一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒

技术领域

本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒。

背景技术

脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)属于磷脂酶家族中的一种，由441个氨基酸组成，是丝氨酸依赖的磷脂酶，它由成熟的巨噬细胞、淋巴细胞、泡沫细胞及肥大细胞等炎性细胞在粥样斑块及肝脏中产生，并受炎性介质调节。其中70％与低密度脂蛋白(LDL)结合，能水解低密度脂蛋白上的氧化卵磷脂，生成促炎性物质—溶血卵磷脂(LPC)、氧化游离脂肪酸(ox-NEFA)，具有很强的促炎症和促动脉粥样硬化的作用，因此检测血中Lp-PLA2水平可以用来识别冠心病的高危个体。与超敏C反应蛋白(hsCRP)相比，Lp-PLA2的优点是与其他危险因素的相关性很小，Lp-PLA2与hsCRP相结合，可以提高对冠心病危险的预测水平。Lp-PLA2不仅仅是一个危险标志物，还可能为心血管病的治疗提供一个新靶点，降低血浆中和(或)血管壁的酶活性，它将代表一个新的极有发展前途的抗动脉粥样硬化的方法。测定人体中脂蛋白相关磷脂酶A2可用以辅助诊断心血管疾病。

目前为止，检测脂蛋白相关磷脂酶A2的方法包括：连续监测法、酶联免疫吸附测定法、胶体金层析法、磁微粒化学发光法以及胶乳增强免疫比浊法。但酶联免疫吸附测定法较为繁琐；胶体金层析法灵敏度较低且不能定量测定；磁微粒化学发光法仪器设备检测费用较高，而胶乳增强免疫比浊法对于设备以及试剂的要求较高。相比较而言，连续监测法操作简单，仪器设备依赖小，具有较高的稳定性、重复性以及灵敏度，为多数研究者所推崇。中国专利CN109655615A以及CN106872698A等均对试剂盒中的相关试剂进行了优化，能够实现快速检测，但最终得到的试剂盒的精密度均较低。而文献：何利娜.脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)试剂盒的性能评价[C].中国医学装备协会第二十六届学术与技术交流年会论文汇编.2017.评价了Lp-PLA2试剂盒的准确度(包括方法比对、精密度、线性、灵敏度和稳定性等性能)，该文献中的试剂盒准确度、精密度、线性、灵密度稳定性性能优良，抗干扰能力强，和比对试剂相关性好，符合临床应用要求，适用于实验室常规测定。该试剂盒整体而言各方面均较优，但在稳定性方面仍有一定的缺陷。

针对脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂盒存在的稳定性差以及精密度差等问题，亟需寻找一种精密度高且稳定性强的试剂盒，进而在能够快速获得精密检测结果的同时也能保证试剂盒的稳定性。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒，该试剂盒通过对试剂的优化，进而在测定脂蛋白相关磷脂酶A2时具有较高的精密度以及稳定性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒，包括试剂1、试剂2、校准品和质控品；

所述试剂1包括：磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、乙二胺四乙酸二钠、维生素E、表面活性剂和甘草酸二钾；

所述试剂2包括：柠檬酸、1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱和L-半胱氨酸。

进一步地，所述试剂1包括：7-8mmol/L磷酸氢二钠、2-3mmol/L磷酸氢二钾、1-2.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0.5-1mmol/L维生素E、0.002-0.003mmol/L表面活性剂和0.5-0.8mmol/L甘草酸二钾；所述试剂2包括：90-110mmol/L柠檬酸、1-2.5mmol/L 1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱和0.3-0.6mmol/LL-半胱氨酸。

优选地，所述试剂1包括：7.5mmol/L磷酸氢二钠、2.5mmol/L磷酸氢二钾、2mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0.8mmol/L维生素E、0.003mmol/L表面活性剂和0.68mmol/L甘草酸二钾；所述试剂2包括：100mmol/L柠檬酸、50mmol/L 1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱和0.5mmol/LL-半胱氨酸。

进一步地，所述校准品为脂蛋白相关磷脂酶A2；所述质控品为脂蛋白相关磷脂酶A2。其中，校准品的值经量值传递获得，具有溯源性，质控品定值及靶值范围具有批特异性，定值见标签标示。进一步地，所述校准品的浓度要求为400U/L；所述质控品水平1的浓度要求为300U/L，水平2的浓度要求为600U/L。

