进一步说明。

实施例1

本申请实施例提供了一种磁珠法提取全血DNA的试剂盒，包括裂解结合液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；

其中，裂解结合液包括以下原料：盐酸胍、尿素、乙酸钠、氯化钠和曲拉通X-100；裂解结合液中盐酸胍的浓度为6mol/L、尿素的浓度为8mol/L、乙酸钠的浓度为85mmol/L，氯化钠的浓度为800mmol/L，曲拉通X-100的体积浓度为1％；

第一洗涤液中盐酸胍的浓度4mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2.5mmol/L、盐酸的体积浓度为0.15％、异丙醇的体积浓度为25％；

第二洗涤液中乙酸钠浓度为180mmol/L、乙酸铵的浓度为250mmol/L，冰乙酸的体积浓度为1.5％；

洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度10mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1.5mmol/L；洗脱液的pH为8。

使用实施例1中的试剂盒提取人类全血样本4份，按如下步骤操作：

(1)准备4支1.5ml的EP管，加入200ul全血样本；

(2)各EP管中加入200ul的裂解结合液、200ul的乙醇和20ul的蛋白酶K溶液，震荡涡旋1min，混合均匀，将EP管置于70℃水浴10min；

(3)加入20ul的磁珠到步骤(2)的混合液中，充分混匀，室温孵育5min；

(4)将装有混合液的EP管置于磁力架上，待磁珠被吸附至管壁吸取上清液并丢弃；

(5)加入500ul的第一洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

(6)加入700ul的第二洗涤液重悬磁珠，吸取上清液并丢弃；

(7)重复一次步骤(6)的操作；

(8)将磁珠晾干5min；

(9)加入100ul的洗脱液重悬磁珠以洗脱核酸，然后将上清液转移至新的离心管中。

提取完成后对DNA进行定量和纯度检测。各取2ul样本，以上述所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度，结果如下表1所示。

表1-本发明试剂盒提取不同样本中DNA的浓度

按照上述同样的方法，对照组采用天隆核酸提取试剂盒(磁珠法)提取200ul新鲜全血样本，洗脱液体积为100ul，以所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度，结果如表2。

表2-对照试剂盒提取不同样本中DNA的浓度

从表1中可知，本发明中的试剂盒可以很好地提取全血中的DNA，提取到的DNA浓度和纯度都较高，表中260nm和280nm分别代表了核酸和蛋白质有机物的吸光度值，260/280的比值表示了蛋白质等有机物的污染程度，高质量的样品260/280的比值应在1.8-2.0之间。样本1-4均为使用上述方法所提取，可以看出4份样本的260/280比值均在1.8至2.0的范围内，说明样本中无蛋白质等物质污染，使用200ul全血提取的DNA浓度均高于80ng/ul，四个样本的浓度均值为82.7ng/ul。如表2所示，使用对照试剂盒提取的全血中DNA浓度均值为50.3ng/ul，和表2中对照试剂盒的结果相比，本发明试剂盒提取的DNA浓度和260/280比值即纯度都较高，说明本试剂盒能有效地提取到全血中的基因组DNA，提取的量可供下一步实验使用。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。