一种小麦免疫荧光检测试纸条及应用

技术领域

本发明属于检测试纸条技术领域，具体涉及一种小麦免疫荧光检测试纸条及应用。

背景技术

食物过敏反应是指人体对食物中致敏原物质产生的IgE介导的免疫反应，而导致消化系统内或全身性的变态反应。由于在全球范围内食物过敏的发病率持续上升，食物过敏已成为21世纪人们日益关注的食品安全的问题之一。

食物过敏具体地区分布、人群分布、时间分布以及种类分布等流行病学特征。欧盟2005年启动了EuroPrevall项目，该项目由来自中国、印度、加纳和19个欧洲国家的56个实验室和研究机构合作，旨在为食物致敏原的风险评估和管理提供研究基础和参考数据。在该项目中，Wong等选取北京城市和农村地区的16866名小学生开展了问卷和皮肤点刺实验，其中城市地区小学生IgE介导的食物过敏的发病率估计是4％，而农村地区估计为2％，其中食物过敏包括小麦。我国历史上首次进行的、国际级全国普通人群过敏疾病流行病学调查于2009年10月18日在北京正式宣布启动。根据我国食物过敏的特征，2009年卫生部出台了推荐性国家标准《预包装食品中的致敏原成分》GB/T 23779-2009，该标准提出的推荐性标识致敏原中含麸质谷类及其制品位列第一。

小麦及其相关产品广泛应用于我们日常饮食中，既是人们主要的食物来源，也是重要的食物蛋白来源之一。小麦过敏会影响内脏、呼吸道与皮肤的健康，引起运动激发过敏症、哮喘、鼻炎等。小麦过敏多见于迟发性过敏反应，有较高的患病率和漏诊率，且并发症状较多，严重影响过敏患者的生活，故小麦过敏是一个不可忽视的食品安全问题。

因此，开发一种能够检测食品中小麦过敏原成分和含量的检测手段并做包装标识至关重要，可为过敏患者避免很多的小麦过敏的危险。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小麦免疫荧光检测试纸条及应用，所述免疫荧光检测试纸条操作简便、准确度高、灵敏度高、能够快速定量检测小麦过敏原。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种小麦免疫荧光检测试纸条，所述试纸条包括由左到右首尾相连且依次固定在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体；所述混合抗体包括：抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体；

所述硝酸纤维素膜上包括平行的4条检测线和1条质控线；所述检测线上分别包被抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体；所述质控线上包被兔抗鼠IgG抗体；所述检测线上的包被抗体与所述荧光胶乳微球标记的混合抗体为配对抗体。

优选的，所述荧光胶乳微球的粒径为50～500nm。

优选的，所述荧光胶乳微球的制备方法，包括利用胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素；所述荧光标记包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或荧光素CY5。

优选的，所述混合抗体中，抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体的质量比为1:1:1:1。

优选的，4条所述检测线上包被抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体的包被浓度均为0.5～5.0μl/cm。

优选的，所述质控线包被兔抗鼠IgG抗体，包被浓度为0.5～5μl/cm。

本发明还提供了上述免疫荧光检测试纸条在检测小麦过敏成分中的应用。

优选的，所述小麦过敏成分包括Tri a 12、Tri a 14、Tri a 19和Tri a 26。

本发明还提供了一种检测食品中小麦过敏原成分的方法，包括以下步骤：滴加100～120μl的食品溶液于上述免疫荧光检测试纸条的样品垫上，15min后读取所述检测试纸条的荧光信号，根据标准曲线测定小麦过敏原的成分和含量；

所述标准曲线为，

其中x为过敏原浓度，单位IU/ml，y为荧光信号比值。

本发明提供了一种小麦免疫荧光检测试纸条，其结构如图1所示，依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装粘贴在PVC底板上。其中，结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体的混合抗体，在硝酸纤维素膜上依次包被抗Tri a 12抗体(T1线)、抗Tri a 14抗体(T2线)、抗Tri a19抗体(T3线)、抗Tri a 26抗体(T4线)和兔抗鼠IgG抗体(C线)，其中T1线、T2线、T3线、T4线为检测线，C线为质控线。本发明所述混合抗体和NC膜上包被的抗体分别配对，且混合抗体类似于二抗，NC膜上包被抗体类似于一抗。本发明能够准确定量检测食品中Tri a 12、Tria 14、Tri a 19和Tri a 26的含量，并且操作简便、准确性高，回收率应在(90％～110％)、灵敏度高(≤0.84ng/ml)。

