葡甘寡糖系列组合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及酶降解技术领域，且特别涉及葡甘寡糖系列组合物、其制备方法及应用。

背景技术

免疫系统分为先天免疫和适应性免疫，先天免疫作为第一道防御线与适应性免疫共同在人体内作用，对抵御感染和炎症产生重大影响。目前，临床上使用的传统合成免疫抑制剂，如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、羟氯喹等，会有一定的不良反应，如白细胞减少、血小板减少或贫血，肝功能损害等，需要定期进行检查，也存在前期研发费用高昂等问题。

近年来，多糖及其衍生物在生物制药领域具有巨大的潜力。葡甘聚糖是一种高度聚合的多糖，它是从植物块茎，鳞茎和根等自然资源中提取的。来源于天然魔芋植物资源的葡甘聚糖是一种非常有前途的生物活性多糖，它由D-葡萄糖和D-甘露糖单元组成，摩尔比约为1：1.6，糖单元通过β-1,4键进行连接。极少的乙酰基随机分布在C-6位置，占比约为5％-10％，魔芋葡甘聚糖的G-M主链上带有短的侧链，结构接近线性多糖。天然魔芋葡甘露糖的分子量通常在500,000至2,000,000Da之间，其分子量会因为不同的植物来源，来源地区和生产方法而有所不同。与此类似，天然白芨葡甘聚糖是由葡萄糖和甘露聚糖以β-1,4糖苷键结合而成的大分子多糖，甘露糖和葡萄糖的比例为3:1，每12个己糖单位含有1.7个己糖分枝和两个乙酰基。

工程化的葡甘聚糖可以作为药物输送系统或生物材料，在治疗领域得到应用。然而，葡甘聚糖由于其结构和功能之间的不确定关系，从而其生物应用受到了极大的限制。目前，十分有必要制备结构确定的葡甘寡糖，在其高精细结构的基础上，探索其更深刻的生物活性机制，从而在未来拓展其应用领域。

目前，降解高分子量的天然葡甘聚糖的方法主要有超声物理方法和化学水解方法(包括酸水解、碱水解等)手段。其中，超声物理方法是在不同的超声处理时间和功率下，葡甘聚糖片段发生相应的变化，但超声降解后，一些典型的物理特性如粘度、存储模块和损耗模块等也发生了变化。酸处理水解葡甘聚糖，但其反应条件剧烈，同时酸降解手段的后处理过程更加复杂，尤其是去除酸的过程。碱处理和加热相结合的方法对葡甘聚糖进行降解也可获得低粘度葡甘露聚糖，然而在碱性条件下葡甘聚糖具有形成凝胶网络的不利趋势，其工艺并不稳定。

因此，现有的天然葡甘聚糖的降解方法均不能获得高纯度、分子量均匀的低聚葡甘糖。鉴于此，特提出本申请。

发明内容

本发明的目的在于提供一种葡甘寡糖系列组合物，具备很好的抑炎生物活性，适合于推广应用。

本发明的第二目的在于提供一种葡甘寡糖系列组合物的制备方法，其采用酶降解的方式，制备得到的葡甘寡糖组合物具有显著抑炎生物活性，且分子量较为均匀、纯度也较高。

本发明的第三目的在于提供上述葡甘寡糖系列组合物的应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出了一种葡甘寡糖系列组合物，其包括葡甘二糖、葡甘三糖、葡甘四糖、葡甘五糖和葡甘六糖，所述葡甘二糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘三糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘四糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp或β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘五糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘六糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp。

本发明还提出了一种葡甘寡糖系列组合物的制备方法，包括：对葡甘多糖进行酶解，在酶解过程中采用的酶选自内切-1，4-β-甘露聚糖、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶和纤维素酶中的至少一种。

本发明还提出上述葡甘寡糖系列组合物在制备抗炎药物中的应用。

本发明还提出上述葡甘寡糖系列组合物在作为免疫细胞促进白细胞介素-10和转化生长因子-β1中至少一种物质表达的促进剂中的应用。

本发明还提出上述葡甘寡糖系列组合物在作为免疫细胞抑制肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素-1β中至少一种物质表达的抑制剂中的应用。

本发明实施例提供一种葡甘多糖的降解方法及制备得到的葡甘寡糖系列组合物的有益效果是：其采用内切-1，4-β-甘露聚糖、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶和纤维素酶中的至少一种酶对葡甘多糖进行酶解，酶解得到的葡甘寡糖组合物分子量均匀且纯度较高，具有显著抑炎生物活性，可以在制备抗炎药物中得到应用，也可以作为免疫细胞促进白细胞介素-10和转化生长因子-β1中至少一种物质表达的促进剂，还可以作为免疫细胞抑制肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素-1β中至少一种物质表达的抑制剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为由NMR一维图谱和NMR二维图谱解析推导而来的葡甘寡糖组合物的结构；