进一步地，所述维生素E、表面活性剂和甘草酸二钾的浓度比为0.5-1:0.002-0.003:0.5-0.8。优选为0.8:0.003:0.68。

进一步地，所述表面活性剂为吐温-20、吐温-80和乙基苯基聚乙二醇中的一种或多种。

进一步地，所述试剂1和试剂2的体积比为3-5:1。优选地，所述试剂1和试剂2的体积比为4:1。

本发明所取得的技术效果是：

本发明样本中脂蛋白相关磷脂酶A2水解特异性底物1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱，促使底物中游离出对硝基苯基琥珀酰基，该物质在液相中自行降解后释放出对硝基苯，对硝基苯在特定波长下吸光度升高，通过连续监测吸光度值的上升变化来计算样本中脂蛋白相关磷脂酶A2的活性。此外，试剂1中额外加入一定量的维生素E、表面活性剂和甘草酸二钾，试剂2中额外加入一定量的L-半胱氨酸等原料，能够有效地提高试剂中各组分之间的亲和性以及抗氧化性等性能，提高产品的抗干扰能力，进而有效提高试剂盒的精密度以及稳定性。

具体实施方式

值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

实施例1

一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒，包括试剂1、试剂2、校准品和质控品；

其中，试剂1包括：7mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L磷酸氢二钾、1mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0.5mmol/L维生素E、0.002mmol/L表面活性剂和0.5mmol/L甘草酸二钾；试剂2包括：90mmol/L柠檬酸、1mmol/L 1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱和0.3mmol/LL-半胱氨酸。质控品和标准品均为脂蛋白相关磷脂酶A2，表面活性剂为吐温-20。

实施例2

一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒，包括试剂1、试剂2、校准品和质控品；

其中，试剂1包括：8mmol/L磷酸氢二钠、3mmol/L磷酸氢二钾、2.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1mmol/L维生素E、0.003mmol/L表面活性剂和0.8mmol/L甘草酸二钾；试剂2包括：110mmol/L柠檬酸、2.5mmol/L 1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱和0.6mmol/LL-半胱氨酸。质控品和标准品均为脂蛋白相关磷脂酶A2，表面活性剂为吐温-80。

实施例3

一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂盒，包括试剂1、试剂2、校准品和质控品；

其中，试剂1包括：7.5mmol/L磷酸氢二钠、2.5mmol/L磷酸氢二钾、2mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0.8mmol/L维生素E、0.003mmol/L表面活性剂和0.68mmol/L甘草酸二钾；所述试剂2包括：100mmol/L柠檬酸、50mmol/L 1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱和0.5mmol/LL-半胱氨酸。质控品和标准品均为脂蛋白相关磷脂酶A2，表面活性剂为乙基苯基聚乙二醇。

对比例1

与实施例3的区别仅在于，试剂1包括：6mmol/L磷酸氢二钠、5mmol/L磷酸氢二钾、0.8mmol/L乙二胺四乙酸二钠、1.2mmol/L维生素E、0.001mmol/L表面活性剂和1mmol/L甘草酸二钾；试剂2包括：80mmol/L柠檬酸、3mmol/L 1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱和0.2mmol/LL-半胱氨酸。

对比例2

与实施例3的区别仅在于，维生素E、表面活性剂和甘草酸二钾的浓度比为0.3:0.004:0.4(三者的总重量与实施例3中三者的总重量一致)。

对比例3

与实施例3的区别仅在于，试剂2中不加入L-半胱氨酸。

对比例4

与实施例3的区别仅在于，试剂1中不加入维生素E、表面活性剂和甘草酸二钾。

储存条件及有效期：

试剂：2-8℃避光密闭储存可稳定12个月，开启后在2-8℃避光保存可稳定30天。

校准品和质控品：2-8℃避光密闭储存可稳定12个月，复溶后-20℃密封保存可稳定7天(避免反复冻融)。

适用仪器：

适用于日立7170/7600/7180、迈瑞BS2000、迪瑞CS600、雅培C16000、东芝TBA120FR/TBA-FX8、贝克曼AU5800/AU680/AU2700/DXC800、西门子ADVIA2400、罗氏C701/C702/P800、杜邦AR全自动生化分析仪。本发明中使用日立7170进行检测。