附图说明

图1为本发明所述免疫荧光检测试纸条的结构图；

图2为荧光免疫层析法测定标准曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种小麦免疫荧光检测试纸条，所述试纸条包括从左到右首尾相连且依次固定在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体；所述混合抗体包括：抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体；

所述硝酸纤维素膜上包括平行的4条检测线和1条质控线；所述检测线上分别包被抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体；所述检测线上的包被抗体与所述荧光胶乳微球标记的混合抗体为配对抗体。

本发明所述免疫荧光检测试纸条的结构如图1所示，依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装粘贴在PVC底板上。本发明所述结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的混合抗体，所述荧光胶乳微球的粒径优选为50～500nm。本发明所述荧光胶乳微球的制备方法，优选包括利用胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素；所述荧光标记包括异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或荧光素CY5。

本发明所述结合垫的制备方法，优选包括：

(a)将荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球吸附结合，制备得到荧光胶乳微球；

(b)将生物素与所述混合抗体结合，制备得到生物素化混合抗体；

(c)将所述荧光胶乳微球和所述生物素化混合抗体混合，即得荧光胶乳微球标记的混合抗体；

(d)将所述荧光胶乳微球标记的混合抗体喷涂在结合垫上；步骤(a)和(b)之间不存在时间上的先后顺序。

在本发明中，步骤(a)中所述荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球的质量比优选为1:40；步骤(b)中所述生物素和混合抗体的体积比优选为1:4；步骤(c)中荧光胶乳微球和生物素化混合抗体的体积比优选为10:1。本发明所述混合抗体中，抗Tri a 12抗体、抗Tri a14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体的质量比优选为1:1:1:1。本发明对所述混合抗体中各抗体的来源并没有特殊限定，优选为常规的市售抗体。本发明步骤(d)中所述结合垫上所述荧光胶乳微球标记的混合抗体的喷涂量优选为2～10μl/cm。在本发明中，所述荧光胶乳微球标记的混合抗体均为二抗。

本发明所述硝酸纤维素膜上包括平行的4条检测线和1条质控线；所述检测线上分别包被抗Tri a 12抗体(T1线)、抗Tri a 14抗体(T2线)、抗Tri a 19抗体(T3线)和抗Tri a26抗体(T4线)；所述质控线优选包被兔抗鼠IgG抗体(C线，包被浓度为0.5～5μl/cm)。本发明所述硝酸纤维素膜的检测线上包被的抗体相当于一抗，分别与上述混合抗体(二抗)为配对抗体。

本发明对所述硝酸纤维素膜的制备方法并没有特殊限定，优选包括将包被缓冲液分别稀释所述抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体的混合抗体和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的五种抗体分别平行地划在硝酸纤维素膜上，当所述抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成分别包被抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a19抗体和抗Tri a 26抗体的检测区以及包被兔抗鼠IgG抗体的质控区。本发明所述检测区划线时，优选按照3mg/ml的稀释抗体浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12h；所述质控区划线时，优选按5mg/ml的稀释抗体浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上划线，该线与检测区的线平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12h。本发明在所述划线后，优选还包括用封闭液将硝酸纤维素膜于37℃封闭60min，取出后置37℃下烘干处理2h，封袋备用。

本发明优选依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装粘贴在PVC底板上，按照要求(4mm)用切条机将其切割成如图1所示的试纸条。

本发明还提供了上述免疫荧光检测试纸条在检测小麦过敏成分中的应用。

本发明所述小麦过敏成分优选包括Tri a 12、Tri a 14、Tri a 19和Tri a 26。

本发明还提供了一种利用上述免疫荧光检测试纸条检测小麦过敏成分的方法，优选包括：将待测样本滴加100～120μl于样品垫上，15min后质控区反应结束后将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小，进行定量测定。本发明将所述待测样本滴加与样品垫上后，样品经过结合垫上的混合抗体进行反应结合，再依次经过检测区的抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体进行反应，最后达到质控区反应结束。

