一种鉴别7种动物源性成分的碟式微流控芯片

技术领域

本发明涉及肉及肉制品安全检测领域，具体涉及一种鉴别7种动物源性成分的碟式微流控芯片，所述的7种动物为规模化养殖的猪、马、牛、羊、北极狐、鸡和鸭，本发明根据7个物种的16S基因建立特异性LAMP检测，并借助微流控技术建立可以同时检测7个物种的荧光LAMP碟式芯片快速检测方法。

背景技术

动物源成分真伪检测鉴别是食品与饲料质量安全重要内容，对维护人民健康安全、维护经济秩序和社会稳定、进出口食品与饲料监管均具有重要意义。近年来，国内外肉类产品掺杂使假违规犯罪行为屡被曝光，如国内某些不法商人采用低价值物种肉类如鸭肉、猪肉甚至狐狸肉、水貂肉等掺入甚至冒充高价值的牛、羊肉制品，并过量添加色素、香精等杂质。2013年1月，“马肉风波”事件影响欧洲16国，迫使欧盟重新审查其食品追溯体系和标签制度，并紧急出台措施要求成员国对市场流通的牛肉制品加强DNA抽检。动物源成分检测鉴别也是饲料安全重要内容，涉及传染性海绵状脑病(TSE)、非洲猪瘟、高致病性禽流感等重大疫病防控。自1987年欧洲发生疯牛病以来，为防控疯牛病，世界各国家均先后制定法律、法规，严格控制饲料中动物源性成分的使用；我国对来自“非疯牛病风险可忽略”国家和地区的饲用动物产品规定禁止含反刍动物源(牛、羊、鹿等)成分。为防控高致病性禽流感、非洲猪瘟、口蹄疫等其他重大动物疫病，各国也制定了针对饲料中特定动物源成分的禁令。

在现行国家标准中如猪、牛羊等多个物种的鉴定方法都是以mtDNA为靶标的DNA分析技术。尽管国家标准和一些发明方法中可以实施对鹿肉和猪肉等鉴定，但是目前的物种鉴定方法中对牦牛肉、鹿肉和驼肉等产制品仍没有一种高效的鉴定方法。因此，建立一种简便易行且可以同时鉴定多种动物源性成分的的检测方法对于提高检测工作效率以及对未知动物源性成分的溯源鉴定都具有重要意义。

微流控技术又可称为微型全分析系统(Miniaturized totalanalysis systems，uTAS)及芯片实验室，是一种基于微机械加工、生物技术和纳米化学分析等技术发展而来的便携式高通量快速检测技术。微流控芯片是实现微流控技术的平台，其内部结构包括微米级的管道、腔室、气/液泵或阀门等流体器件，可对由微量生物大分子物质及化学试剂等成分组成的微流体进行控制。与其他检测技术相比，微流控芯片检测技术具有以下优势：一是缩减试剂成本；二是能够检测微量样品；三是检测通量高；四是微流体反应速率高，检测过程耗时短；五是自动化程度高，确保了检测结果的准确性、重复性和稳定性；六是便携性强，适用于现场检测。因此，微流控芯片技术在食品安全、医疗卫生及环境检测方面具有良好的应用前景。

因此，将微流控技术应用于猪、马、牛、羊、北极狐、鸡和鸭的7个物种的一次性快速检测对于提高检验检疫部门监管工作效率和食品掺假样本调查鉴定方面都有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别7种动物源性成分的碟式微流控芯片，分别针对已实现规模化养殖的猪、马、牛、羊、北极狐、鸡、鸭的16S基因建立特异性LAMP方法，借助微流控技术同时检测7个物种，可在60min时间内实现对以上7个物种的检测，特异性良好，待检测的物种之间不发生交叉反应。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种鉴别7种动物源性成分的碟式微流控芯片，所述的碟式微流控芯片包括分别用于检测猪、马、牛、羊、北极狐、鸡和鸭的基因中任1-7项的反应池，在所述的反应池中进行LAMP扩增反应；

