任意泳道的western blot孵育与检测的装置

技术领域

本发明涉及蛋白检测装置，特别涉及任意泳道的western blot孵育与检测的装置。

背景技术

Western Blot技术即蛋白印迹技术是分析生物化学、分子生物学和免疫遗传学的基础的、常用的实验方法，在蛋白质检测、分析和研究领域具有重要意义。其实验原理是通过抗体与附着、固定在化学合成膜的支持物上的靶蛋白发生特异性亲和反应、免疫反应和结合反应以显色分析，从而进行蛋白质定性和定量测量。

1.1 Western Blot的重要性

Renart和George于40年前在PNAS(Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America)上首次发表了关于Western Blot技术的文章。最开始的印迹技术是Edwin Southern的DNA印迹技术，被称为“Southern Blot”，后George小组发明了名为“Northern Blot”的针对RNA的印迹技术，紧接着Burnette和Towbin在相互不知情的情况下研究并发表了相似的实验对象是蛋白质的印迹技术。由于Burnette和 Stark的实验室都位于美国西海岸，借鉴以前的命名规律，Burnette将应用于蛋白质的印迹技术命名为“Western Blot”。

Western Blot技术与其他技术相比，主要有以下几个特点：

(1)被转移的蛋白质在固相支持物上比在凝胶中更容易与抗体探针接触；

(2)被转移的蛋白质不会因为扩散而降低分辨率；

(3)可以利用被转移的蛋白质进行多种分析；

(4)实验过程需要的试剂较少，处理时间相对较短，固相支持物(化学合成膜)易操作和保存。

由此可见，Western Blot技术与其他技术相比，更宜于进行应用与研究，其发展成为一种重要的检测和诊断方法也是合乎情理的。在临床试验时，Western Blot技术是传染病和自身免疫性疾病、过敏及其他领域的一种可靠的确诊的临床检测手段，1986年该技术已经被应用于检测人脑组织中的标志蛋白，诊断Creutzfeldt-Jakob病(一种常见的由可传播朊蛋白导致的致命性中枢神经疾病)。在蛋白质研究领域，这项技术诞生40年来，不但没有过时，而且一直被实验研究人员密切关注，通过PubMed数据估算与蛋白质相关的文章中Western Blot技术的引用次数，并将其与显微镜检查等其他技术进行比较，可以看出，Western Blot技术不仅被广泛使用，甚至它的使用频率远高于其他技术 (图1)，并且近30年来一直达到8％左右的高稳定比例。无疑，Western Blot技术一直是探索性研究的理想方法，也依然是蛋白检测分析的标准，其重要性不言而喻。

1.2 Western Blot全自动分析仪与传统方法的对比

Western Blot实验主要包括以下几个步骤：

(1)SDS-PAGE电泳：凝胶电泳分离蛋白质；

(2)转印封闭：将蛋白质从胶上转移到固相支持物(常用聚偏二氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素薄膜)上；

(3)免疫反应：第一抗体与靶蛋白特异性结合后，第二抗体与第一抗体特异性结合作为指示物；

(4)显色反应：加入显色液，产生可见的、不溶解的显色反应；

(5)图像分析：对膜进行扫描或拍照，用图像处理系统分析目标蛋白质区带。

传统的Western Blot实验需进行制胶、电泳、转膜、封闭、一抗、洗涤、二抗、洗涤、发光等繁琐步骤，如图1所示，且完全手工操作，不仅耗时1-3天，而且结果的重复性也很难保证。

1.3 Western Blot全自动检测分析仪功能

未来的western-blot技术的发展方向主要在下面几个方面：尽可能多的检测出具有临床意义的抗体；尽可能少的检测出无临床意义的抗体；尽可能快的完成抗体检测。

一种Western Blot全自动检测分析系统对于实验而言是十分需要。但是由于在实际实验中条带位置不定，需要开发一个满足特定位置的全自动的仪器。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供全自动、可定位的任意泳道的western blot孵育与检测的装置。

