一种那他霉素纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂新剂型技术领域，尤其涉及一种那他霉素纳米粒及其制备方法。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)报道，角膜疾病是导致视力丧失的主要原因，仅次于白内障。真菌性角膜炎通常是由镰刀菌、曲霉菌、弯曲菌和白色念珠菌感染所致，会导致视力损害，严重者甚至会导致失明，治疗比其他角膜感染更加困难，需要立即进行医疗干预。真菌性角膜炎发病的主要原因是由于过度使用广谱抗生素和类固醇引起的眼外伤使角膜表面微生物平衡失调，导致病原体侵入眼部组织。在农田环境中，特别是在温带和热带气候中，土壤和植物残留物(通常富含镰刀菌)容易造成的眼部损伤进而导致真菌感染。

治疗真菌性角膜炎的金标准尚未被确定，主要的治疗方法是使用抗真菌药物，如那他霉素和局部两性霉素B。对长期难以治愈的真菌性角膜炎通常进行手术治疗，而手术治疗由于对设备和材料的要求较高、并发症等多种原因，在基层医院未能广泛开展。

那他霉素是一种多烯大环内酯类药物，由于其毒性低，对真菌作用效果好，被认为是治疗真菌性角膜炎首选药物，是唯一一种被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于丝状真菌性角膜炎的抗真菌药物。它的作用机制是通过与真菌细胞壁的麦角甾醇结合，阻遏麦角甾醇生物合成，从而使细胞膜畸变，最终导致渗漏，引起细胞死亡，阻止真菌的生长。

那他霉素的难溶性阻碍了其发挥更好的作用，目前那他霉素的商品化剂型只有混悬液，配方和剂量方案是5％(w/v)混悬液，这种混悬液在眼部的停留时间短，需每隔1～2h灌注于结膜囊，这种疗法至少要维持4～6周才能完全缓解，由于给药频率高，治疗周期长，患者顺应性降低，不按医嘱给药会进而导致疾病长期难以治愈并且病情会愈加严重，需要手术治疗甚至导致视力丧失。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种那他霉素纳米粒及其制备方法。本发明提供的那他霉素纳米粒在溶剂中的分散性好，具有缓释作用，能够降低给药频率，增加那他霉素的溶解度，提高那他霉素的生物利用度，加强对致病真菌的杀伤作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种那他霉素纳米粒，包括核层和包覆在核层表面的壳层，所述壳层为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，所述核层为壳聚糖-那他霉素混合物。

优选的，所述那他霉素纳米粒中那他霉素的质量分数为5.02～6.65％，壳聚糖的质量分数为16.97～31.66％，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量分数为56.4～67.89％。

优选的，所述壳聚糖的分子量为12～120万。

优选的，所述那他霉素纳米粒的粒径为50～100nm。

本发明还提供了上述方案所述那他霉素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于溶剂中，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；

将壳聚糖和那他霉素溶解于乙酸溶液中，得到壳聚糖-那他霉素混合溶液；

将所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液进行静电喷雾，得到纳米粒粗产物；

将所述纳米粒粗产物透析后冷冻干燥，得到那他霉素纳米粒。

优选的，所述溶剂为丙酮、乙酸乙酯或氯化类溶剂；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度为10～25mg/mL。

优选的，所述乙酸溶液中乙酸的质量分数为0.5～1％；所述壳聚糖-那他霉素混合溶液中壳聚糖的浓度为1～10mg/mL，那他霉素的浓度为1～10mg/mL。

优选的，所述静电喷雾的过程具体为：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液分别置于静电喷雾装置的A泵和B泵中，将A泵和B泵与共轴针头连接，并使共轴针头垂直于接收皿，然后设置静电喷雾参数开始进行静电喷雾，在接收皿接收到纳米粒粗产物；所述静电喷雾参数包括：电压为7～20kV，聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的推注速度为0.1～0.5mm/min，壳聚糖-那他霉素混合溶液的推注速度为0.1～0.25mm/min，接收距离为6～12cm。

优选的，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖和那他霉素的总投料量为100wt％计，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的投料量为40～60wt％，壳聚糖的投料量为25～43wt％，那他霉素的投料量为7.8～20wt％。

本发明提供了一种那他霉素纳米粒，包括核层和包覆在核层表面的壳层，所述壳层为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，所述核层为壳聚糖-那他霉素混合物。本发明采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物作为载药材料制备那他霉素纳米粒，聚乳酸-羟基乙酸共聚物是一种可降解聚合物，水解后可得到无毒的副产物(乳酸和乙醇酸单体)，对人体安全，且所得那他霉素纳米粒具有缓释功能；另外，聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合物作为壳层，可以降低壳聚糖的团聚性，使制得的纳米粒分散性更好，在溶剂中能够稳定存在，不产生絮凝或者沉淀；纳米粒的缓释作用，能够减少用药频率，提高患者的依从性及治疗效率，降低患者视力丧失的风险；本发明提供的那他霉素纳米粒分散性好，复溶后能均匀分散于分散介质中，不会发生沉淀和团聚，从而有利于细胞摄取进而使那他霉素发挥更好的作用，本发明提供的那他霉素纳米粒稳定性好，能够持续释放，载体材料安全无毒，不良反应小。