所述的检测猪基因的反应池中的用于核苷酸扩增的引物组具体为：

Z-F36序列为SEQ IDNO:1，Z-B36序列为SEQ IDNO:2，Z-FIP6序列为SEQ IDNO:3，Z-BIP6序列为SEQ IDNO:4，Z-LF6序列为SEQ IDNO:5，Z-LB6序列为SEQ IDNO:6；

所述的检测马基因的反应池中的用于核苷酸扩增的引物组具体为：

M-F36序列为SEQ IDNO:7，M-B36序列为SEQ IDNO:8，M-FIP6序列为SEQ IDNO:9，M-BIP6序列为SEQ IDNO:10，M-LF6序列为SEQ IDNO:11，M-LB6序列为SEQ IDNO:12；

所述的检测牛基因的反应池中的用于核苷酸扩增的引物组具体为：

N-F34序列为SEQ IDNO:13，N-B34序列为SEQ IDNO:14，N–FIP4序列为SEQ IDNO:15，N–BIP4序列为SEQ IDNO:16，N–LF4序列为SEQ IDNO:17，N–LB4序列为SEQ IDNO:18；

所述的检测羊基因的反应池中的用于核苷酸扩增的引物组具体为：

Yang-F35序列为SEQ IDNO:19，Yang-B35序列为SEQ IDNO:20，Yang–FIP5序列为SEQ IDNO:21，Yang–BIP5序列为SEQ IDNO:22，Yang–LF5序列为SEQ IDNO:23，Yang–LB5序列为SEQ IDNO:24；

所述的检测北极狐基因的反应池中的用于核苷酸扩增的引物组具体为：

H-F31序列为SEQ IDNO:25，H-B31序列为SEQ IDNO:26，H–FIP1序列为SEQ IDNO:27，H–BIP1序列为SEQ IDNO:28，H–LF1序列为SEQ IDNO:29；

所述的检测鸡基因的反应池中的用于核苷酸扩增的引物组具体为：

J-F37序列为SEQ IDNO:30，J-B37序列为SEQ IDNO:31，J–FIP7序列为SEQ IDNO:32，J–BIP7序列为SEQ IDNO:33，J–LF7序列为SEQ IDNO:34；

所述的检测鸭基因的反应池中的用于核苷酸扩增的引物组具体为：

YA-F33序列为SEQ IDNO:35，YA-B33序列为SEQ IDNO:36，YA–FIP3序列为SEQIDNO:37，YA–BIP3序列为SEQ IDNO:38，YA–LF3序列为SEQ IDNO:39，YA–LB3序列为SEQIDNO:40。

本发明还有一个目的是提供一种应用所述的鉴别7种动物源性成分的碟式微流控芯片的检测方法，具体步骤为：

S1、制备所述的碟式微流控芯片，

S2、提取7种动物待检样本的核酸；

S3、恒温扩增反应体系的配制：在体系区，吸取恒温扩增试剂加入离心管中，盖好管盖后将所述离心管移至模板加样区；在所述模板加样区，加入待检样本的核酸

S3、碟式微流控芯片加样：在模板区，吸取配制好的核酸扩增反应体系，从进出样口将所述配制好的核酸扩增反应体系加入到所述碟式微流控芯片主通道中；取封口膜，覆盖于进出样口上；将加样后的所述碟式微流控芯片在低速离心机上离心备用；

S4、恒温扩增：预热恒温扩增微流控芯片核酸分析仪；将所述碟式微流控芯片送入核酸分析仪中；在63℃下恒温扩增60分钟；检测完成后使用软件对荧光数据进行处理和分析。

本发明还有一个目的是提供所述的鉴别7种动物源性成分的碟式微流控芯片和检测方法在检测肉制品的源性成分中的应用或用途。

有益效果如下：

本发明提供的微流控芯片中任一反应池中均只与对应物种DNA发生反应，与其他物种不发生交叉反应，灵敏度试验显示猪、马、牛、羊、北极狐、鸡、鸭LAMP方法在碟式芯片上的最低检测限分别为：1×10E-2ng/μL，1ng/μL，1×10E-2ng/μL，1×10E-3ng/μL，1ng/μL，1×10E-2ng/μL，1×10E-1ng/μL。

