一种白藜芦醇层状液晶及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种白藜芦醇层状液晶及其制备方法。

背景技术

角膜新生血管(Corneal neovascularization，CNV)是角膜损伤后出现一种病理性血管生成，常由眼部炎症、角膜接触镜、化学伤、免疫性疾病及角膜手术(如角膜移植)等原因导致。CNV会影响角膜屈光，导致患者视力下降甚至失明。CNV的形成机制是由于角膜内部促进和抑制血管生成因素之间的失衡。主要的血管生成因子包括：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子等，抗血管生成因子主要包括：色素上皮衍生因子、内皮抑素及血管抑素等。其中，VEGF是研究发现的作用最强的血管形成促进因子，在CNV的形成过程中明显增多。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管内皮细胞增殖和促进血管渗漏的作用，在正常血管发生中发挥着重要作用，同时可促进新生血管的生长诱导和维持。因此，研究认为VEGF在角膜新生血管的形成过程中，是一个重要的治疗干预靶点。角膜缘血管网的血管内皮细胞表达VEGF受体VEGFR-1和VEGFR-2，血管平滑肌细胞和单核细胞也表达VEGFR-1受体。Fukuda等研究认为缺氧使组织释放腺苷，促进内皮细胞合成VEGF，同时缺氧可诱导细胞内缺氧诱导因子1(HIF1)的活性增强，它可以调节多种缺氧应激蛋白的基因表达，增强细胞的无氧酵解能力，上调VEGF表达。VEGF与其受体结合后可增强一氧化氮合成酶(NOS)的合成，NO通过抑制内皮细胞蛋白激酶Cδ(PKCδ)的活性和增加内皮细胞表面整合素的活性而促进内皮细胞迁移和增殖，最终形成新生血管。可通过控制炎性细胞释放和/或抑制已释放出的VEGF生物效应，干预VEGF与其受体结合，达到抑制角膜新生血管增殖的目的。

目前，抗VEGF药物基本均采用入侵性的给药方式，例如，玻璃体内注射和结膜下注射。然而，采用这种入侵性方式给药操作复杂，并且具有一定的风险，因此，迫切需要开发一种高效、便捷且非入侵性的抗VEGF药物来治疗CNV。

白藜芦醇(Resveratrol)是一种常用于抗肿瘤研究的药物，其抗肿瘤机制复杂，抑制新生血管的形成是其中一个重要的机制，最新的研究发现白藜芦醇能够降低VEGF及mRNA和蛋白的表达，进而抑制新生血管的形成。白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，最早是在1924年被发现的，1974年从葡萄属植物中找到了该物质。经后期研究发现其广泛存在于葡萄、松树、虎杖、决明子和花生等天然植物或果实中，到目前为止至少已在21科、31属的72种植物中被发现。白藜芦醇作为一种植物抗生素，在许多植物受到生物或非生物胁迫(如真菌感染、紫外照射等)时产生。研究发现，白藜芦醇除了能提高植物的抗病性之外，还具有有益于人类健康的多种生物学活性及药理作用。1989年，法国流行病学调查报告首次发现了葡萄中存在的白藜芦醇是一种可以保护心血管的物质。1997年Jang等首次对白黎芦醇在肿瘤的起始、促进、发展三个阶段的抑制作用进行了系统报道，从而使白黎芦醇成为肿瘤化学预防和化学治疗的一个研究热点。近年来，随着研究的不断深入，发现白藜芦醇具有多种活性，如抑制单胺氧化酶(MAO)、蛋白酪氨酸酶(PTK)、蛋白激酶C(PKC)活性，在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、心血管保护和神经保护中也都发挥着重要的作用。更有研究发现，白黎芦醇可以抑制视网膜内皮细胞VEGF的表达及其导致的血管内皮增殖。白藜芦醇可能通过抑制沉默调节蛋白1(SIRT1)，进而抑制NF-kB活性，调控VEGF活性，但SIRT1与VEGF之间调控关系复杂，具体的机制仍需进一步研究证实。本发明的发明人在前期也使用了白藜芦醇悬浊液治疗角膜新生血管，取得了一定的治疗效果，但悬浊液难以提供持续有效的药物浓度，需要多次反复给药，故需要借助先进的制剂技术，寻找一种能够解决上述问题的新型制剂。