图2为不同葡甘寡糖组合物的高效液相色谱(HPLC)和凝胶渗透色谱(GPC)联用图谱；

图3为高效液相色谱(HPLC)对葡甘寡糖组合物的成分鉴定结果；

图4为由实时荧光定量PCR实验测定实施例1-3中得到的不同葡甘寡糖组合物对巨噬细胞的IL-10的表达水平的测试结果；

图5为由实时荧光定量PCR实验测定实施例1-3中得到的不同葡甘寡糖组合物对巨噬细胞的TGF-β1的表达水平的测试结果；

图6为由实时荧光定量PCR实验测定实施例1-3中得到的不同葡甘寡糖组合物对巨噬细胞的TNF-α的表达水平的测试结果；

图7为由实时荧光定量PCR实验测定实施例1-3中得到的不同葡甘寡糖组合物对巨噬细胞的IL-1β的表达水平的测试结果；

图8为不同分离方法的分离效果对比。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的葡甘寡糖系列组合物、其制备方法及应用进行具体说明。

本发明实施例提供了一种葡甘多糖的降解方法，其采用酶解的方式对葡甘多糖进行降解，发明人创造性地采用内切-1，4-β-甘露聚糖(EC:3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC:3.2.1.25)、β-葡糖苷酶(EC:3.2.1.21)和纤维素酶(EC:232.734.4)中的至少一种酶进行酶解，制备得到葡甘二糖，葡甘三糖，葡甘四糖，葡甘五糖和葡甘六糖，纯度较高、分子量均匀，具有一定的免疫抑制的生物活性，为开发天然免疫抑制剂提供了新思路。

具体地，葡甘多糖可以是天然来源的葡甘聚糖，如葡甘多糖可以为白芨多糖和魔芋多糖，例如从白芨根茎提取的白芨多糖或者从魔芋块茎中提取得到的魔芋多糖。

在酶解过程中采用的酶可以采用以下五种技术方案：(1)以质量分数计，在酶解过程中采用的酶包括内切-1，4-β-甘露聚糖0-10％、β-甘露糖苷酶0-10％、β-葡糖苷酶0-10％和纤维素酶70-100％。(2)以质量分数计，在酶解过程中采用的酶包括内切-1，4-β-甘露聚糖0-10％、β-甘露糖苷酶0-10％、β-葡糖苷酶70-100％和纤维素酶0-10％。(3)以质量分数计，在酶解过程中采用的酶包括内切-1，4-β-甘露聚糖0-10％、β-甘露糖苷酶70-100％、β-葡糖苷酶0-10％和纤维素酶0-10％。(4)以质量分数计，在酶解过程中采用的酶包括内切-1，4-β-甘露聚糖70-100％、β-甘露糖苷酶0-10％、β-葡糖苷酶0-10％和纤维素酶0-10％。(5)以质量分数计，在酶解过程中采用的酶包括内切-1，4-β-甘露聚糖10-30％、β-甘露糖苷酶10-30％、β-葡糖苷酶20-40％和纤维素酶20-40％。

需要说明的是，以上五种技术方案均适合于本申请实施例中的酶解过程，均能够酶解得到葡甘二糖，葡甘三糖，葡甘四糖，葡甘五糖以及葡甘六糖，经过分离之后纯度可以达到95％以上，葡甘寡糖的纯度鉴定可以采用高效液相色谱(HPLC)进行鉴定。

进一步地，酶解的步骤包括：将葡甘多糖冻干粉和酶混合溶解后，在35-50℃的条件下反应24-72h；葡甘多糖冻干粉和酶的质量比为5-20:1。通过进一步控制酶解过程的反应温度、时间以及原料用量比进一步提升产品的收率和纯度。

进一步地，葡甘多糖冻干粉的制备包括：将葡甘多糖和水混合均匀后进行冻干，葡甘多糖和水混合搅拌时间为12-24h，以达到混合均匀的状态。在其他实施例中，葡甘多糖冻干粉也可以采用市购原料，不进行上述冻干步骤。

在一些实施例中，在反应完成后进行过滤得到寡糖混合物，再进行分离纯化；分离纯化的过程是采用葡聚糖层析、羟丙基葡聚糖凝胶层析、硅胶层析或液相色谱分离的方法进行分离，收集洗脱液，通过分离得到纯度95％以上的葡甘二糖，葡甘三糖，葡甘四糖，葡甘五糖以及葡甘六糖。