附图说明

图1是本发明的微流控芯片中放入狐狸样品中的荧光归一化曲线；

图2是本发明的微流控芯片中放入鸡样品中的荧光归一化曲线；

图3是本发明的微流控芯片中放入马样品中的荧光归一化曲线；

图4是本发明的微流控芯片中放入牛样品中的荧光归一化曲线；

图5是本发明的微流控芯片中放入鸭样品中的荧光归一化曲线；

图6是本发明的微流控芯片中放入羊样品中的荧光归一化曲线；

图7是本发明的微流控芯片中放入猪样品中的荧光归一化曲线；

图8是本发明的微流控芯片中放入鸭和马样品中的荧光归一化曲线；

图9是本发明的微流控芯片中放入猪和牛样品中的荧光归一化曲线；

图10是本发明的微流控芯片中放入鸡、鸭、猪、狐狸样品中的荧光归一化曲线；

图11是本发明的微流控芯片中放入猪、马、牛、羊、北极狐、鸡、鸭样品中的荧光归一化曲线；

图12是本发明的设计的猪引物管式LAMP方法特异性检测结果；

图13是本发明的设计的马引物管式LAMP方法特异性检测结果；

图14是本发明的设计的牛引物管式LAMP方法特异性检测结果；

图15是本发明的设计的羊引物管式LAMP方法特异性检测结果；

图16是本发明的设计的北极狐引物管式LAMP方法特异性检测结果；

图17是本发明的设计的鸡引物管式LAMP方法特异性检测结果；

图18是本发明的设计的鸭引物管式LAMP方法特异性检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进一步详细说明。

实施例1

一、猪、马、牛、羊、北极狐、鸡样品均由市场随机购买的样品。

二、合成引物SEQ IDNO:1-SEQ IDNO:40。

本发明的引物是通过研究了猪、马、牛、羊、北极狐、鸡的16S基因序列，发现了7个物种不发生交叉反应，并且灵敏度高的序列结构，利用Primer Explorer version 5在线引物设计软件进行引物设计，设计并筛选到7套用于LAMP反应的引物如表1所示，引物合成交由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

表1

所述的猪、马、牛、羊、狐狸、鸡和鸭七个物种的靶序列依次为SEQ IDNO:41-47所示。

三、DNA提取

样品基因组的提取，按照DNA提取试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN，德国)操作说明书进行。提取的DNA均置于-80℃冰箱内保存备用。

四、管式LAMP方法的优化与建立

为实时监测不同反应条件下RT-LAMP的进展情况，反应条件的优化借助环介导等温扩增实时浊度仪LA-320c进行，主要对反应的引物浓度、退火温度(60-65℃)、反应时间进行优化(表2)。

表2

经过一系列优化，确定RT-LAMP方法的反应体系(25μL)为：FIP和BIP各40pmol，F3和B3各5pmol，LF和LP各20pmol，2×Reaction Mix 12.5μL(Tris-HCl(pH 8.8)40mM，KCl20mM，MgSO

五、管式LAMP特异性及敏感性试验

验证所建立的7种LAMP方法的特异性，用所建方法对上述7个物种进行检测，观察是否由交叉反应发生。结果如图12-18所示，7种方法的特异性良好，均只与对应物种DNA发生反应，与其他物种不发生交叉反应。

另外，按照优化后的条件和程序对本方法灵敏度进行评估，采用10倍系列稀释的相应基因组DNA((10，1，10-1,10-2,……,10-6倍稀释ng/μL)进行，来确定本方法的最低检测限。结果显示猪、马、牛、羊、北极狐、鸡、鸭LAMP方法的最低检测限分别为：1×10E-3ng/μL，1ng/μL，1×10E-2ng/μL，1×10E-4ng/μL，1ng/μL，1×10E-2ng/μL，1×10E-1ng/μL。

