利用特异性SNPs和/或INDELs位点鉴定白耳黄鸡的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域及家禽遗传资源领域，具体涉及利用特异性SNPs和/或INDELs位点鉴定白耳黄鸡的方法。

背景技术

白耳黄鸡，属蛋用型早熟地方品种，也称白银耳鸡、上饶地区白耳鸡、江山白耳鸡，因耳叶白色而得名。该鸡是中国国家地理标志产品，2006年被列为国家级畜禽遗传资源保护名录。然而，在养殖推广白耳黄鸡的过程中，由于技术门槛和养殖成本较低，一些养殖户将白耳黄鸡与外来鸡种随意交配，以杂交后代冒充白耳黄鸡在市场销售，严重影响白耳黄鸡品牌。

目前针对白耳黄鸡的研究还不多见，尤其是对白耳黄鸡品种的鉴定，尚处于研究空白。

发明内容

本发明主要目的是提供一种利用特异性SNPs和/或INDELs位点鉴定白耳黄鸡的方法，为白耳黄鸡品种的鉴定和保护提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一提供一种白耳黄鸡的鉴定方法，利用特异性SNPs和/或INDELs位点进行鉴定；所述特异性SNPs位点包括以下任意一个或几个：

BE_tag2位于鸡1号染色体190447715处，基因CCDC90B第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag4位于鸡3号染色体31115624处，基因ABCC10第2内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag5位于鸡5号染色体58105433处，基因NIN第29外显子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag6位于鸡6号染色体24835856处，基因SH3PXD2A第3内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag7位于鸡7号染色体31856227处，基因LRP1B第1内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag9位于鸡12号染色体1737573处，基因PRKCD的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag10位于鸡14号染色体6552214处，基因TBL3第21内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag11位于鸡18号染色体2826699处，基因HS3ST3B1与基因METRNL之间，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag12位于鸡19号染色体6892943处，基因LOC101749175第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag13位于鸡23号染色体5353166处，基因LOC112530206的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag14位于鸡24号染色体5226317处，基因SIDT2的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag15位于鸡Z染色体70634838处，基因CORO2A与基因LOC101748661之间，白耳黄鸡基因型为AA。