在本发明优选的实施例中，采用葡聚糖层析的方法进行分离纯化，洗脱液为去离子水。采用葡聚糖层析的方法能够进一步提升分离度，提高产品的纯度。

在本发明优选的实施例中，采用液相色谱分离的方法进行分离纯化，洗脱液为水和乙腈，并控制水和乙腈质量比为1:0.8-1.2；采用液相色谱的方法也能够将产品有效分离，但是要控制水和乙腈的用量比。

在一些实施例中，还可以将收集得到的洗脱液进行冻干，制备冻干粉；可以将收集得到的洗脱液形成水溶液的产品。

本发明实施例还提供一种葡甘寡糖系列组合物，其通过上述降解方法制备而得；制备得到的葡甘寡糖系列组合物包括葡甘二糖、葡甘三糖、葡甘四糖、葡甘五糖和葡甘六糖，其中葡甘二糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘三糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘四糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp或β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘五糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，所述葡甘六糖的结构为β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp，具体参见图1(按照以上结构出现的顺序自上而下排列)，糖单元的连接方式以及单元为1,4-β-D-Man-D-Glc或1,4-α-D-Man-D-Glc。

葡甘二糖、葡甘三糖、葡甘四糖、葡甘五糖和葡甘六糖的分子量(Mw)依次为342Da、503Da、666Da、828Da和991Da；葡甘寡糖分子量鉴定优选凝胶渗透色谱(GPC)和基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)进行分子量鉴定。

本发明实施例中提供的葡甘寡糖系列组合物可以在制备抗炎药物中得到应用，也可以作为免疫细胞促进白细胞介素-10和转化生长因子-β1中至少一种物质表达的促进剂，还可以作为免疫细胞抑制肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素-1β中至少一种物质表达的抑制剂。葡甘寡糖系列组合物在天然免疫刺激方面表现出显著提高免疫抑制基因的表达的效果，其中，免疫细胞包括单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞、肥大细胞、辅佐细胞和以上细胞对应的前体细胞。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，具体步骤如下：

将重量为5g的天然来源的白芨多糖充分溶解在200ml去离子水中，加热至60℃，搅拌时长24h。将白芨多糖溶液进行冻干操作，得到白芨多糖冻干粉。称量500mg白芨多糖冻干粉溶于150ml去离子水，置于圆底烧瓶。然后称量50mg组合酶，以质量分数计包括：5％内切-1，4-β-甘露聚糖酶、5％β-甘露糖苷酶、5％β-葡糖苷酶以及85％纤维素酶，将组合酶同时充分溶解于圆底烧瓶中，加热至40℃，反应时长为24h，进行组合酶降解白芨多糖反应。反应结束后，加热至100℃，加热10min，灭活酶从而终止酶降解反应。然后将反应溶液进行过滤离心，收集寡糖上清液；将寡糖混合物通过Sephadex G-25葡聚糖层析进一步分离纯化，收集分离洗脱液，冻干后获得白芨寡糖组合物样品，DGM-1。

实施例2

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，具体步骤如下：

将重量为5g的天然来源的魔芋多糖充分溶解在200ml去离子水中，加热至60℃，搅拌时长24h。将魔芋多糖溶液进行冻干操作，得到魔芋多糖冻干粉。称量500mg魔芋多糖冻干粉溶于150ml去离子水，置于圆底烧瓶。然后称量50mg组合酶，以质量分数计包括：10％内切-1，4-β-甘露聚糖酶、10％β-甘露糖苷酶、10％β-葡糖苷酶以及70％纤维素酶，将组合酶同时充分溶解于圆底烧瓶中，加热至40℃，反应时长为24h，进行组合酶降解魔芋多糖反应。反应结束后，加热至100℃，加热10min，灭活酶从而终止酶降解反应。然后将反应溶液进行过滤离心，收集寡糖上清液；将寡糖混合物通过SephadexLH-20羟丙基葡聚糖凝胶层析进一步分离纯化，收集分离洗脱液，冻干后获得魔芋寡糖组合物样品，DGM-2。