六、碟式LAMP方法敏感性及特异性分析

用优化后的LAMP检测体系和方法，转入碟式芯片内进行进一步验证。每一张碟片的11个反应池内分别预点制了7个物种的特异性LAMP引物、阳性对照和3个空白对照。可实现对样本种7个指标的同时检测。首先用碟片对7种样本分别进行检测，确定方法的特异性。另外，按照优化后的条件和程序对本方法灵敏度进行评估，采用10倍系列稀释的相应基因组DNA((10，1，10-1,10-2,……,10-6倍稀释ng/μL)进行，来确定本方法的最低检测限。

结果显示，所点制的碟片，仅与样本一直的引物孔发生扩增反应，其它孔并未发生交叉反应。说明特异性在别是芯片中依然成立。同时，灵敏度试验显示，猪、马、牛、羊、北极狐、鸡、鸭LAMP方法在碟式芯片上的最低检测限分别为：1×10E-2ng/μL，1ng/μL，1×10E-2ng/μL，1×10E-3ng/μL，1ng/μL，1×10E-2ng/μL，1×10E-1ng/μL。相比较管式LAMP方法，猪、羊LAMP方法的灵敏度下降10个梯度，其它灵敏度不变。考虑反应体积减少，模板数量相应减少所致，属正常现象。

如图1-11所示，配置最低检测限度浓度的7种物种的模板和混合模板，进行检测，检测结果显示，每个指标均可顺利检出，说明混合模板并未影响方法的灵敏度和检测的顺利工作，

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林工商学院

<120> 一种鉴别7种动物源性成分的碟式微流控芯片

<130> 20201223

<160> 47

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtggcaaaa tagtgagaag acttgaaaat tctttctcgg acaaccagct 50

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<212> DNA

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<400> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgattatata ttttgactgg 20

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cctgaaggtt aaggtttgtg tgttggggat aaatcaacaa gacgaga 47

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acttttgatt gaatcagcaa tttcgggtct ggatttaaat cactcg 46

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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actccttatg agttaacagt ttcgggtcta gtctttaaaa tcgctcg 47

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttggggtgac ctcggagaac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

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<212> DNA

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gtaaccagct atcaccagg 19

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<212> DNA

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<400> 27

tcgggggact tagcttaagt tccttttgca taatgaacta gcca 44

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<211> 44

<212> DNA

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accagacgag ctacctatga actctaccta caaatcttct cact 44

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<212> DNA

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aggatcaact catctatgtg gca 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

agtattcccg tgcaaaaacg a 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gagttggtct tagtgaagag t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggacccagtg gggctgtgta aggacgagaa gaccctgtgg aa 42

<210> 33

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

tccacccaca cataaacccc tgtggtctgt gggtttggag gatt 44

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

aaggtggtcg tgattttaaa g 21

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaagcgggga tgtgaacat 19

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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gggtggctct aagtaaagag g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gccccggtgg gtttagtctt aggacgagaa gaccctgtgg aa 42

<210> 38

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

tacagacatc gcagagcatg gctgtggtct tgtttttgga gga 43

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gcggtggccg ttgattttta ag 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gcgaccttgg agaacaacag a 21

<210> 41

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<212> DNA

<213> 猪16S基因

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tcacctaaca ttaaagtata ggagatagaa atttttatcc tgacgctata gagatagtac 120

cgtaagggaa agatgaaaga ataaaataaa agtaaaaaaa agcaaagatt accccttcta 180

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cggactaatc tattgaaaca tagaagcaat aatgttaata tgagtaacaa gaagcctttc 660

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ctcagagata attaatgatt taatcttaac ctaattaact cataataaat ccagccctag 1560

