一种奥曲肽的制备方法

技术领域

本发明涉及化合物合成技术领域，具体地，本发明涉及一种奥曲肽的制备方法。

背景技术

奥曲肽是一种人工合成的生长抑素8肽类似物，具有与天然内源性生长抑素类似的作用，其化学式为C

式Ⅰ：奥曲肽的一级结构

由于奥曲肽C端苏氨醇的存在，使得通过固相多肽合成策略获取全长奥曲肽具有非常大的挑战性。发展合适的方法，适用于奥曲肽低成本和高产量的工业化制备具有很大的必要。目前制备奥曲肽主要有三种策略。

策略一为全固相合成策略，该策略需在树脂上引入特殊的连接臂实现苏氨醇的偶连，包括：专利US 5889146和WO 2005087794采用了一种含醛基的树脂，通过缩醛实现苏氨醇与树脂的连接。专利US20040039161采用三氯乙酰亚胺基连接臂，以及专利WO2013046233采用苯甲醛连接臂实现苏氨醇与树脂的连接。由于需要特殊的树脂修饰，且成本相对较高，此类方法并未在工业规模生产中得到广泛应用。直接采用将苏氨醇偶连到商业化树脂上也是一种可行的方法，例如：专利US 6476186实现了苏氨醇与2-氯三苯甲基氯树脂的偶连。专利WO 2013098802实现了苏氨醇侧链羟基与MBHA树脂的偶连。这类方法简化了树脂的获取难度，但苏氨醇与树脂之间偶连的效率仍需进一步提高。

策略二为全液相合成策略，通过液相合成两个或多个片段，再将各个片段偶连成一体来实现奥曲肽的制备。专利WO 2003097668和WO 2007110765采用三片段[3+3]+2策略，专利WO 2013132505采用两片段2+6策略。液相合成可以实现大体量多肽片段的平行制备，但其操作过于复杂，使得生产周期优势并不明显。

策略三是固液相结合的合成策略，通过固相合成的片段，在液相缩合的条件下实现奥曲肽的制备。例如专利WO 2005087794和WO 2013046233所描述的通过固相合成两个或多个片段，再将这些片段在液相中实现偶连。专利WO 2010089757采用固相合成N端7肽，并实现7+1的液相缩合。

固相合成中，树脂占总成本的比例较重，而专利WO 2005087794和WO 2013046233中多肽片段多次使用树脂，经济性较差。虽然，专利WO 2010089757最大化了固相和液相的优势，然而其线性奥曲肽采用碘氧化策略，无形中增加了副产物的可能性，降低了后续纯化的便利性。

因此，亟需开发一种成本更低、产率更高的奥曲肽的制备方法。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种奥曲肽的制备方法，该方法在奥曲肽的制备中通过固相多肽合成与液相片段缩合的联用，发挥其各自的优势，操作简便，降低成本，降低副产物的生成。

为此，本发明一方面提供了一种奥曲肽的制备方法。根据本发明的实施例，所述制备方法包括步骤：

(1)固相合成获得全保护的线性七肽树脂，所述线性七肽的氨基酸序列为D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys；

(2)利用全保护切割试剂对所述线性七肽树脂进行切割，获得第一切割液，所述第一切割液中含有全保护的线性七肽，对所述第一切割液进行旋蒸处理，以便获取所述全保护的线性七肽；

(3)将所述全保护的线性七肽与苏氨醇混合，进行缩合反应，获得全保护的线性八肽中间体；

(4)利用第二切割试剂切割所述线性八肽中间体，获得第二切割液，以便获取线性奥曲肽粗品；

(5)利用二硫键配对试剂将所述线性奥曲肽粗品氧化，以便获取产物奥曲肽；

其中，所述全保护切割试剂为三氟乙醇/DCM溶液；

所述二硫键配对试剂为双氧水。

固相多肽合成具有操作简便，可机械化流程化的优势，而液相合成具有成本低，可规模化的优势。将固相合成和液相合成结合，发挥其各自的优势，在工业化生产中具有重要的意义。本发明通过固相合成获得全保护7肽，并通过液相合成将苏氨醇偶连至全保护7肽，得到全保护的线性奥曲肽，最后经过保护基脱除及双氧水氧化得到奥曲肽。本发明通过采用更具优势的保护氨基酸、成本低廉的全保护切割试剂和高效绿色的二硫键配对试剂(双氧水)，实现了适用于奥曲肽的工业化制备。