综上，白藜芦醇是一种具有较好发展前景的天然药物，但白藜芦醇在水中几乎微溶这一物理性质让其在临床中的应用受到了极大的限制。在眼用制剂中水溶性药物通常制成滴眼液，而水不溶性药物的制剂形式是混悬型滴眼液或眼膏。混悬型滴眼液中药物是以固体微粒的形式分散于液体介质中形成的多相分散体系，具有热力学不稳定性，静置后微细颗粒物沉淀难以维持稳定的药物浓度。眼膏往往粘度较大，虽延长了结膜囊内滞留时间，但使用时不便于给药且有油腻感，并会使视力模糊，不宜白天用药。此外，眼用制剂内有机溶剂的使用量较少，对于非水溶性药物，所能提供的载药量往往受到限制。故这两者无法实现高载药或无法长时间留滞角膜，使得临床使用中患者需要多次反复给药，降低了患者的依从性同时增加了局部的不良反应。寻找一种能够延长药物与角膜上皮或结膜之间的接触时间、降低局部不良反应的同时改善眼部生物利用度、局部定位给药或持续给药的新剂型是目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服采用白藜芦醇悬浊液治疗角膜新生血管难以提供持续有效的药物浓度且需要多次反复给药的缺陷，而提供一种新的白藜芦醇层状液晶及其制备方法，该白藜芦醇层状液晶在眼表具有牢固的滞留性，能够持久释放药物，增强角膜组织的药物渗透性，是白藜芦醇的理想眼部给药制剂。

为了实现以上目的，本发明提供了一种白藜芦醇层状液晶(Resveratrol-loadedocular lamellar crystalline gel，ROLG)，其中，所述白藜芦醇层状液晶中含有白藜芦醇、单油酸甘油酯(GMO)、醇和水，所述单油酸甘油酯与白藜芦醇的质量比≥16:1，所述单油酸甘油酯、醇和水的质量比为(2～10):(0.2～1):(1～10)；所述醇选自乙醇、丙二醇和聚乙二醇中的至少一种。

所述单油酸甘油酯与白藜芦醇的质量比≥16:1，例如，可以为16:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1、200:1等。将单油酸甘油酯与白藜芦醇的质量比控制在16:1以上能够确保ROLG中白藜芦醇呈无定型态分布。

所述单油酸甘油酯、醇和水的质量比为(2～10):(0.2～1):(1～10)，其中，单油酸甘油酯质量份数例如可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10等，醇的质量份数例如可以为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等，水的质量份数例如可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等。本发明的发明人经过深入的研究之后发现，在GMO/水界面处的醇降低了脂质液晶的表面张力，因此很容易随醇的变化而发生相变。当降低醇的比例时，产物是均匀的硬质透明的；当增加醇的比例时，产物为具有低粘度的略微不透明的溶液。当将单油酸甘油酯、醇和水的质量比为(2～10):(0.2～1):(1～10)时，才可获得具有适当粘度的均质白藜芦醇层状液晶。

所述醇选自乙醇、丙二醇和聚乙二醇中的至少一种，以上三种醇对人体的损害小，从而为ROLG作为眼部给药制剂奠定了基础。

在一种优选实施方式中，所述白藜芦醇、单油酸甘油酯、醇和水的质量比为(35～50)mg:(4～8)g:(0.4～0.8)g:(1～5)g，最优选为42mg:6g:0.6g:3g，在以上优选配比下，白藜芦醇在ROLG中的溶解度高达35～50mg/g，肉眼未观察到沉淀，并且在显微镜下未观察到固体。白藜芦醇的高溶解度与GMO抑制结晶密切相关。ROLG中的高白藜芦醇浓度能够促进药物穿透角膜渗透。