进一步地，所述特异性INDELs位点包括以下任意一个或几个：

BE_tag1位于鸡1号染色体66034245处，基因SOX5第9内含子，白耳黄鸡基因型为TT/TT，突变基因型为缺失TT；

BE_tag3位于鸡2号染色体16154066处，基因APBB1IP第1内含子，白耳黄鸡基因型为插入TCAGG//TCAGG，插入片段TCAGG；

BE_tag8位于鸡10号染色体4305866处，基因TBC1D2B第11内含子，白耳黄鸡基因型为--(缺失片段DNA片段为TGTT)。

进一步地，所述SNPs特异性位点的检测引物：

用于检测所述标记BE_tag2的引物为BE_P2f和BE_P2r所示两条单链DNA：

BE_P2f：TCAAGATGAAGTCTGATGCT；

BE_P2r：TGATTCTGTGCTGAAGGTT；

用于检测所述标记BE_tag4的引物为BE_P4f和BE_P4r所示两条单链DNA：

BE_P4f：CTGTATCCTTGTCTCTTGTCT；

BE_P4r：CATTCCGCCTCTTGTTCA；

用于检测所述标记BE_tag5的引物为BE_P5f和BE_P5r所示两条单链DNA：

BE_P5f：GTGAGGTGGTTCGTTAGG；

BE_P5r：AATACAGGCTGAAGTGGTAA；

用于检测所述标记BE_tag6的引物为BE_P6f和BE_P6r所示两条单链DNA：

BE_P6f：CCTGGTGGTAGAGATGGTA；

BE_P6r：CTTCCTGAGTAGTCAACAATC；

用于检测所述标记BE_tag7的引物为BE_P7f和BE_P7r所示两条单链DNA：

BE_P7f：AGGCATTACTGTAGTTGTCT；

BE_P7r：TGTGAAGGTGTATGGAATTG；

用于检测所述标记BE_tag9的引物为BE_P9f和BE_P9r所示两条单链DNA：

BE_P9f：TGTGGCTCTGTCTCTGAA；

BE_P9r：CTTGCTGTCCGAGTTCTC；

用于检测所述标记BE_tag10的引物为BE_P10f和BE_P10r所示两条单链DNA：

BE_P10f：GCTTGGAAGAGAACATTGC；

BE_P10r：CATTCACAACATAAGAGGAGAC；

用于检测所述标记BE_tag11的引物为BE_P11f和BE_P11r所示两条单链DNA：

BE_P11f：GTAATGCTCAGACCAACAG；

BE_P11r：GACCTCCTTCATCTTAATGC；

用于检测所述标记BE_tag12的引物为BE_P12f和BE_P12r所示两条单链DNA：

BE_P12f：CAAGAGTGAAGGTGGTGAA；

BE_P12r：TGATACAACAGGACATTGGT；

用于检测所述标记BE_tag13的引物为BE_P13f和BE_P13r所示两条单链DNA：

BE_P13f：GCTGCTGATGATGCTGAG；

BE_P13r：TCCAGGTCACAGTAAGTCTAT；

用于检测所述标记BE_tag14的引物为BE_P14f和BE_P14r所示两条单链DNA：

BE_P14f：GGAAGGCACATCACTACAA；

BE_P14r：CTGGAGATAAGGAAGAAGGTT；

用于检测所述标记BE_tag15的引物为BE_P15f和BE_P15r所示两条单链DNA：

BE_P15f：TTATGCGTTATCTGCCTTCA；

BE_P15r：GCTTACTGTATTCACCTTCTTG。

进一步地，INDELs特异性位点的检测引物：

用于检测所述标记BE_tag1的引物为BE_P1f和BE_P1r所示两条单链DNA：

BE_P1f：TGAGAGTGATAGAGGAAGTTG；

BE_P1r：CTACGAGACCATACAGACAG；

用于检测所述标记BE_tag3的引物为BE_P3f和BE_P3r所示两条单链DNA：

BE_P3f：GATGTATGCCCTCCCAAAT；

BE_P3r：CTATCCGCTCTTCTCTTCTT；

用于检测所述标记BE_tag8的引物为BE_P8f和BE_P8r所示两条单链DNA：

BE_P8f：TCGCTTAATCTGTGTAGTGT；

BE_P8r：CTCTTCCTCATCATCCTCTG。

本发明目的之二提供一种引物组合，所述引物组合包括BE_P2f和BE_P2r，BE_P4f和BE_P4r，BE_P5f和BE_P5r，BE_P6f和BE_P6r，BE_P7f和BE_P7r，BE_P9f和BE_P9r，BE_P10f和BE_P10r，BE_P11f和BE_P11r，BE_P12f和BE_P12r，BE_P13f和BE_P13r，BE_P14f和BE_P14r，BE_P15f和BE_P15r引物对的任意两对或几对的组合；和/或包括：

BE_P1f和BE_P1r，BE_P3f和BE_P3r，BE_P8f和BE_P8r引物对的任意一对或几对的组合；

以上所述引物的碱基序列分别如SEQ NO.1-30所示。

本发明目的之三提供以上所述引物组合在白耳黄鸡品种鉴定中的应用。

本发明目的之四提供包括以上所述引物组合的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液，DNA聚合酶和dNTPs。

进一步地，所述检测试剂盒还包括基因组DNA提取试剂。

本发明目的之五提供以上所述试剂盒在鉴定白耳黄鸡品种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了关于白耳黄鸡品种的特异性遗传位点，所述特异性遗传位点包括SNPs位点和INDELs位点；本发明提供的特异性遗传位点分布在不同染色体上，特异性高，每个位点白耳黄鸡的鉴定率均在90％以上，因此，以本发明提供的特异性遗传位点组合进行白耳黄鸡的鉴定，准确性更高。

本发明将筛选得到的白耳黄鸡品种的特异性遗传位点及检测所述遗传特异性位点的检测引物应用于制备芯片或检测试剂盒，并将芯片或检测试剂盒应用在白耳黄鸡品种的鉴定中，具有很佳的检测效果，便于推广应用，具有重要的科研价值和商业价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为基于邻接法构建的地方鸡种系统进化树。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1白耳黄鸡特异性遗传位点

以最小等位基因频率-连锁不平衡方法分析249个地方鸡简化基因组序列，筛选得到15个白耳黄鸡品种特异性SNPs/INDELs标记。所述鸡种包括溧阳鸡(20只)、济宁百日鸡(30只)、白耳黄鸡(30只)、仙居鸡(30只)、来航鸡(30只)、如皋黄鸡(20只)、鹿苑鸡(20只)、狼山鸡(20只)、寿光鸡(20只)、徐海鸡(30只)；15个SNPs/INDELs位点的物理位置是基于鸡全基因组参考序列比对确定的，所述鸡全基因组标准序列的版本号为(Gallus gallusGRCg6)。白耳黄鸡品种特异性SNPs/INDELs标记具体如下：