本发明还提供了上述方案所述那他霉素纳米粒的制备方法，本发明采用静电喷雾法制备那他霉素纳米粒，所得纳米粒粒径均匀，且制备步骤简单，重现性好，精确度高，适合大规模生产，有利于降低药物的制备成本。

附图说明

图1为实施例1制备的那他霉素纳米粒的透射电子显微镜图；

图2为实施例1制备的那他霉素纳米粒和游离那他霉素的体外释放曲线；

图3为实施例1制备的那他霉素纳米粒血液相容性的测试结果；

图4为实施例1制备的那他霉素纳米粒对白色念珠菌的抗菌活性测试结果。

具体实施方式

本发明提供了一种那他霉素纳米粒，包括核层和包覆在核层表面的壳层，所述壳层为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，所述核层为壳聚糖-那他霉素混合物。

在本发明中，所述那他霉素纳米粒中那他霉素(NAT)的质量分数优选为5.02～6.65％，更优选为5.5～6.3％，壳聚糖(CTS)的质量分数优选为16.97～31.66％，更优选为18.8～31.66％，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)的质量分数优选为56.4～67.89％，更优选为56.4～63.32％。

在本发明中，所述壳聚糖的数均分子量优选为12～120万，更优选为12～40万；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量优选为4～7万，更优选为5万。

在本发明中，所述那他霉素纳米粒的粒径优选为50～100nm。

本发明还提供了上述方案所述那他霉素纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于溶剂中，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；

将壳聚糖和那他霉素溶解于乙酸溶液中，得到壳聚糖-那他霉素混合溶液；

将所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液进行静电喷雾，得到纳米粒粗产物；

将所述纳米粒粗产物透析后冷冻干燥，得到那他霉素纳米粒。

本发明将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于溶剂中，得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液。在本发明中，所述溶剂优选为丙酮、乙酸乙酯或氯化类溶剂，所述氯化类溶剂优选为二氯甲烷和/或三氯甲烷；所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的浓度优选为10～25mg/mL，更优选为15～20mg/mL。

本发明将壳聚糖和那他霉素溶解于乙酸溶液中，得到壳聚糖-那他霉素混合溶液。在本发明中，所述乙酸溶液中乙酸的质量分数优选为0.5～1％；所述壳聚糖-那他霉素混合溶液中壳聚糖的浓度优选为1～10mg/mL，更优选为3～5mg/mL，那他霉素的浓度优选为1～10mg/mL，更优选为2～5mg/mL；本发明优选将壳聚糖和那他霉素溶加入乙酸溶液中，然后在室温下磁力搅拌4h，得到壳聚糖-那他霉素混合溶液。在本发明中，乙酸能够促进壳聚糖和那他霉素的溶解。

在本发明中，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖和那他霉素的总投料量为100wt％计，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的投料量优选为40～60wt％，更优选为45～55wt％，壳聚糖的投料量优选为25～43wt％，更优选为26～40wt％，那他霉素的投料量优选为7.8～20wt％，更优选为8～15wt％；本发明将聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖和那他霉素的投料量控制在上述范围内，能够保证最终所得那他霉素纳米粒产品中聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖和那他霉素的质量分数符合前述要求。

得到聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液后，本发明将所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液进行静电喷雾，得到纳米粒粗产物。在本发明中，所述静电喷雾的过程具体优选为：将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液分别置于静电喷雾装置的A泵和B泵中，将A泵和B泵与共轴针头连接，并使共轴针头垂直于接收皿，然后设置静电喷雾参数开始进行静电喷雾，在接收皿接收到纳米粒粗产物；所述静电喷雾参数优选包括：电压为7～20kV，更优选为8～15kV，聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液的推注速度优选为0.1～0.5mm/min，更优选为0.3～0.5mm/min，壳聚糖-那他霉素混合溶液的推注速度优选为0.1～0.25mm/min，更优选为0.15～0.25mm/min，接收距离优选为6～12cm，更优选为8～12cm，所述接收距离具体是指共轴针头的针头端到接收皿的垂直距离。在静电喷雾过程中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液在高电压作用下从同轴电喷雾喷头中喷出，聚乳酸-羟基乙酸共聚物包裹在壳聚糖-那他霉素混合物表面，在静电场的作用下，形成纳米粒粗产物。

得到纳米粒粗产物后，本发明将所述纳米粒粗产物透析后冷冻干燥，得到那他霉素纳米粒。在本发明中，所述透析用透析袋的分子量优选为3500；所述透析的时间优选为3d；所述透析用蒸馏水的体积优选为纳米粒粗产物体积的100倍，在透析过程中，优选每2h更换一次蒸馏水。

在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-40℃，时间优选为24h。

本发明制备得到的那他霉素纳米粒为冻干粉形式，在使用时，优选用生理盐水复溶，得到那他霉素纳米粒分散液，然后滴于眼部。本发明提供的那他霉素纳米粒适用于治疗眼科疾病，尤其是真菌性角膜炎。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