根据本发明的实施例，所述全保护的线性七肽树脂通过以下方法获得：

1)以树脂为载体，将Fmoc-Cys(trt)-OH及DIEA加入所述树脂中，投料比(摩尔比)为树脂：Fmoc-Cys(trt)-OH：DIEA＝1:(1-6):(2-12)，以便获取连接有Cys的树脂；

2)依次将Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Boc-D-Phe-OH逐个偶连到所述连接有Cys的树脂上，以便获取所述全保护的线性七肽树脂；

其中，氨基酸偶联过程中使用的缩合剂选自DIC、EDCI、HATU、HCTU、PyAOP、PyBOP中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述树脂为经DMF和/或DCM溶胀的树脂，所述树脂选自2-Cl-trityl resin、SASRIN resin。

根据本发明的实施例，所述树脂、每一种带有保护基的氨基酸以及所述缩合剂之间的摩尔比为1:(2-6):(2-6)。

根据本发明的优选的实施例，所述树脂、每一种带有保护基的氨基酸以及所述缩合剂之间的摩尔比为1:6:6，在此条件下，产生全保护的线性七肽树脂的效率较高。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述全保护切割试剂的浓度为20％-50％v/v。

所述全保护切割试剂的浓度只有在20％-50％v/v范围内，才能达到较好的切割效果，所述全保护切割试剂浓度过低，会影响切割效率。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述全保护切割试剂与所述线性七肽树脂的体积质量比为(5-50)mL:1g。

根据本发明优选的实施例，在步骤(2)中，所述全保护切割试剂与所述线性七肽树脂的体积质量比为10mL:1g。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，进行切割的时间为2-3h。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述全保护的线性七肽与苏氨醇的摩尔比为1：(1-10)。

根据本发明优选的实施例，在步骤(3)中，所述全保护的线性七肽与苏氨醇的摩尔比为1：1.2。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述缩合反应在DCM中进行，反应时间2-12h。

根据本发明的实施例，在步骤(4)中，所述第二切割试剂为TIPS、EDT、苯酚、茴香硫醚、水中的至少之一和TFA的混合液。

根据本发明的实施例，在步骤(4)中，所述第二切割试剂中TFA的浓度为85％-97.5％v/v。

所述第二切割试剂中TFA浓度过低会导致切割失败，浓度过高导致切割效果不好。

根据本发明的实施例，所述第二切割试剂切割所述线性八肽中间体的时间为2-3h。

根据本发明的实施例，步骤(4)进一步包括将所述第二切割液进行浓缩、沉淀、过滤，以便获取所述线性奥曲肽粗品；

其中，沉淀时所用的沉淀剂选自冰乙醚、冰甲基叔丁基醚。

根据本发明的实施例，在步骤(5)中，对所述线性奥曲肽粗品进行氧化的步骤如下：

获取所述线性奥曲肽粗品的水溶液，所述线性奥曲肽粗品的水溶液的浓度为1-10mg/mL，pH为7-9，将所述线性奥曲肽粗品的水溶液与双氧水混合，进行氧化反应，以便获取产物奥曲肽。

发明人利用双氧水进行二硫键配对，相比现有的碘氧化策略，降低了副产物的生成，从而减少后续纯化步骤，降低了纯化成本，适用于奥曲肽的工业化制备。

根据本发明的实施例，所述线性奥曲肽粗品与双氧水的摩尔比为1:(2-50)。

根据本发明优选的实施例，所述线性奥曲肽粗品的水溶液与双氧水的摩尔比为1:10。

发明人利用双氧水进行二硫键配对，所述线性奥曲肽粗品与双氧水的摩尔比在1:(2-50)范围内，优选1:10，才能获得较高的奥曲肽产率。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了实施例7中线性奥曲肽粗品的色谱结果；