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<211> 1582

<212> DNA

<213> 马16S基因

<400> 42

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caccaaacca ttaaagtata ggagatagaa attttaactt ggcgctatag agaaagtacc 120

gtaagggaac gatgaaagat gcattaaaag tactaaacag caaagcttac cccttttacc 180

ttttgcataa tgatttaact agaataaact tagcaaagag aacttaagct aagcaccccg 240

aaaccagacg agctacctat gaacagttac aaatgaacca actcatctat gtcgcaaaat 300

agtgagaaga ttcgtaggta gaggtgaaaa gcccaacgag cctggtgata gctggttgtc 360

cagaaacaga atttcagttc aaatttaaat ttacctaaaa actactcaat tctaatgtaa 420

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gagtaagaac aagataaacc catagttggc ttaaaagcag ccatcaatta agaaagcgtt 540

caagctcaac gacacatcta tcttaatccc aacaatcaac ccaaactaac tcctaatctc 600

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ttaaacggcc gcggtatcct aaccgtgcaa aggtagcata atcacttgtt ccctaaatag 960

ggacttgtat gaatggccac acgagggttt tactgtctct tacttccaat cagtgaaatt 1020

gaccttcccg tgaagaggcg ggaatgacta aataagacga gaagacccta tggagcttta 1080

attaactgat tcacaaaaaa caacacacaa accttaacct tcagggacaa caaaactttt 1140

gattgaatca gcaatttcgg ttggggtgac ctcggagaac aaaacaacct ccgagtgatt 1200

taaatccaga ctaaccagtc aaaatatata atcacttatt gatccaaacc attgatcaac 1260

ggaacaagtt accctaggga taacagcgca atcctattcc agagtccata tcgacaatta 1320

gggtttacga cctcgatgtt ggatcaagac atcctaatgg tgcaaccgct attaagggtt 1380

cgtttgttca acgattaaag tcttacgtga tctgagttca gaccggagta atccaggtcg 1440

gtttctatct attctatact tttcccagta cgaaaggaca agaaaagtag ggcccacttt 1500

acaagaagcg ccctcaaact aatagatgac ataatctaaa tctaactaat ttataacttc 1560

taccgcccta gaacagggct cg 1582

<210> 43

<211> 1571

<212> DNA

<213> 牛16S基因

<400> 43

actagaccta gcccaaagat accctctcga ctaaacaacc aagatagaat aaaacaaaac 60

atttaatccc aatttaaagt ataggagata gaaatctaag tacggcgcta tagagaaagt 120

accgcaaggg aacgatgaaa gaaaaaaact aaaagtataa aaaagcaaag attacccctt 180

gtaccttttg cataatgaat taactagtat aagacttaac aaaatgaatt ttagctaagc 240

agcccgaaac cagacgagct actcacaaac agtttaccaa gaactaactc atctatgtgg 300

caaaatagtg agaagatttg taagtagagg tgacatgcct aacgagcctg gtgatagctg 360

gttgtccaga aaatgaatct aagttcagct ttaaagatac caaaaattca aataaacccc 420

actgtagctt taaaagttag tctaaaaagg tacagccttt tagaaacgga tacaaccttg 480

actagagagt aaaatttaac actaccatag taggcctaaa agcagccatc aattaagaaa 540

gcgttaaagc tcaacaacaa aaattaaata gattccaaca acaaatgatt aactcctagc 600

cccaatactg gactaatcta ttatagaata gaagcaataa tgttaatatg agtaacaaga 660

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caataaaaat aatccaacaa taaacaattt attgattata ctgttaaccc aacacaggag 780