在一种优选实施方式中，所述水为纯净水。

在一种优选实施方式中，所述白藜芦醇层状液晶具有层状结构。

在一种优选实施方式中，所述白藜芦醇层状液晶的SAXS散射光谱图中存在两个层状峰。

在一种优选实施方式中，所述白藜芦醇层状液晶中的白藜芦醇呈无定型态分布，且白藜芦醇与单油酸甘油酯之间存在氢键结合。

本发明还提供了一种白藜芦醇层状液晶的制备方法，其中，该方法包括在50～60℃下，将白藜芦醇溶于醇中得到白藜芦醇/醇溶液，将单油酸甘油酯加热至50～60℃后与白藜芦醇/醇溶液混合均匀以获得油相，之后将温度为50～60℃的水缓慢滴入油相中搅拌混合均匀，即得白藜芦醇层状液晶；所述单油酸甘油酯与白藜芦醇的质量比≥16:1，所述单油酸甘油酯、醇和水的质量比为(2～10):(0.2～1):(1～10)，所述醇选自乙醇、丙二醇和聚乙二醇中的至少一种。

在一种优选实施方式中，所述白藜芦醇、单油酸甘油酯、醇和水的质量比为(35～50)mg:(4～8)g:(0.4～0.8)g:(1～5)g，优选为42mg:6g:0.6g:3g。

在一种优选实施方式中，所述水为纯净水。

在一种优选实施方式中，所述混合的方式为涡旋混合。

本发明还提供了由上述方法制备得到的白藜芦醇层状液晶。

本发明提供的白藜芦醇层状液晶载药量高，安全性好，能够增强角膜组织的药物渗透性，可持久释放药物，并可明显抑制大鼠角膜新生血管生长，促进角膜上皮修复，降低角膜VEGF表达，有望成为新型的治疗角膜碱烧伤的局部用药制剂，为角膜碱烧伤治疗提供新思路。

附图说明

图1为ROLG的偏光镜(PLM)图像。

图2为ROLG的SAXS衍射结果图。

图3为ROLG的模量与应变的曲线图。

图4为纯GMO、GMO/白藜芦醇混合物的冻干粉(重量比为4、8和16)的PXRD检测结果图。

图5为GMO和白藜芦醇之间的分子对接结果图。

图6为纯白藜芦醇、纯GMO、GMO/白藜芦醇混合物的冻干粉(重量比为4、8和16)中羟基的FTIR结果图。

图7为ROLG的微观结构模拟特性图。

图8为ROLG中白藜芦醇的释放结果图。

图9为ROLG中白藜芦醇的渗透结果图。

图10为ROLG的体内安全结果图。

图11为ROLG在眼表的滞留结果图。

图12为ROLG对CNV治疗结果图。

图13为ROLG对促进角膜表皮恢复的结果图；

图14为ROLG对降低角膜中VEGF蛋白表达的结果图。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

白藜芦醇层状液晶(ROLG)的制备及表征

一、实验材料

(1)实验试剂：

(2)实验仪器：

二、实验方法

(一)白藜芦醇层状液晶的制备

将白藜芦醇(42.0mg)溶解于乙醇(0.6g)中，得到白藜芦醇-乙醇溶液，将其置于55℃水浴中备用，记为溶液A。将单油酸甘油酯GMO(6.0g)加热至55℃熔融后，加入上述溶液A中，涡旋混合后备用，记为溶液B。将热的超纯水(3.0g，55℃)缓慢滴入上述溶液B中，同时充分涡旋震荡，即得到白藜芦醇层状液晶(ROLG)。然后将所得ROLG在室温下密封避光保存。

(二)白藜芦醇含量分析方法的建立

(1)色谱条件：采用高效液相色谱法(High performance liquidchromatography,HPLC)检测白藜芦醇的含量，选择Agilent C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水(60:40，V:V)，流速为1.0mL·min

(2)对照品溶液的制备：准确称取白藜芦醇1mg，将其溶解于10mL流动相中，得到白藜芦醇对照品溶液。取5mg空白层状液晶(LCG，具体为GMO)，溶于10mL流动相中，得到空白层状液晶对照品溶液。