BE_tag1位于鸡1号染色体66034245处，基因SOX5第9内含子，白耳黄鸡基因型为TT/TT,突变基因型为缺失TT；

BE_tag2位于鸡1号染色体190447715处，基因CCDC90B第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag3位于鸡2号染色体16154066处，基因APBB1IP第1内含子，白耳黄鸡基因型为TCAGG//TCAGG，插入DNA片段TCAGG；

BE_tag4位于鸡3号染色体31115624处，基因ABCC10第2内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag5位于鸡5号染色体58105433处，基因NIN第29外显子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag6位于鸡6号染色体24835856处，基因SH3PXD2A第3内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag7位于鸡7号染色体31856227处，基因LRP1B第1内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag8位于鸡10号染色体4305866处，基因TBC1D2B第11内含子，白耳黄鸡基因型为--缺失DNA片段为TGTT；

BE_tag9位于鸡12号染色体1737573处，基因PRKCD的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag10位于鸡14号染色体6552214处，基因TBL3第21内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag11位于鸡18号染色体2826699处，基因HS3ST3B1与基因METRNL之间，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag12位于鸡19号染色体6892943处，基因LOC101749175第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag13位于鸡23号染色体5353166处，基因LOC112530206的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag14位于鸡24号染色体5226317处，基因SIDT2的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag15位于鸡Z染色体70634838处，基因CORO2A与基因LOC101748661之间，

白耳黄鸡基因型为AA；

其中，BE_tag1、BE_tag3、BE_tag8为INDELs位点，其它均为SNPs位点。以上所述遗传位点特性强，可用于白耳黄鸡品种的鉴定中。

另外还可以将上述白耳黄鸡的特异性遗传位点用于制备成芯片，用于白耳黄鸡品种的鉴定。

所述SNPs特异性位点的检测引物：

用于检测所述标记BE_tag2的引物为BE_P2f和BE_P2r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag4的引物为BE_P4f和BE_P4r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag5的引物为BE_P5f和BE_P5r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag6的引物为BE_P6f和BE_P6r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag7的引物为BE_P7f和BE_P7r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag9的引物为BE_P9f和BE_P9r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag10的引物为BE_P10f和BE_P10r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag11的引物为BE_P11f和BE_P11r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag12的引物为BE_P12f和BE_P12r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag13的引物为BE_P13f和BE_P13r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag14的引物为BE_P14f和BE_P14r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag15的引物为BE_P15f和BE_P15r所示两条单链DNA；

INDELs特异性位点的检测引物：

用于检测所述标记BE_tag1的引物为BE_P1f和BE_P1r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag3的引物为BE_P3f和BE_P3r所示两条单链DNA；

用于检测所述标记BE_tag8的引物为BE_P8f和BE_P8r所示两条单链DNA；

以上所述引物序列、扩增片段长度以及退火温度，具体如下表1所示。

表1检测白耳黄鸡品种特异性标记所用扩增引物

应用实施例1所述特异性遗传位点及相应引物，对30份白耳黄鸡血样和350份非白耳黄鸡血样进行鉴定。具体操作步骤如下：

以CTAB法提取380份血液样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测、琼脂糖电泳检测合格后进行PCR扩增。

PCR扩增过程：

1)反应体系:10μl体系包括鉴定材料DNA模板50ng，正、反向引物各l0ng,5μL 2×power Taq MasterMix，剩余体积用超纯水补足；

2)反应程序:首先94℃变性30s,退火30s,72℃延伸30s，共5个循环；接着94℃变性30s,50.9-57.0℃退火30s,72摄氏度延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min,4℃保存。

扩增产物送至测序公司进行DNA序列多态性检测。对于INDELs标记，也可选择毛细管电泳检测片段扩增长度，作为基因分型依据。各特异性位点鉴定率如下表2所示。

表2.白耳黄鸡品种特异性标记鉴定率

由表2可知，以上每个位点白耳黄鸡的鉴定率均在90％以上，因此，本发明提供的特异性遗传位点及引物可以用于白耳黄鸡的鉴定，且准确性高。

以上所述引物的组合也可用于白耳黄鸡的鉴定，或用于制备鉴定白耳黄鸡的试剂盒。

其中Gene4_2、Gene5_2、Gene11_1、Gene22_1、GeneZ_2为根据实际鉴定结果淘汰的五个特异性位点。所述五个特异性位点具体为：

Gene4_2位于鸡4号染色体69036406处，基因N4BP2第1内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