以聚乳酸-羟基乙酸共聚物、壳聚糖和那他霉素的总投料量为100wt％计，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的投料量为40wt％，壳聚糖(分子量12～40万)的投料量为40wt％，那他霉素的投料量为20wt％。

制备步骤如下：

(1)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于丙酮中，得到浓度为10mg/mL的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液；将壳聚糖以及那他霉素溶解于1wt％的乙酸溶液中，将溶液用磁力搅拌器室温搅拌4h，得到壳聚糖-那他霉素混合溶液；

(2)将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液和壳聚糖-那他霉素混合溶液分别放置于静电喷雾装置的A泵和B泵中，并连接好共轴喷头，使针头垂直于接收皿，分别设置A泵的推注速度为0.5mm/min，B泵的推注速度为0.25mm/min，将共轴针头连接在正电极上并设置正电压为7kV，设置接收距离为8cm，然后开始运行仪器，接收皿直接接收到纳米粒粗产物；将接收到的纳米粒粗产物透析后冷冻干燥即得到那他霉素纳米粒，其中透析用的截留分子量为3500的透析袋，透析时间为3天，透析用蒸馏水的体积为纳米粒粗产物溶液体积的100倍，每隔2h替换一次蒸馏水；所述冷冻干燥的温度为-40℃，时间为24h。

所得那他霉素纳米粒中那他霉素的质量分数为5.02％，壳聚糖的质量分数为31.66％，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量分数为63.32％。

图1为所得那他霉素纳米粒的透射电子显微镜图。根据图1可以看出，所得那他霉素纳米粒的粒径均匀，具有明显的核壳结构，那他霉素纳米粒的粒径为50～100nm。

对比例1

空白纳米粒的制备：其他条件和实施例1一致，仅省略那他霉素，制备得到空白纳米粒，壳层为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，核层为壳聚糖。

体外释放实验：

体外释放实验采用截留分子量3500的透析袋。首先，将制备好的那他霉素纳米粒溶液用超高速冷冻离心机12000rpm离心10min，丢弃上清液，用蒸馏水冲洗纳米粒，清洗掉游离药物。然后将2.0mL的清洗后的样品加入透析袋中，浸泡在48.0mL的PBS(pH＝7.4)中，以37℃，100rpm的转速轻轻摇摆。在预定时间点取释放液(1mL)，每次取样后立即换用1mL新鲜释放液(pH＝7.4的PBS溶液)。采用HPLC法测定那他霉素的累积释放剂量。

以游离那他霉素作为对照，采用相同的方法进行体外释放试验。

图2为实施例1制备的纳他霉素纳米粒和游离纳他霉素的体外释放曲线。根据图2可以看出，本发明制备的纳他霉素纳米粒和游离纳他霉素相比，具有优异的缓释性。

血液相容性测试：

实验组：取新西兰大白兔新鲜血液，1500rpm，20min离心收集红细胞，PBS洗涤3次，4％(w/v)红细胞与不同浓度(浓度分别为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，溶剂为pH＝7.4的PBS溶液)的那他霉素纳米粒溶液在37℃共同孵育3h，之后在12000rpm离心20min，观察上清液的颜色；

对照组：以PBS和纯水为对照，仅将那他霉素纳米粒分散液替换为PBS或纯水，其他操作相同。

图3为那他霉素纳米粒血液相容性的测试结果；根据图3可以看出，纯水组中红细胞破裂较多，离心液整体都为红色，相比较于纯水组，纳米粒组的红细胞基本没有破裂，血液相容性与PBS组相接近。该结果说明，本发明提供的那他霉素纳米粒有很好的血液相容性，在接触血液的应用中具有更广的安全范围。

抗菌活性测试：

将实施例1制备的那他霉素纳米粒和对比例1制备的空白纳米粒分别分散在pH＝7.4的PBS溶液中，制备得到浓度为1mg/mL的那他霉素纳米粒分散液和等载体浓度的空白纳米粒分散液。

将白色念珠菌与已灭菌的液体沙氏培养基在37℃下共培养24h后用新鲜培养基稀释至10

图4为那他霉素纳米粒对白色念珠菌的抗菌活性测试结果，其中NAT@CTS/PLGANPs表示那他霉素纳米粒，CTS/PLGA NPs表示空白纳米粒。根据图4可以看出，那他霉素纳米粒组相比于PBS以及空白纳米粒组有明显的抑菌圈，可认为该纳米粒具有良好的抑制真菌生长的活性。

实施例2

其他条件和实施例1一致，仅将聚乳酸-羟基乙酸共聚物的投料量改为50wt％，壳聚糖(分子量12～40万)的投料量为35wt％，那他霉素的投料量为15wt％；接收距离改为10cm；所得那他霉素纳米粒中那他霉素的质量分数为5.88％，壳聚糖的质量分数为55.36％，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量分数为38.76％；所得那他霉素纳米粒的粒径为100nm。

对实施例2所得那他霉素纳米粒进行体外释放试验，并对纳米粒的血液相容性和抗菌活性进行测试，所得结果和实施例1相似。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。