(3)专属性分析：分别取白藜芦醇对照品溶液和空白层状液晶对照品溶液0.5mL，采用0.22μm滤膜过滤后进样分析。

(4)线性关系分析：称取20.0mg白藜芦醇，将其于10mL乙醇中完全溶解，得到2000.0μg·mL

(三)白藜芦醇层状液晶的表征方法

(1)偏光镜检测：取ROLG样品(0.1g)置于载玻片中央，然后盖上盖玻片，使用偏光显微镜(PLM，DMLP，Leica，德国)对其进行观察。

(2)小角度X射线散射(SAXS)：使用小角度X射线散射分析仪(SAXSee，Anton Paar)鉴定ROLG的内部结构。具体地，取适量白藜芦醇层状液晶用锡纸包裹成片状。将样品置于检测台中央，施加45kV和50mA的铜旋转阳极的镍过滤铜Ka辐射

(3)流变性能：采用直径为20mm、锥角为1°、间隙为28μm的锥板传感器H-PTD200流变仪对白藜芦醇层状液晶的流变特性进行研究。取适量样品置于样品台上，测量温度下平衡2分钟后开始检测。采用振幅振荡模式，扫描频率固定为1Hz，在0.01％～100％应变范围内进行扫描。根据线性粘弹性区域的值，采用振荡频率模式进行扫描，范围为0.01～100rad·s-1，测量温度维持在32±0.1℃。

(四)白藜芦醇层状液晶高载药机制研究

(1)GMO/白藜芦醇冻干粉的制备

分别称取白藜芦醇原料药0.75、0.38、0.19g，溶于10.71、5.43、2.71g无水乙醇后备用。另称取四份3.0g GMO于55℃熔融后，分别加入上述白藜芦醇-乙醇溶液，涡旋混匀后，缓慢滴加55℃的超纯水1.5g，充分涡旋震荡。将所得不同GMO/白藜芦醇(重量比为4、8、16)的混合物冷冻干燥，具体过程包括：-45℃冷冻4h，-20℃/0.007mbar一次干燥20h，-35℃/0.0014mbar二次干燥40h。所得冻干粉自封袋密封后避光保存。

(2)粉末X射线衍射：粉末X射线衍射(PXRD)通常用于检测材料和药物的结晶度。在实验中，使用纯白藜芦醇、纯GMO、GMO/白藜芦醇混合物的冻干粉(重量比为4、8和16)确定结晶度。所有样品在粉末X射线衍射仪(Bruker，D8 Advance，Billerica，MA，USA)上进行测定。其中，电压设置为45kV，电流设置为40mA，发散和散射狭缝设置为1°，接收狭缝设置为0.2mm，扫描速度设置为3°/min(0.4s/0.02°)，扫描范围2θ设置为5°至35°。

(3)分子对接：采用Sybyl 6.9.1软件对白藜芦醇和GMO进行结构最小化和结构动力学优化后，建立白藜芦醇和GMO的结构文件。利用AutoDock 4.0软件进行白藜芦醇和GMO的分子对接计算。优化的自动对接参数如下：最大能量评估次数为2500万次/次；Solis和Wets局部搜索的迭代次数为3000次；代数为100代，个体数为300个。位置均方根偏差小于

(4)傅立叶变换红外光谱：傅立叶变换红外光谱(FTIR)用于验证GMO和白藜芦醇之间的分子相互作用。使用配备有ATR工具和MCT检测器的FTIR仪器(Bruker,Ettlingrn，德国)，分别在400cm

三、实验结果

(1)ROLG的结构特性：

ROLG的偏光镜(PLM)检测结果、SAXS散射结果分别如图1和图2所示。从图1可以看出，ROLG呈光学各向异性，可见典型的“马尔文十字晶花”结构，这是层状液晶的典型特征。从图2可以看出，ROLG显示出具有间距比为3:4的两个典型的层状峰，这进一步说明了ROLG的层状液晶结构。振荡应变扫描反映了的线性粘弹性域。选取线性黏弹区域内的一个较小应力(0.05Pa)，在此应力下，对样品进行频率扫描(小振幅振荡实验)，结果见图3。从图3可以看出，ROLG的损耗模量(G”)和存能模量(G')在小于100％的应变范围内保持恒定，表明即使施加了较大的变形，水的完整结构也是如此；应变超过100％后，G”急剧下降，表明ROLG结构崩溃。