Gene5_2位于5号染色体37248844处，MIPOL1基因第8内含子，白耳黄鸡基因型为AA；

Gene11_1位于鸡11号染色体，物理位置6583300处，基因ADCY7以及lncRNAUTR5区域，白耳黄鸡基因型为GG；

Gene22_1位于鸡22号染色体3670686处，基因TMEM127的UTR3，白耳黄鸡基因型为CC；

GeneZ_2位于鸡Z染色体66449744处，基因UGCG与基因SUSD1之间，白耳黄鸡基因型为CC。

实施例2鉴定白耳黄鸡的方法

所述方法包括：鉴定以下SNPs位点：

BE_tag2位于鸡1号染色体190447715处，基因CCDC90B第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag4位于鸡3号染色体31115624处，基因ABCC10第2内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag5位于鸡5号染色体58105433处，基因NIN第29外显子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag6位于鸡6号染色体24835856处，基因SH3PXD2A第3内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag7位于鸡7号染色体31856227处，基因LRP1B第1内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag9位于鸡12号染色体1737573处，基因PRKCD的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag10位于鸡14号染色体6552214处，基因TBL3第21内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag11位于鸡18号染色体2826699处，基因HS3ST3B1与基因METRNL之间，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag12位于鸡19号染色体6892943处，基因LOC101749175第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag13位于鸡23号染色体5353166处，基因LOC112530206的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag14位于鸡24号染色体5226317处，基因SIDT2的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag15位于鸡Z染色体70634838处，基因CORO2A与基因LOC101748661之间，白耳黄鸡基因型为AA。

若待测鸡具有以上所述SNPs位点，且基因型相同，则该待测鸡为白耳黄鸡。

实施例3鉴定白耳黄鸡的方法

所述方法包括，鉴定以上特异性位点：

BE_tag2位于鸡1号染色体190447715处，基因CCDC90B第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag4位于鸡3号染色体31115624处，基因ABCC10第2内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag5位于鸡5号染色体58105433处，基因NIN第29外显子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag6位于鸡6号染色体24835856处，基因SH3PXD2A第3内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag7位于鸡7号染色体31856227处，基因LRP1B第1内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag9位于鸡12号染色体1737573处，基因PRKCD的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag10位于鸡14号染色体6552214处，基因TBL3第21内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag11位于鸡18号染色体2826699处，基因HS3ST3B1与基因METRNL之间，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag12位于鸡19号染色体6892943处，基因LOC101749175第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag13位于鸡23号染色体5353166处，基因LOC112530206的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag14位于鸡24号染色体5226317处，基因SIDT2的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag15位于鸡Z染色体70634838处，基因CORO2A与基因LOC101748661之间，白耳黄鸡基因型为AA。

BE_tag1位于鸡1号染色体66034245处，基因SOX5第9内含子，白耳黄鸡基因型为TT/TT，突变基因型为缺失TT；

BE_tag3位于鸡2号染色体16154066处，基因APBB1IP第1内含子，白耳黄鸡基因型为插入TCAGG//TCAGG，插入DNA片段为TCAGG；

BE_tag8位于鸡10号染色体4305866处，基因TBC1D2B第11内含子，白耳黄鸡基因型为--缺失DNA片段为TGTT。

若待测鸡具有以上所述特异性位点，且基因型相同，则该待测鸡为白耳黄鸡。

实施例4鉴定白耳黄鸡的方法

所述方法包括，鉴定以上特异性位点：

BE_tag2位于鸡1号染色体190447715处，基因CCDC90B第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag4位于鸡3号染色体31115624处，基因ABCC10第2内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag6位于鸡6号染色体24835856处，基因SH3PXD2A第3内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag9位于鸡12号染色体1737573处，基因PRKCD的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag10位于鸡14号染色体6552214处，基因TBL3第21内含子，白耳黄鸡基因型为GG；

BE_tag11位于鸡18号染色体2826699处，基因HS3ST3B1与基因METRNL之间，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag12位于鸡19号染色体6892943处，基因LOC101749175第2内含子，白耳黄鸡基因型为TT；

BE_tag13位于鸡23号染色体5353166处，基因LOC112530206的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag14位于鸡24号染色体5226317处，基因SIDT2的UTR5区域，白耳黄鸡基因型为CC；

BE_tag15位于鸡Z染色体70634838处，基因CORO2A与基因LOC101748661之间，白耳黄鸡基因型为AA。

BE_tag1位于鸡1号染色体66034245处，基因SOX5第9内含子，白耳黄鸡基因型为TT/TT，突变基因型为缺失TT；

BE_tag8位于鸡10号染色体4305866处，基因TBC1D2B第11内含子，白耳黄鸡基因型为--(缺失DNA片段为TGTT)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。