图2显示了实施例7中线性奥曲肽粗品的质谱结果；

图3显示了实施例9中纯化后的奥曲肽的色谱结果；

图4显示了实施例9中纯化后的奥曲肽的质谱结果。

具体实施方式

根据本发明的具体实施例，本发明提供的奥曲肽的制备方法，包括步骤：

1)使用经DMF或DCM或DMF/DCM溶胀的树脂，树脂为2-Cl-trityl resin或SASRINresin；

2)将Fmoc-Cys(trt)-OH及DIEA加入到上述溶胀好的树脂中，反应2-12小时，投料比(摩尔比)为树脂：Fmoc-Cys(trt)-OH：DIEA＝1:(1-6):(2-12)，以便获取连接有Cys的树脂；

3)按照固相多肽合成的方法，根据奥曲肽的序列，依次将Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Boc-D-Phe-OH逐个偶连到所述连接有Cys的树脂上，得到全保护的奥曲肽七肽树脂。氨基酸偶连过程中使用的缩合剂选自DIC、EDCI、HATU、HCTU、PyAOP、PyBOP中的至少之一，其中，所述树脂、每一种带有保护基的氨基酸以及所述缩合剂之间的摩尔比为1:(2-6):(2-6)；

4)向全保护的奥曲肽七肽树脂中，加入全保护切割试剂，室温切割2-3小时，其中，全保护切割试剂为20％-50％v/v的三氟乙醇/DCM溶液，收集切割液，旋蒸去除液体，得到全保护的奥曲肽七肽；

5)将全保护的奥曲肽七肽及缩合剂溶于DCM中，向上述DCM溶液中滴加苏氨醇的DMF溶液，室温反应2-12小时。反应结束后，水洗，旋蒸去除溶剂，得到全保护线性八肽中间体；

6)向全保护线性八肽中间体中加入第二切割试剂，室温切割2-3小时。反应结束后，浓缩切割液，加入沉淀剂，过滤得到线性奥曲肽粗品。第二切割试剂为TIPS、EDT、苯酚、茴香硫醚、水中的至少之一和TFA的混合液。沉淀剂为冰乙醚或冰甲基叔丁基醚；

7)将线性奥曲肽粗品溶于水中，至终浓度为1-10mg/mL。调溶液pH至7-9之间，加入双氧水，室温进行线性奥曲肽的氧化；

8)将奥曲肽氧化液进行分离纯化，得到奥曲肽纯品。

在本发明中，Fmoc、tBu以及Boc为氨基酸的保护基。

各个带有保护基的氨基酸的用量可以相同也可以不同，只需满足所述树脂、每一种带有保护基的氨基酸以及所述缩合剂之间的摩尔比为1:(2-6):(2-6)即可。

本发明中“二硫键配对试剂”是指能够在线性奥曲肽中两个Cys之间形成二硫键的试剂。下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 Fmoc-Cys(Trt)-2-Cl-trityl resin的制备

称取2-Cl-trityl resin(1.2mmol/g,16.6g，20mmol)置于反应管中，加入200mLDMF/DCM，溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(23.3g,40mmol)溶于200mL DMF中并加入DIEA(13.9mL，80mmol)，混匀后加入上述溶胀好的树脂中，室温反应12小时。反应结束后，加入10mL甲醇。继续反应30min后，抽干树脂，使用DMF和DCM洗涤树脂，最后使用甲醇收缩树脂，获得干燥的Fmoc-Cys(Trt)-2-Cl-trityl resin，测得树脂替代值为0.52mmol/g。