(2)ROLG中白藜芦醇结晶的抑制：

液晶材料的PXRD图样通常表现出尖锐的液晶峰，而非晶态材料则显示出晕轮图样的宽广背景。白藜芦醇在8～27°时在PXRD图谱中观察到一些强衍射峰，表明白藜芦醇是液晶药物。纯GMO、GMO/白藜芦醇混合物的冻干粉(重量比为4、8和16)的PXRD检测结果如图4所示，其中，Res代表白藜芦醇。从图4可以看出，GMO在22.4°有一个尖峰，表明GMO是液晶物质。GMO/白藜芦醇混合物的PXRD图谱显示，随着GMO/白藜芦醇比例的增加，药物的特征衍射峰强度有变弱的趋势。当GMO/白藜芦醇的重量比等于16时，白藜芦醇的液晶衍射峰消失。这表明，本发明提供的ROLG中分散的白藜芦醇呈无定型态。

(3)GMO与白藜芦醇之间的分子间氢键：

在分子对接模拟中GMO的羟基与白藜芦醇的羟基形成氢键，其结合能总计为-1.2kcal/mol，具体如图5所示。为明确这种氢键作用的存在，使用傅立叶红外光谱(FTIR)进一步验证。纯白藜芦醇、纯GMO、GMO/白藜芦醇混合物的冻干粉(重量比为4、8和16)中羟基的FTIR测定结果见图6和表1，其中，Res代表白藜芦醇。

表1.不同比例的GMO和白藜芦醇羟基的FT-IR谱峰

图6和表1的结果表明，GMO可以通过GMO和白藜芦醇之间的氢键抑制白藜芦醇结晶。白藜芦醇光谱中1145cm

白藜芦醇层状液晶的微观结构研究

一、实验材料

(1)实验试剂：

(2)实验仪器

二、实验方法

(一)白藜芦醇层状液晶微观结构的构建

(1)分子模拟：分子模拟通常用于计算纯组分的溶解度参数(δ)和Flory-Huggins参数(χ)。如结构式(1)所示，将一个单油酸甘油酯分子切分为片段A(疏水性长链片段)和片段B(亲水性甘油酯片段)。利用Materials Studio 7.0软件中的Amorphous Cell模块在compass力场下构建白藜芦醇层状液晶的分子体系。对系统的初始配置进行10000步能量最小化，能量收敛阈值设为1×10

如果没有氢键等特殊相互作用的情况下，则非极性体系中组分i和j之间的Flory-Huggins参数χ

其中，δ

极性组分或具有特殊相互作用的组分的Flory-Huggins参数χ

其中，ΔE

(2)介观模拟(DPD模拟)：采用介观模拟的方法建立白藜芦醇/单油酸甘油酯/醇/水体系的微观结构，并研究药物释放的机理。介观模拟之前首先要设置粗粒化珠子的体积。在这里，一个水分子被认为是一个粗粒化珠子。三个粗粒化珠子和五个粗粒化珠子分别代表一个乙醇分子和一个二甲双胍分子。一个单油酸甘油酯分子由总共21个粗粒化珠子组成，其中，A片段由5个珠子组成，B片段由16个珠子组成。不同组分aij的相互作用参数可通过以下公式(4)估算。

a

其中，a

对于每个系统，仿真箱尺寸为20×20×20r

(二)白藜芦醇层状液晶在体安全性考察

将12只SD雄性大鼠(200±20g)随机分为层状液晶组和乙醇组，每组6只。裂隙灯排除有眼前节病变的大鼠。层状液晶组大鼠每日给予一次ROLG(200μl)，连续14天。乙醇组在第15天时，将浸透6％乙醇溶液的滤纸片(3mm)置于大鼠角膜上3min后取下。生理盐水冲洗结膜囊后，用荧光素钠眼科试纸测定两组的角膜上皮完整性并拍照。麻醉处死后，将大鼠角膜组织取出，剔除多余的虹膜和巩膜，置于10％的甲醛溶液中固定48h，制备成石蜡切片(约5μm)，并进行苏木精-伊红染色，使用倒置荧光显微镜观察并记录。