tgcatctaag gaaagattaa aagaagtaaa aggaactcgg caaacacaaa ccccgcctgt 840

ttaccaaaaa catcacctcc agcattccca gtattggagg cattgcctgc ccagtgacaa 900

ctgtttaacg gccgcggtat cctgaccgtg caaaggtagc ataatcattt gttctctaaa 960

taaggacttg tatgaatggc cgcacgaggg ttttactgtc tcttacttcc aatcagtgaa 1020

attgaccttc ccgtgaagag gcgggaatgc acaaataaga cgagaagacc ctatggagct 1080

ttaactaacc aacccaaaga gaatagattt aaccattaag gaataacaac aatctccatg 1140

agttggtagt ttcggttggg gtgacctcgg agaataaaaa atcctccgag cgattttaaa 1200

gactagaccc acaagtcaaa tcactctatc gctcattgat ccaaaaactt gatcaacgga 1260

acaagttacc ctagggataa cagcgcaatc ctattcaaga gtccatatcg acaatagggt 1320

ttacgacctc gatgttggat caggacatcc tgatggtgca accgctatca aaggttcgtt 1380

tgttcaacga ttaaagtcct acgtgatctg agttcagacc ggagtaatcc aggtcggttt 1440

ctatctatta cgtatttctc ccagtacgaa aggacaagag aaataaggcc aactttaaat 1500

caagcgcctt aagacaacca atgataacat ctcaactgac aacacaaaac cctgccctag 1560

aacagggctt a 1571

<210> 44

<211> 1573

<212> DNA

<213> 羊16S基因

<400> 44

actatatcta gcccaatccc ccccccccat ctaaattacc aaaacagtct aaaacaaaac 60

atttacccca attaaagtat aggagataga aattttaaat atggcgctat agagaaagta 120

ccgtaaggga atgatgaaag aaaaagaatt aaagtacaaa aaagcaaaga ttaacccttg 180

taccttttgc ataatgaatt aacgagcaaa aaacttaaca aaacgaattt tagctaagta 240

acccgaaacc agacgagcta ctcatgggca gtttatcaga accaactcat ctatgtggca 300

aaatagtgag aagacccata agtagaggtg acatgcctaa cgagcctggt gatagctggt 360

tgtccagaaa atgaatttta gttcagcttt aaagatacca aaaatataaa taaattttac 420

tgtattttta aaagttagtc taaaaaggtt cagcctttta gaaatggata caaccttcac 480

tagagagtaa gactttacaa caccatagta ggcctaaaag cagccatcaa ttaagaaagc 540

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ctaatactgg accactctat tattaaatag aagcaataat gttaatatga gtaacaagaa 660

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aataaaaaca acctaacgat aaataattta ttaattacac tgttaaccca acacaggagt 780

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aaggacttgt atgaacggcc acacgagggt tttactgtct cttacttcca atcagtgaaa 1020

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taactaacta gtccaaaaga aataaattta accactaagg gataacaaca tcctttatgg 1140

actagcagtt ttggttgggg tgacctcgga gaacaagaga tcctccgagc gattttaaag 1200

actagactta caagtcaaat caaattatcg cttattgatc caaaaaactt gatcaacgga 1260

acaagttacc ctagggataa cagcgcaatc ctattcaaga gtccatatcg acaatagggt 1320

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tgttcaacga ttaaagtcct acgtgatctg agttcagacc ggagcaatcc aggtcggttt 1440

ctatctgtta tgtatttctc ccagtacgaa aggacaagag aaataaggcc aacttcaaca 1500

aagcgcctta aaccaattaa tgaccctatc tcaattaatt ttacaaacaa aacctgccct 1560

agaaaagggc cta 1573

<210> 45

<211> 1579

<212> DNA

<213> 狐狸16S基因

<400> 45

acgaaagcta gcccaatcag ctttaaatta aactgttatg taatcgcaaa ataaaacatt 60

tagttaaaat attaaaagta taggagatag aaattctaat tggagctata gagacagtac 120

cgtaagggaa tgatgaaaga cattttcaaa gtacaaaaca gcaaagatta taccttctac 180

cttttgcata atgaactagc cagaaataac ttaacaaaga gaacttaagc taagtccccc 240

gaaaccagac gagctaccta tgaacaatct aaaaggatca actcatctat gtggcaaaat 300

agtgagaaga tttgtaggta gaggtgaaaa gcctaacgag cctggtgata gctggttacc 360

cacaaataga attttagttc aactttaaat ttaccaaaaa aaaacaaagt tctaatgtaa 420

atttaaaata taatctaaaa aggtacagct ttttagaaca aggacacaac ctttattaga 480

gagtaaatac taacacaacc atagttggcc taaaagcagc catcaattga gaaagcgttc 540

aagctcaaca aataatgcaa cttaatccca accatattgc ataaactcct aacttacccc 600

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tccccgcata agcttatatc agaaacggat aaaccactga tagttaacaa cctgataaga 720