技术方案：本发明提供一种任意泳道的western blot孵育与检测的装置，包括泳道位置检测模块、转移膜进样模块、微流体压合模块、条带化学发光与荧光检测模块、抗体进样模块、发光液喷洒模块、环境制冷模块。启动环境制冷模块形成冷环境，转移膜经转移膜进样模块进样，经泳道位置检测模块确定泳道位置，微流体压合模块形成微流体抗体孵育的腔室进行孵育、清洗，后发光液喷洒模块喷洒发光液，通过条带化学发光与荧光检测模块完成检测。

进一步地，包括底板，设置在其上的制冷模块、进样针、反应液容器、微流体腔室、下腔室、泳道位置检测区、光源和滤色片、检测镜头和CCD、第一微流体腔室运动模块、进样针运动模块、检测膜运动模块、下腔室运动模块、第二微流体腔室运动模块；

下腔室运动模块将其上的转印膜运动到泳道位置检测区，首先通过模式识别确定转印膜上的泳道位置，然后检测膜运动模块将转印膜运动到左右两个微流体压合模块区，第一微流体腔室运动模块和第二微流体腔室运动模块配合将微流体腔室压合在下腔室上形成微流体抗体孵育的腔室，进样针运动模块将进样针在不同反应液容器之间运动，完成不同抗体在微流体腔室的运动，完成一抗、二抗的孵育以及清洗，结束后，第一微流体腔室运动模块和第二微流体腔室运动模块配合将微流体腔室与下腔室分开，下腔室运动模块将孵育或清洗的膜运动到泳道位置检测区，化学发光液喷在转印膜上，打开检测镜头和CCD，通过光源和滤色片完成对膜的检测。

进一步地，所述泳道位置检测模块的工作过程为：放置转印膜的下腔室在工作台的电机带动下，运动到泳道位置检测区，打开光源和滤色片，通过检测镜头和CCD将带标记膜的图像记录下来，通过图像分析软件将标记的位置通过虚拟相对坐标记录下来。

进一步地，增加激发和发射滤色片组，可以实现对于孵育条带的荧光检测。

进一步地，微流体进样采用蠕动泵控制流体在微流体腔室的运动，流体可以在微腔室中循环运动或者往复运动。

进一步地，所述下腔室安装有表面声波震动器件，提高微腔室中试剂与抗体的反应动力学常数，提高反应效率。

本发明任意泳道的western blot孵育与检测的装置的总体设计

本发明还可以划分为试剂储藏室、蠕动泵区、自动实验室和自动曝光室四个部分，四个部分相对独立但又相互协作，共同完成洗涤、发光、采集和分析功能。

仪器的硬件部分主要实现自动载台、加样、清洗、检测等功能，通过蠕动泵将抗体自动加样到通道中，然后进行一抗孵育；一抗孵育完成后，将清洗溶液通过蠕动泵分加样到通道中，多次清洗后将二抗加样到通道中，然后进行二抗孵育；二抗孵育完成后，将清洗溶液通过蠕动泵分别加样到通道中，多次清洗后将ECL液加样到通道中，然后自动将载台移动到检测位置，进行图像拍照。实验流程如图3所示。

软件部分主要分为两个：(1)仪器软件主要实现自动化Western Blot实验流程，通过软件设置Western Blot实验流程、实验参数、仪器环境、拍照参数等；(2)图像软件主要实现图像采集和分析的功能。

有益效果：本发明设计了自动化的蛋白检测装置，主要包括包括泳道位置检测模块、转移膜进样模块、微流体压合模块、条带化学发光与荧光检测模块、抗体进样模块、发光液喷洒模块、环境制冷模块。该设备有抗体孵育与洗涤、显色反应、蛋白印迹图像的采集与分析等功能，能在无人操作的情况下，用很少量的抗体就可以高通量，全自动，快速实现传统的一抗孵育，一抗洗涤，二抗孵育，二抗洗涤和抗体显色曝光等转膜后的步骤，并最终将实验参数和检测结果存储在对应的文件夹，以保证实验的准确性和可重复性。