(三)白藜芦醇层状液晶体外释放性能的考察

将1g白藜芦醇层状液晶加入盛有200mL生理盐水的锥形瓶中，将该锥形瓶固定在恒温振荡器摇床上，然后在37℃下以300rpm的频率振荡，在预定的时间点(1min、5min、15min、30min、1h、2h、7h、16h、24h)，从锥形瓶中取出1mL样品溶液，并加入等量的新鲜生理盐水，每组进行三个平行实验。所得样品采用0.22μm滤膜过滤后，以“白藜芦醇含量分析方法的建立”中的检测条件进行测定。计算并绘制白藜芦醇(Qr)累积释放量随时间变化的曲线。用下列公式分析白藜芦醇层状液晶的释放机理：

零级释放方程：

M

Higuchi方程：

Ritger-Peppas方程：

M

其中，M

(四)白藜芦醇层状液晶的滞留时间考察

白藜芦醇透明质酸的制备：称取透明质酸0.51g于10mL纯化水中，静置溶胀12h后，之后加入45.78mg白藜芦醇，得到白藜芦醇透明质酸(RHS)。

白藜芦醇层状液晶的制备：如前所述。

采用光学相干断层扫描(OCT)比较白藜芦醇层状液晶和白藜芦醇透明质酸在大鼠角膜表面的滞留时间。采用腹膜注射异戊巴比妥(每只大鼠2.4mL，40mg/mL)麻醉大鼠，将其固定在检测平台上，保持左眼向上，眼轴与平台垂直。用移液枪滴加40μl待测样品于角膜表面后，立即采集角膜前段OCT图像，每15min重复一次。扫描源OCT(SS-OCT)包括MEMS扫描源(HSL-20-100-B，中心波长：1310nm，Santec Technologies，日本)，平衡光电探测器(INT-MSI-1300B，Thorlabs，Newton，NJ)，数据采集设备(ATS9350，Alarztec Technologies，纽顿，新泽西州)和其他组件。OCT在空气中提供的图像分辨率为轴向约12μm，横向约22μm。图像采集速率约为每秒60帧。测量中央角膜处的制剂厚度，并绘制其随时间变化的曲线。

(五)白藜芦醇层状液晶的体外透角膜实验：

采用有效扩散面积为0.5cm

V(mL)是接受池中的生理盐水体积，C

三、实验结果

(1)Flory-Huggins参数

Flory-Huggins参数是计算模拟中一个非常重要的指标，它可以用来预测二元混合物的混合程度。因为实验测量过程非常复杂，通常会采用分子模拟来获得该参数。介观模拟通常需要Flory-Huggins参数制备体系的微观结构。因此，可将Flory-Huggins参数视为分子模拟与介观模拟之间的桥梁。

估算液晶体系在328K下二元组分的Flory-Huggins参数以及纯组分的溶解度参数(δ)(见表2)，δH

表2.分子模拟参数

其他χ表示为相似模式。

Flory-Huggins参数的绝对值(χ)小于0.5表明二元组分是可混溶的，而负数表明二元组分之间存在相互吸引，ROLG中所有组分的Flory-Huggins参数均已获得。χH

(2)ROLG的微观结构(DPD)模拟：

等密度表面反映了ROLG的内部结构和药物分布。ROLG的DPD模拟特性见图7。结果表明，ROLG的内部结构含有脂质和水的双连续平行通道(见图7中A和B)，是层状液晶的典型特征。ROLG表现出复杂的空间组织，其中，GMO的亲水性基团(片段A)向内，而疏水性基团(片段B)向外，如图7中C中的“点和线”模型所示。乙醇已广泛用于眼表手术和角膜疾病的治疗。然而，角膜表面短暂接触乙醇会破坏角膜上皮的完整性并引发炎症，从而产生长期影响。如上所述，ROLG中的乙醇分布主要位于两个通道之间的界面。由于层状液晶的典型结构，ROLG中的乙醇只能间接与角膜表面接触，减少了乙醇对角膜组织的有害影响。同样，由于GMO-白藜芦醇之间的氢键键合和药物疏水性，白藜芦醇也分布在两个通道之间的界面周围。这些发现表明白藜芦醇的释放可能取决于ROLG的降解。