下面结合实施例对本发明提供的一种小麦免疫荧光检测试纸条及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、结合垫的制备

1)荧光胶乳微球的制备：用吸附缓冲液(50mM、pH5.8的柠檬酸盐缓冲液)稀释粒径为400nm胶乳微球至终浓度30mg/ml，体积为6ml，制得胶乳微球悬浮液；按照1:50～500的体积比添加红色荧光素罗丹明标记连霉亲和素在吸附缓冲液中，终体积为6ml；将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有红色荧光素罗丹明标记霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1～2h，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液(含有0.06％BSA的吸附缓冲液)溶解，放置4℃保存，备用。

2)生物素化混合抗体的制备

将抗Tri a 12抗体(美国abcam，货号：ab96676)；抗Tri a 14抗体(美国abcam，货号：ab53538)；抗Tri a 19抗体(西宝生物，货号：A1052)；抗Tri a 26抗体(美国Exalpha，货号：AWG)的混合抗体用0.2MpH4.7醋酸钠缓冲液稀释至3ml，交互用0.2M pH4.7醋酸钠缓冲液对混合抗体充分透析；用1ml DMSO溶解1ml的NHSB，得到NHSB溶液；向上述3ml混合抗体加入25μLNHSB，搅拌2～4h，继续室温搅拌10min，然后用20mM、pH3.9PBS缓冲液透析，即得生物素化混合抗体。

3)荧光胶乳微球标记小麦抗体的制备

将步骤1)制得的荧光胶乳微球和步骤2)制得的生物素化混合抗体(按照10:1比例)混合在一起，反应30min后离心，沉淀用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。

4)将荧光胶乳微球标记小麦混合抗体按照2～10μl/cm的用量喷涂在结合垫上。

2、硝酸纤维素膜的制备

1)膜处理取一张硝酸纤维素膜，做好标记后放在pH膜处理液(TBS)中浸泡5～10min；

2)组装点样装置，将浸泡过的硝酸纤维素膜放在平铺的垫子上，放上抗体点样板子，上面要留出贴标记纸的地方。

3)小麦抗体检测区的制备：将抗Tri a 12抗体(杭州敏泰生物，货号：MO-0806)、抗Tri a 14抗体(杭州敏泰生物，货号：MO-0807)、抗Tri a 19抗体(杭州敏泰生物，货号：MO-0808)和抗Tri a 26抗体(杭州敏泰生物，货号：MO-0809)分别依次按3mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12h。

4)质控区的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上划线，该线与检测区的线平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12h。

5)用封闭液(100ml PBS和0.5g BSA配备)将硝酸纤维素膜于37℃封闭60min，取出后置37℃下烘干处理2h，封袋备用。

3、试纸条组装

依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装粘贴在PVC底板上，按照要求(4mm)用切条机将其切割成如图1所示的试纸条。

4、待检抗原检测

将被检测样本滴加100～120μl于样品垫上，后经过结合垫上的抗小麦混合抗体进行反应结合，再依次经过检测区的抗Tri a 12抗体、抗Tri a 14抗体、抗Tri a 19抗体和抗Tri a 26抗体混合抗体进行反应，最后达到质控区反应结束，后将试纸条放于专门的荧光信号读取仪器中，读取荧光信号的大小，进行定量测定。

剂量－反应曲线的线性：测定试剂盒中校准品配制的校准液系列，浓度分别为100.00、50.00、17.50、3.50、0.35IU/ml，用双对数或其它适当的数学模式进行拟合，模型拟合结果应符合分析内精密度(CV％)应≤10.0％；分析间精度(CV％)应≤15.0％。

剂量－反应曲线线性分析结果显示，0.35～100IU/ml范同内，各浓度与测试值呈平滑递增曲线，测量下限(CV<15％测试系统所能检测到的最低浓度)为0.35IU/ml，曲线方程如图2所示：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。