附图说明

图1为现有技术的实验步骤流程图；

图2为本发明装置结构示意图；

图3为本发明装置实验流程图；

图4为一抗孵育条件的优化结果；

图5为洗涤时间的影响结果。

具体实施方式

本实施例的任意泳道的western blot孵育与检测的装置，包括泳道位置检测模块、转移膜进样模块、微流体压合模块、条带化学发光与荧光检测模块、抗体进样模块、发光液喷洒模块、环境制冷模块。，启动环境制冷模块形成冷环境，转移膜经转移膜进样模块进样，经泳道位置检测模块确定泳道位置，微流体压合模块形成微流体抗体孵育的腔室进行孵育、清洗，后发光液喷洒模块喷洒发光液，通过条带化学发光与荧光检测模块完成检测

具体地，包括底板1，设置在其上的制冷模块2、进样针3、反应液容器4、微流体腔室5、下腔室6、泳道位置检测区7、光源和滤色片8、检测镜头和CCD9、第一微流体腔室运动模块10、进样针运动模块11、检测膜运动模块12、下腔室运动模块13、第二微流体腔室运动模块14；下腔室运动模块13将其上的转印膜运动到泳道位置检测区 7，首先通过模式识别确定转印膜上的泳道位置，然后检测膜运动模块12将转印膜运动到左右两个微流体压合模块区，第一微流体腔室运动模块10和第二微流体腔室运动模块14配合将微流体腔室5压合在下腔室6上形成微流体抗体孵育的腔室，进样针运动模块11将进样针3在不同反应液容器4之间运动，完成不同抗体在微流体腔室5的运动，完成一抗、二抗的孵育以及清洗，结束后，第一微流体腔室运动模块10和第二微流体腔室运动模块14配合将微流体腔室5与下腔室6分开，下腔室运动模块13将孵育或清洗的膜运动到泳道位置检测区7，化学发光液喷在转印膜上，打开检测镜头和CCD 9，通过光源和滤色片8完成对膜的检测。

泳道位置检测模块的工作过程为：放置转印膜的下腔室6在工作台的电机带动下，运动到泳道位置检测区7，打开光源和滤色片8，通过检测镜头和CCD9将带标记膜的图像记录下来，通过图像分析软件将标记的位置通过虚拟相对坐标记录下来。增加激发和发射滤色片组，可以实现对于孵育条带的荧光检测。微流体进样采用蠕动泵控制流体在微流体腔室5的运动，流体可以在微腔室中循环运动或者往复运动。下腔室6安装有表面声波震动器件，提高微腔室中试剂与抗体的反应动力学常数，提高反应效率。

本发明任意泳道的western blot孵育与检测的装置的实验及结果：

开发了全自动western-blot的设备，但是实验参数对实验结果有很大的影响。因此按照图4进行了实验参数的初步和优化实验，主要研究一抗孵育条件、洗涤液流速、往复洗涤时间、往复洗涤次数等对实验结果的影响。采用天能的化学发光检测设备对条带进行检测。由于检测的结果采用灰度分析容易饱和，本发明采用条带的平均灰度和偏差来计算条带的信号强度，相关实验条件和分析结果见表。

表一

条带的实验条件如表一。从图4实验结果可以看出：在室温下，随着一抗孵育时间增加，信号增强(从表一的分析结果，15分钟均值1.491，30分钟均值7.622，60分钟均值9.07，)。但是孵育时间超过60min之后变化不大(120分钟均值10.258)，一般选择室温一小时孵育一抗。

表二

条带的实验条件如表二。从图5实验结果可以看出：内参抗体，洗涤时间对信号影响不大，样品信号强背景颜色浅，样品信号弱，背景颜色较深。更换内参抗体和不同稀释比例、曝光时间，得到类似的结果。