(3)ROLG中白藜芦醇的缓释

ROLG中白藜芦醇的释放见图8。从图8可以看出，ROLG可能提供白藜芦醇持续释放的机制。溶解后30min，药物累积释放达到10％。另外，释放7h后，累积释药率达到67％。ROLG药物的稳定释放可以促进药物在角膜中的渗透。通过计算药物累计释放量与时间的三次方呈线性关系，这表明ROLG的释放动力学与Ritger-Peppas方程一致(见表3)。白藜芦醇的释放主要基于溶蚀原理，而上述DPD模拟的观点一致。

表3.ROLG释放拟合曲线

(7)ROLG的透角膜情况：

使用Franz扩散池系统研究不同制剂中白藜芦醇的透角膜性，结果见图9。从图9可以看出，与RHS相比，ROLG具有更高的透过量和透过速率，在3h时，ROLG组中白藜芦醇的累积渗透量为412μg，而RHS组中白藜芦醇的累积渗透量仅为59μg。同样，ROLG组在5h和11h的累积透过量(845μg和1557μg)也远超过RHS组(213μg和807μg)。由此计算出，ROLG组的透角膜速率(Jss＝115±48μg·cm

(4)ROLG的体内安全性：

使用荧光素钠测试角膜上皮的完整性。ROLG组和乙醇溶液组暴露后角膜上皮染色图像分别如图10中A和B所示，ROLG组和乙醇溶液组暴露后对应的病理切片图像分别如图10中C和D所示，黑色箭头表示角膜上皮损伤严重。ROLG组的角膜光滑，未见染色(见图10中A)，表明角膜上皮完整。但是暴露于6％乙醇的角膜被染成黄绿色，说明角膜上皮受到损伤(见图10中B)。后续的病理学切片也证实了这一观点，ROLG组角膜结构完整，组织细胞排列整齐(见图10中C)，乙醇溶液组的角膜上皮不完整，基质层结构紊乱(见图10中D)。这些结果证明，ROLG是一种安全的眼部给药方式。

(5)ROLG的滞留性：

ROLG和RHS残留在角膜中央的厚度随着时间而减少(见图11，其中，A为实时OCT图像，B为厚度随时间的变化曲线图)。从图11可以看出，给药后，ROLG和RHS均能在大鼠角膜表面分散形成一层薄膜。15min后，RHS组的残留制剂厚度从1000μm降至500μm，ROLG组从1000μm降至850μm，可以看出的减少速度明显快于层状液晶。尤其是30min时，已无法肉眼观察到制剂残留，此时，层状液晶组约有700μm厚度的制剂，直至120min停止实验时，仍有约100μm的层状液晶能够停留在大鼠的角膜中央。因此，本研究制备的层状液晶能够显著延长制剂在角膜的滞留时间，为药物透过角提供了基础和前提，具体的药物透角膜情况将在下面的实验中进一步探讨。

白藜芦醇层状液晶的药效学研究

一、实验材料

(1)实验试剂：

(2)实验仪器：

裂隙灯显微镜成像系统 上海精密仪器仪表有限公司

倒置荧光显微镜 德国蔡司股份公司

二、实验方法

(1)动物模型制备：采用1％戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)麻醉大鼠后，0.4％盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉3次。将滤纸剪成直径约3mm的圆片，浸入1mol/L的NaOH溶液1min。暴露大鼠右眼，将滤纸片置于角膜中央，30s后撤去滤纸，迅速用生理盐水冲洗结膜囊3次，建立大鼠角膜碱烧伤模型。术后所有术眼每日3次给予左氧氟沙星滴眼液1滴，预防感染。所有大鼠均选择右眼为术眼，所有操作均由一人完成。

(2)分组治疗：模型建立成功后，模型组给予生理盐水200μL/次，LCG组、RHS组、ROLG组分别给予相应的药物200μL/次，每日给药1次，共14天。

(3)角膜新生血管的测量：给药的第7、10、14天，采用裂隙灯显微镜成像系统观察各组CNV的生长情况并拍照。Image J软件测量血管长度(从角膜缘到血管顶端)，通过公式(9)计算新生血管面积。