实施例2 Fmoc-Cys(Trt)-2-Cl-trityl resin的制备

称取2-Cl-trityl resin(1.2mmol/g,16.6g，20mmol)置于反应管中，加入200mLDMF/DCM，溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(46.6g,80mmol)溶于200mL DMF中并加入DIEA(27.8mL，160mmol)，混匀后加入上述溶胀好的树脂中，室温反应2小时。反应结束后，加入10mL甲醇。继续反应30min后，抽干树脂，使用DMF和DCM洗涤树脂，最后使用甲醇收缩树脂，获得干燥的Fmoc-Cys(Trt)-2-Cl-trityl resin，测得树脂替代值为0.61mmol/g。

实施例3全保护奥曲肽七肽树脂的制备

称取实施例1中的Fmoc-Cys(Trt)-2-Cl-trityl resin(0.52mmol/g,19.2g，10mmol)置于反应管中，加入200mL DMF/DCM，溶胀树脂1小时。抽干树脂，加入200mL 20％哌啶/DMF进行Fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用DMF和DCM洗涤脱除反应后的树脂。称量Fmoc-Thr(tBu)-OH(15.8g,40mmol)、DIC(7.7mL，50mmol)和Oxyma(7.1g，50mmol)溶于200mL DMF中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应2小时，进行氨基酸的缩合。根据奥曲肽的氨基酸序列，依次偶连Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Boc-D-Phe-OH。每一次偶连过程均包括Fmoc的脱除、树脂的洗涤和氨基酸的缩合。最后使用甲醇洗涤树脂，风干后获得全保护奥曲肽七肽树脂。

实施例4全保护奥曲肽七肽树脂的制备

称取实施例2中的Fmoc-Cys(Trt)-2-Cl-trityl resin(0.61mmol/g，16.3g，10mmol)置于反应管中，加入200mL DMF/DCM，溶胀树脂1小时。抽干树脂，加入200mL 20％哌啶/DMF进行Fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用DMF和DCM洗涤脱除反应后的树脂。称量Fmoc-Thr(tBu)-OH(7.9g,20mmol)、HCTU(8.2g，20mmol)、HOBt(2.7g,20mmol)和DIEA(6.6mL,40mmol)溶于200mL DMF中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应2小时，进行氨基酸的缩合。根据奥曲肽的氨基酸序列，依次偶连Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Boc-D-Phe-OH。每一次偶连过程均包括Fmoc的脱除、树脂的洗涤和氨基酸的缩合。最后使用甲醇洗涤树脂，风干后获得全保护奥曲肽七肽树脂。

实施例5全保护奥曲肽七肽树脂的全保护切割

称取50g实施例3中全保护奥曲肽七肽树脂置于反应管中，向其加入500mL 25％三氟乙醇/DCM溶液，室温反应2小时。抽滤，收集全保护切割液。旋蒸获得全保护奥曲肽七肽。

实施例6全保护奥曲肽七肽与苏氨醇的缩合

称取10g实施例5中全保护奥曲肽七肽、1.3g EDCI和0.95g Oxyma溶于100mL DCM中，向上述DCM溶液中滴加50mL含有0.7g苏氨醇的DMF溶液。室温反应2小时后，加入100mL蒸馏水混匀后，收集有机相。旋蒸去除溶剂，得到全保护奥曲肽八肽。

实施例7全保护奥曲肽的切割

称取5g实施例6中全保护奥曲肽八肽置于烧瓶中，加入50mL切割试剂(TFA:H

实施例8全保护奥曲肽的切割

称取5g实施例6中全保护奥曲肽置于烧瓶中，加入50mL切割试剂(TFA:H

实施例9线性奥曲肽的氧化

称取1g实施例8中线性奥曲肽粗品溶于1000mL蒸馏水中，使用氨水调pH至8.0左右，加入0.76mL双氧水，进行线性奥曲肽的氧化。待反应平衡后，调pH至3.0左右，终止反应。使用制备液相色谱进行奥曲肽氧化液的分离纯化，图3和图4分别展示了奥曲肽纯化后色谱图和质谱图。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。