一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法

技术领域

本发明涉及菌丝鉴定技术领域，特别涉及一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法。

背景技术

秀珍菇属真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。秀珍菇营养丰富，富含多种蛋白质、氨基酸等，风味独特，口感爽滑，深受广大消费者喜爱，秀珍菇多糖还具抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗突变和提高机体免疫力等多种生物学功能。在秀珍菇栽培出菇中，完全使用如玉米芯、棉籽壳、麦麸等农业副产品作为培养基配料，可以实现夏季栽培，符合现代人对绿色食品的要求，因此秀珍菇一直深受人们的喜爱。

秀珍菇是双位点控制的异宗结合型真菌，在传统育种过程中，秀珍菇可通过单孢分离获得同核体，对不同交配型的菌丝进行杂交可以获得杂交菌株，通过出菇试验等方式进行可对菌株进行筛选，可获得高产优质高效的秀珍菇品种。但是在杂交育种过程中，单孢同核体的分离及鉴定是育种的关键环节，传统方式是通过显微镜观察是否存在锁状联合的方式来进行判断，费时费力，也存在假阳性的情况，不适合现代食用菌高通量杂交育种的筛选的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，可以对多个品种的单孢分离菌丝进行同核体鉴定，分子标记筛选效率高。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，包括以下步骤：

(1)对秀珍菇进行栽培出菇，待秀珍菇L、T和N菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于包含灭菌滤纸条的孢子收集器中；

(2)将收集的孢子置于无菌水中，使用血球计数板对孢子悬浮液进行孢子计数，通过梯度稀释法对孢子悬浮液进行稀释，而后涂布9cm薄PDA平板，置于25℃培养箱中培养；

(3)待孢子刚萌发时，通过20倍显微镜镜检，挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得秀珍菇单孢分离菌株；

(4)对单孢分离菌株进行培养，采用CTAB法提取单孢分离株的基因组DNA，然后以InDel03-H引物为扩增引物，进行PCR扩增反应，所得PCR产物经电泳检测后，对秀珍菇单孢分离株带型进行区分。

优选的，所述步骤(4)中的电泳检测为将PCR扩增产物，取5μL混合液在1.2％的含绿如蓝DNA染色剂的琼脂糖凝胶上进行电泳。

优选的，所述电泳的电压为120V，电泳时间为20min，在紫外凝胶成像系统上进行拍照。

优选的，所述步骤(4)中的PCR扩增反应的条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，52℃退火5s，68℃延伸1s，共35个循环，68℃补平4min。

优选的，所述步骤(4)中的PCR扩增反应的体系为：总体积为15μL，7.5μL的KODonemixture混合液，待扩增基因特异性引物(10nM)对各0.45μL，60ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O5.6μL。

优选的，所述步骤(4)中的PCR扩增反应选用的酶为东洋纺KODone-plus套装。

优选的，所述步骤(1)中的孢子收集器置于25℃培养箱中收集其孢子。

本发明设计和筛选获得一对与交配型B在同一染色体的InDel标记，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳，可以对3个品种的单孢分离菌丝进行同核体鉴定，然后通过传统显微镜观察锁状联合的方式对分子标记的筛选进行分子标记筛选效率的检测，效率高。

附图说明

图1为本发明InDel03-H标记设计位点的结构示意图；

图2为本发明72份单孢个体的同核体分子标记鉴定情况图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

一种秀珍菇同核体菌丝鉴定的InDel标记方法，包括以下步骤：

(1)对秀珍菇进行栽培出菇，待秀珍菇L、T和N菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于包含灭菌滤纸条的孢子收集器中，孢子收集器置于25℃培养箱中收集其孢子；

(2)将收集的孢子置于无菌水中，使用血球计数板对孢子悬浮液进行孢子计数，通过梯度稀释法对孢子悬浮液进行稀释，而后涂布9cm薄PDA平板，置于25℃培养箱中培养；

(3)待孢子刚萌发时，通过20倍显微镜镜检，挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得秀珍菇单孢分离菌株；

(4)对单孢分离菌株进行培养，采用CTAB法提取单孢分离株的基因组DNA，然后以InDel03-H引物为扩增引物，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，52℃退火5s，68℃延伸1s，共35个循环，68℃补平4min，所得PCR产物经电泳检测后，对秀珍菇单孢分离株带型进行区分。

步骤(4)中的电泳检测为将PCR扩增产物，取5μL混合液在1.2％的含绿如蓝DNA染色剂的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳的电压为120V，电泳时间为20min，在紫外凝胶成像系统上进行拍照；

所述步骤(4)中的PCR扩增反应的条件为：98℃预变性3min，98℃变性10s，52℃退火5s，68℃延伸1s，共35个循环，68℃补平4min；

步骤(4)中的PCR扩增反应的体系为：总体积为15μL，7.5μL的KODone mixture混合液，待扩增基因特异性引物(10nM)对各0.45μL，60ng/μL的DNA模板1μL，ddH2O 5.6μL；

步骤(4)中的PCR扩增反应选用的酶为东洋纺KODone-plus套装；

获得一对与交配型B在同一染色体的InDel标记，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳，可以对3个品种的单孢分离菌丝进行同核体鉴定，然后通过传统显微镜观察锁状联合的方式对分子标记的筛选进行分子标记筛选效率的检测，效率高；

表1 InDel03-H分子标记同核体筛选及显微镜镜检汇总表

表1为InDel03-H分子标记同核体筛选及显微镜镜检汇总表；

同核体或异核体的标准为：同核体可扩增出其中一条条带，异核体可扩增出两条条带；于此同时，本研究对单孢分离个体进行显微镜镜检观察及拍摄照片，通过分子标记和显微镜镜检发现该分子标记对同核体筛选的正确率为95％；

本发明基于基因组、重测序数据分析对与秀珍菇matB交配型连锁的InDel位点设计分子标记InDel03-H，建立以matB交配型基因为分子标记的快速鉴定秀珍菇菌株单孢分离株同核体与异核体的方法；

如图1所示，为本发明InDel03-H标记设计位点的结构示意图；

如图2所示，为本发明72份单孢个体的同核体分子标记鉴定情况图，图中A、B、C为亲本N及其单孢分离个体的InDel03-H扩增条带；D和E为亲本T菌株及其单孢分离个体的InDel03-H扩增条带；F为亲本L菌株及其单孢分离个体的InDel03-H扩增条带；M为markerDL2000。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。