实施例3

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，具体步骤如下：

将重量为5g的天然来源的魔芋多糖充分溶解在200ml去离子水中，加热至60℃，搅拌时长24h。将魔芋多糖溶液进行冻干操作，得到魔芋多糖冻干粉。称量500mg魔芋多糖冻干粉溶于150ml去离子水，置于圆底烧瓶。然后称量50mg组合酶，以质量分数计包括：10％内切-1，4-β-甘露聚糖酶、10％β-甘露糖苷酶、70％β-葡糖苷酶以及10％纤维素酶，将组合酶同时充分溶解于圆底烧瓶中，加热至40℃，反应时长为24h，进行组合酶降解魔芋多糖反应。反应结束后，加热至100℃，加热10min，灭活酶从而终止酶降解反应。然后将反应溶液进行过滤离心，收集寡糖上清液；将寡糖混合物通过制备级HPLC-C18色谱进一步分离纯化，收集分离洗脱液，冻干后获得魔芋寡糖组合物样品，DGM-3。

实施例4

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：酶降解过程所采用的酶仅包括内切-1，4-β-甘露聚糖酶。

实施例5

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：酶降解过程所采用的酶仅包括β-甘露糖苷酶。

实施例6

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：酶降解过程所采用的酶仅包括β-葡糖苷酶。

实施例7

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：酶降解过程所采用的酶仅包括纤维素酶。

实施例8

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：不同的组合酶配比，以质量分数计包括：20％内切-1，4-β-甘露聚糖酶、20％β-甘露糖苷酶、30％β-葡糖苷酶以及30％纤维素酶。

实施例9

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：采用液相色谱分离的方法进行分离纯化，洗脱液为水和乙腈，并控制水和乙腈体积比为1:1。

实施例10

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：采用羟丙基葡聚糖凝胶层析的方法，洗脱液为去离子水和甲醇，并控制去离子水和甲醇体积比2:1。

实施例11

本实施例提供一种葡甘多糖的降解方法，与实施例1不同之处仅在于：采用硅胶层析的方法，洗脱液为去离子水和甲醇，并控制去离子水和甲醇体积比5:1。

试验例1

测试实施例1-3中得到产品的结构，并由NMR一维图谱和NMR二维图谱进行解析，得到图1的结果，自上而下依次为：β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp(葡甘二糖)、β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp(葡甘三糖)、β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp(葡甘四糖)、β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp(葡甘四糖)、β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp(葡甘五糖)，β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Manp-(1→4)-β-D-Glcp(葡甘六糖)。

试验例2

利用高效液相色谱(HPLC)和凝胶渗透色谱(GPC)联用对制备实施例1-3中得到的葡甘寡糖组合物进行纯度和分子量分析，可以积分得到葡甘寡糖组合物样品的纯度以及分子量，结果如图2和表1所示。

表1产品纯度和分子量测试结果

试验例3

利用高效液相色谱(HPLC)对葡甘寡糖组合物的成分进行鉴定，结果如图3所示。

从图3可明显看出有六种寡糖物，包括葡甘二糖、葡甘三糖、葡甘四糖、葡甘五糖和葡甘六糖，构成了葡甘寡糖组合物。

试验例4

对实施例1中单一的葡甘寡糖组合物再进行进一步的分离，再利用纯化分离后的得到六种样品进行基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)分析进行分子量鉴定。

测试结果显示，六种样品的分子量(Mw)分别为342Da，503Da，666Da，828Da，991Da。

试验例5

利用在制备实例1-3中制备的葡甘寡糖组合物对小鼠来源的骨髓移植细胞(mBMDM，实验室方法从C57BL/6J小鼠体内提取原代细胞)进行诱导激化实验：将小鼠骨髓来源的巨噬细胞(5×10

通过图4-图7可知：在实施例1-3中制备的葡甘寡糖组合物均在白细胞介素-10(IL-10，典型的炎症与免疫抑制因子，IL-10能够抑制由巨噬细胞和Th1T细胞等细胞产生的促炎细胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF的合成)和转化生长因子-β1(TGF-β1可抑制免疫活性细胞的增殖)上强烈表达，表现了一定程度上的免疫抑制活性；而在肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的转录水平上相对于空白组变化不大，表明葡甘寡糖组合物促进炎症活力不大。

试验例6

测试实施例1和实施例9-11中产品的分离效果，结果见图8。

从图8中可以看出，采用葡聚糖层析和液相色谱分离的方式能够达到较好的分离效果，羟丙基葡聚糖凝胶层析和硅胶层析的方法分离效果较差。

综上，本发明提供的葡甘多糖的降解方法，其采用内切-1，4-β-甘露聚糖、β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶和纤维素酶中的至少一种酶对葡甘多糖进行酶解，酶解得到的葡甘寡糖组合物分子量均匀且纯度较高，具有显著抑炎生物活性，可以在制备抗炎药物中得到应用，也可以作为免疫细胞促进白细胞介素-10和转化生长因子-β1中至少一种物质表达的促进剂，还可以作为免疫细胞抑制肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素-1β中至少一种物质表达的抑制剂。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。