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aggaaagatt aaaagaagta aaaggaactc ggcaaacaca aaccccgcct gtttaccaaa 840

aacatcacct ccagcattcc cagtattgga ggcactgcct gcccagtgac gtccgttaaa 900

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tcccgtgaag aggcgggaat atcataataa gacgagaaga ccctatggag ctttaattaa 1080

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ctaacaattt aggttggggt gacctcggaa tataaaaaaa ctcccgagtg attaaaattt 1200

agacctacca gtcaaaatgt atcatcactt attgatccaa taatcattga tcaacggaac 1260

aagttaccct agggataaca gcgcaatcct atttaagagt tcatatcgac aatagggttt 1320

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ttcaacgatt aaagtcctac gtgatctgag ttcagaccgg agtaatccag gtcggtttct 1440

atctattaaa taatttctcc cagtacgaaa ggacaagaga aatagggcct accttacaga 1500

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<210> 46

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cttgcccccc ctctagcccg acaaactcgt acccttaaca taaaaaactt acctccccct 60

cttaaccaaa acattataaa ttgtcccagt ataggcgata gaaaagacta ccccggcgca 120

atagaggcta actgtaccgc aagggaaaga tgaaatagca atgaaaacca taagcaaaaa 180

acagcaaaga ccaacccttg taccttttgc atcatgattt agcaagaaca accaagcaaa 240

gtgagctaaa gtttgccttc ccgaaaccca agcgagctac ttgcgagcag ctaaaatttg 300

agcgaacccg tctctgttgc aaaagagtgg gatgacttgc cagtagaggt gaaaagccta 360

ccgagctggg tgatagctgg ttacctgtca aacgaatcta agttccccct taacccaccc 420

cctaaagaca cccacctttg tcaaccttga gaacgttggg gttaagagca attcgatggg 480

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gcactgtggg ccttcaagca gccaccaaca aaagagtgcg tcaaagctcc ctcattaaaa 600

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attattaaca gaactcaact tataccccca cactaacaag caatacgtat tcctcaatct 780

gttaagccaa cccaggagcg cccacaggat gattaaaacc tacagaagga actcggcaaa 840

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tgggtccacc cacacataaa cccctggtcg acatttttcg gttggggcga ccttggagaa 1200

aaaaaaatcc tccaaaccca cagaccacaa ctcttcacta agaccaactc ctcaaagtac 1260

caacagtaac cagacccaat ataattgagc aatggaccaa gctaccccag ggataacagc 1320

gcaatctcct ccaagagccc atatcgacaa ggaggtttac gacctcgatg ttggatcagg 1380

acaacctaat ggtgcaaccg ctattaaggg ttcgtttgtt caacgattaa cagtcctacg 1440

tgatctgagt tcagaccgga gcaatccagg tcggtttcta tctatgaaca cactcctcct 1500

agtacgaaag gaccggagaa gtggggtcaa taccactgag cacaccccaa ccttctaagc 1560

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cca 1623

<210> 47

<211> 1603

<212> DNA

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<400> 47

agccttcctc tagctcagcc gcttaaacaa cgcaaaacta aagaatccca ctaattaaga 60

cttaaccaaa agcattttct agtcctagta taggcgatag aaaagacact tagacgcgat 120

agagaccagt accgtaaggg aaagatgaaa taatagtgaa aactaaagca agagacagca 180

aagactaacc cttgtacctt ttgcatcatg atttagcaag aacaaccaag caaagtgaac 240

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acacccagaa ccacaatgag atgattaaga gctatttaat ggaggtacag ctccattaaa 480

aaaggacaca acctcgacta gtggataaat ctaatcacca accttactgt gggccttaaa 540

gcagccatca acaaagagtg cgtcaaagct ccacactcaa aaatgccaaa acaagatgaa 600

tcccttacca caaacaggtt aacctatgaa tataggagaa ttaatgctaa aatgagtaac 660

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gaagaggact cccccccacc accccaatcc tagaaaagga tca 1603