样本要求：

1.采用新鲜血清样本，应避免使用溶血、黄疸、脂血的样本。

2.样本中血红蛋白≤5.0g/L，胆红素≤500mg/L，抗坏血酸≤10.0g/L，甘油三酯≤10.0g/L对测试结果无明显干扰，超出限度时需进行确认。

检验方法：

1.基本参数

1)反应类型：速率法

2)温度：37℃

3)主波长：405nm

4)次波长：505nm

5)样本量：3μl

6)试剂1(R1)量：240μl

7)试剂2(R2)量：60μl

8)反应方向：升反应

2.测定

样本：3μl；R2：60μl；R1：240μl

3.校准

1)建议使用配套校准品进行校准，校准品用量与样本量一致。

2)校准品为冻干品，复溶方法：小心打开瓶盖、避免内容物的损失下，准确量取1ml生理盐水复溶。盖上橡皮塞，拧紧瓶盖，放置30分钟，轻轻旋转，确保内容物完全溶解。

3)校准方法：本产品采用两点校准。

4)校准频率：试剂批号更换后；根据测定结果的需要。

4.质量控制

1)质控品为冻干品，复溶方法同校准品，质控品用量与样本量一致。

2)以控制物质(质控品)来监测操作程序。质控结果在控，被认为操作程序正确，结果准确可靠；质控结果超出允许范围时，应采取纠正措施。

5.计算

以校准品的吸光度变化值△A(A

产品性能指标：

1.外观：试剂1为无色透明液体，试剂2为无色或淡黄色透明液体；

2.试剂空白：试剂空白吸光度≤1.0，空白吸光度变化率≤0.003。

3.分析灵敏度：浓度为(800±100)U/L的样本，吸光度变化率≥0.01。

4.线性范围：在[25-1900]U/L范围内，理论浓度与实测浓度的线性相关系数(r)≥0.9900。在[25-400)U/L范围内线性绝对偏差不超过±70U/L；在[400-1900]U/L范围内线性相对偏差不超过±15.0％。

5.精密度：重复性：CV≤10.0％；批间差：批间相对极差≤10.0％。

6.准确度：使用企业工作校准品，对试剂盒进行测试，相对偏差不超过±10％。

7.校准品性能指标

7.1外观：白色或淡黄色冻干粉末。

7.2正确度：|En|≤1。

7.3均匀性：CV瓶内≤10.0％。CV瓶间≤10.0％。

8.质控品性能指标

8.1外观：白色或淡黄色冻干粉末。

8.2准确度：检测结果不超过当批次质控品说明书标示值范围。

8.3均一性：CV≤10.0％。

经检测本发明中各实施例中的试剂盒均满足以上性能指标要求，对各实例产品的精密度试验和稳定性进行进一步试验如下：

一、精密度试验

试验方法：采用各实例中的试剂盒对质控品进行检测，分别进行10次重复性试验，计算平均值，将试验结果统计至表1。

表1

(注：表中SD为标准偏差，CV为变异系数)

由表1可知，本发明中各实施例中的产品在靶值为300U/L以及600U/L的条件下的批内精密度均＜10％，由此可见本发明中试剂盒具有较高的精密度。而当试剂盒中的试剂1以及试剂2的配比含量以及组分发生改变时，如对比例1-3所示，CV值发生了明显的增大，由此可见，各试剂中原料组成以及对应配比在影响产品精密度中的关键性作用。

二、稳定性试验

试验1：开盖稳定性试验

试验方法：开盖各实例中试剂载机1天，15天以及30天隔天检测正常血清样本(每个实例样本分别进行2组重复性试验)，得到表2：

表2

(注：相对偏差＝(第n天平均值-第1天平均值)/第1天平均值)

试验2：加速稳定性试验

试验方法：将各实例中的试剂盒中的试剂于37℃放置7天后，和4℃条件下存储的试剂比较临床血清样本检测值(每个实例样本分别进行2组重复性试验)，得到表3：

表3

(注：相对偏差＝(37℃检测值-4℃检测值)/4℃检测值)

由表2-3的开盖稳定试验以及加速稳定试验的试验结果可知，本发明中的试剂盒具有良好的稳定性，开盖稳定试验中15日的相对偏差均＜±2％，30日的相对偏差均＜±4％，相比较之下，对比例中试剂盒的相对偏差在15日以及30日均呈现较大的偏差，可见对应的试剂盒的稳定性明显差于实施例1-3。同理，加速稳定性试验中，本发明实施例1-3中的试剂盒在37℃放置7天后相对偏差值也明显低于各对比例。综上可知，本发明中的试剂盒具有良好的稳定性，在开盖以及加速稳定试验后仍能够保持良好的检测效果。

此外，本发明还进行了抗干扰的试验研究，也呈现出相近似的规律，从而可见本申请中试剂盒较高的抗干扰性能，此处不再进行详细说明。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。