A＝C/12×3.416×[R

C为新生血管累及角膜的圆周钟点数，L为新生血管从角膜缘深入角膜的长度，大鼠角膜半径R＝2.6mm。

(4)角膜常规检查：大鼠角膜碱烧伤后第14天处死大鼠，取出角膜组织，去除多余的虹膜和巩膜，置于10％的甲醛溶液中固定48h，制备成石蜡切片(约5μm)，并进行苏木精-伊红染色，使用倒置荧光显微镜观察组织结构。

(5)免疫组化检测大鼠角膜VEGF蛋白的表达：将角膜石蜡切片二甲苯脱蜡后，浸泡在pH 8.0的乙二胺四乙酸抗原恢复液中去除抗原。PBS(pH＝7.4)冲洗5min后，用3％的过氧化氢溶液(30μL)去除内源性过氧化物酶。抗VEGF一抗室温孵育30min后洗净，二抗室温孵育30min。免疫组化染色根据抗体说明书进行。倒置荧光显微镜下观察组织VEGF蛋白阳性反应为黄褐色或棕黄色颗粒染色。

(6)统计分析：采用spss19统计软件，采用完全随机分组独立样本t检验进行两组间两两比较，数据采用χ±s表示，p＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

(1)角膜新生血管生长情况：

大鼠碱烧伤后角膜新生血管形成如图12所示。从图12可以看出，在每组大鼠的角膜上观察到了新血管形成(图12中A)。与其他组相比，在相同的测量时间点，ROLG组的大鼠具有更好的治疗效果(图12中A)。从计算出的血管面积(见表4)，可以更直观的证实ROLG组具有更好的抑制血管生成的作用。如第14天，对照组为65.81mm

表4对照组、RHS组、BLCG组、ROLG组新生血管面积

(2)病理切片观察：

造模14天后正常、对照组、RHS组、ROLG组和BLCG组角膜HE切片见图13。从图13可以看出，与正常角膜组织相比，对照组、RHS组和BLCG组角膜组织的HE切片可见胶原纤维紊乱、水肿、充血、大量炎症细胞。对照组、RHS组中可见新生血管肉芽。相比之下，ROLG组的角膜组织上皮完整，基质层纤维排列较规则，只有少量炎症细胞，未见新生血管肉芽。

(3)免疫组化观察角膜中VEGF蛋白的表达

造模14天后正常、对照组、RHS组、ROLG组和BLCG组VEGF蛋白荧光染色图片见图14。从图14可以看出，正常大鼠的房水中有少量的VEGF蛋白表达，荧光染色可见少量黄褐色颗粒分布于角膜内皮层附近。造模后第14天，对照组、RHS组和BLCG组在角膜组织内部均可见大量的VEGF蛋白强表达，各组表达程度相近，而ROLG组的VEGF表达水平显著较低。

以上实验结果表明，ROLG在眼表上具有牢固的滞留性，并且ROLG通过在脂质层状分子-单油酸甘油酯和药物分子-白藜芦醇之间形成氢键作用，能够显著提高载药量(4.4mg/g)。白藜芦醇持续释放，在7h内累积释放可达到67％。此外，ROLG增强了在角膜组织中的药物渗透性，ROLG中白藜芦醇的角膜渗透率比透明质酸悬浮液(RHS)中白藜芦醇的角膜渗透率高。由于ROLG在角膜表面的牢固滞留，因此每天仅施用一次即可。再则，由于ROLG特殊的结构可以减少ROLG中乙醇与角膜的接触，因此，ROLG对于白藜芦醇的连续输送具有良好的安全性。更为重要的是，大鼠角膜碱烧伤后的CNV能够被ROLG高度抑制，这是由于角膜VEGF表达减弱和角膜愈合所致，也即，将ROLG作为抗VEGF药物能够更有效抑制CNV。因此，ROLG是白藜芦醇的理想眼部给药方式，有利于CNV的治疗，ROLG是预防和治疗CNV的潜在眼科药物。综上，白藜芦醇层状液晶载药量高，安全性好，可明显降低角膜VEGF表达，抑制大鼠角膜新生血管生长，促进角膜上皮修复。白藜芦醇层状液晶有望成为新型的治疗角膜碱烧伤的局部用药制剂，为角膜碱烧伤治疗提供新思路。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。