一种甲状腺癌类器官的培养基、培养方法和检测方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种甲状腺癌类器官的培养基、培养方法和检测方法。

背景技术

甲状腺癌是常见的内分泌恶性肿瘤，我国属于高发地区，发病率逐年增加。根据肿瘤起源及分化差异，可把甲状腺癌分为：甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid cancer,PTC)、甲状腺滤泡状癌(Follicular thyroid cancer,FTC)、甲状腺髓样癌(Medullarythyroid cancer,MTC)和甲状腺未分化癌(Anaplastic thyroid cancer,ATC)。其中，PTC约占全部甲状腺癌的85％-90％。虽然大部分分化型甲状腺癌经手术、术后放射性碘-131以及甲状腺激素抑制治疗可达到缓解，但部分患者在其自然病程或经过治疗后呈现放射性碘难治性状态。放射性碘难治性、转移性或晚期甲状腺癌患者生存率明显下降，是目前甲状腺癌临床诊治的难点和热点。

目前肿瘤的个体化精准医疗缺乏合适的临床前评价模型，2D肿瘤细胞系和小鼠移植模型由于存在很多缺陷，不是临床前抗肿瘤药物的疗效评价的最佳选择。类器官(Organoid)是在体外用3D培养技术对干细胞或器官祖细胞进行诱导分化形成的在结构和功能上都类似目标器官或组织的三维细胞复合体,其具有稳定的表型和遗传学特征,能够在体外长期培养。肿瘤类器官模型不仅能展现其来源肿瘤的生物学特征，保持基因表达的稳定性，还能精确地预测患者对抗肿瘤药物的反应。目前已经成功建立了结直肠癌、胃癌、前列腺癌、食管腺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、膀胱癌等多种肿瘤类器官培养体系。患者来源的肿瘤类器官模型被认为是一项重大突破，为个性化癌症治疗开辟了新的视野。目前国内外仅有1项报道甲状腺癌类器官的研究(Sondorp et al.,Cancers(Basel),2020,12(11):3212)，但该研究难以获得在体外长期稳定培养的甲状腺癌类器官模型，而且甲状腺癌类器官模型的培养步骤、最适培养基配方和鉴定方法没有具体阐明。构建甲状腺癌类器官这一体外模型，对于建立放射性碘和抗肿瘤药物的临床前疗效预测平台，筛选放射性碘和靶向药物治疗相关基因，及时终止无效碘治疗，指导患者临床用药，推动难治性甲状腺癌的个体化精准医疗的发展具有重要意义。

因此，仍亟需开发一种甲状腺癌类器官的培养基、培养方法和检测方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种甲状腺癌类器官的培养基、培养方法和检测方法。

第一方面，本发明提供一种甲状腺癌类器官的培养基。

一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基包含基础培养基和以下成分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190和促甲状腺激素。

所述培养基还可以含有成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-10、Y-27632和A83-01中的至少一种。

所述基础培养基可以为Advanced DMEM/F12培养基。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比可以为0.5-2％。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为1％。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度可以为1-2mM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述烟酰胺的浓度可以为1-50mM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述烟酰胺的浓度为5-40mM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述烟酰胺的浓度为5-20mM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述烟酰胺的浓度为10-15mM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述烟酰胺的浓度为10mM。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述R-spondin 1重组蛋白的浓度可以为100-1000ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为200-900ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为300-800ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为400-700ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为500-600ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为500ng/mL。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述头蛋白的浓度可以为50-200ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述头蛋白的浓度为100-150ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述头蛋白的浓度为100ng/mL。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述SB202190的浓度可以为1-20μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述SB202190的浓度为5-15μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述SB202190的浓度为10-15μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述SB202190的浓度为10μM。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述A83-01的浓度可以为100-1000nM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述A83-01的浓度为200-800nM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述A83-01的浓度为300-700nM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述A83-01的浓度为400-600nM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述A83-01的浓度为500nM。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述表皮细胞生长因子的浓度可以为10-100ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述表皮细胞生长因子的浓度为20-80ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述表皮细胞生长因子的浓度为30-70ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述表皮细胞生长因子的浓度为40-60ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-7的浓度可以为1-10ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为2-8ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为3-7ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为4-6ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为5ng/mL。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度可以为1-10ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为2-8ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为3-7ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为4-6ng/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为5ng/mL。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述促甲状腺激素的浓度可以为1-100μg/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述促甲状腺激素的浓度为10-90μg/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述促甲状腺激素的浓度为20-80μg/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述促甲状腺激素的浓度为30-70μg/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述促甲状腺激素的浓度为40-60μg/mL。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述促甲状腺激素的浓度为50μg/mL。

所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述Y-27632的浓度可以为1-100μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述Y-27632的浓度为10-90μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述Y-27632的浓度为20-80μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述Y-27632的浓度为30-70μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述Y-27632的浓度为40-60μM。在一些实施例中，所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述Y-27632的浓度为50μM。

在本发明的一些实施方式中，一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基包含基础培养基和以下成分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190和促甲状腺激素；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为0.5-2％；所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1-2mM；所述烟酰胺的浓度为1-50mM；所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为100-1000ng/mL；所述头蛋白的浓度为50-200ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为10-100ng/mL；所述SB202190的浓度为1-20μM；所述促甲状腺激素的浓度为1-100μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基包含基础培养基和以下成分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190和促甲状腺激素；所述培养基还含有成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-10、Y-27632和A83-01中的至少一种；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为0.5-2％；所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1-2mM；所述烟酰胺的浓度为1-50mM；所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为100-1000ng/mL；所述头蛋白的浓度为50-200ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为10-100ng/mL；所述SB202190的浓度为1-20μM；所述促甲状腺激素的浓度为1-100μg/mL；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为1-10ng/mL；所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为1-10ng/mL；所述Y-27632的浓度为1-100μM；所述A83-01的浓度为100-1000nM。

在本发明的一些实施方式中，一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基包含基础培养基和以下成分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190和促甲状腺激素；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为1％；所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM；所述烟酰胺的浓度为10mM；所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为500ng/mL；所述头蛋白的浓度为100ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL；所述SB202190的浓度为10μM；所述促甲状腺激素的浓度为10μg/mL。

在本发明的一些实施方式中，一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基包含基础培养基和以下成分：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190和促甲状腺激素；所述培养基还含有成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-10、Y-27632和A83-01中的至少一种；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为1％；所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM；所述烟酰胺的浓度为10mM；所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为500ng/mL；所述头蛋白的浓度为100ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL；所述SB202190的浓度为10μM；所述促甲状腺激素的浓度为10μg/mL；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为5ng/mL；所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为5ng/mL；所述Y-27632的浓度为10μM；所述A83-01的浓度为10nM。

第二方面，本发明提供一种甲状腺癌类器官的培养方法。

一种前述培养基培养甲状腺癌类器官的方法，包括以下步骤：

(1)取甲状腺癌组织，清洗，剪碎，用消化酶消化；

(2)终止消化；离心，弃去上清液，得第一沉淀物，重悬第一沉淀物，过滤，离心滤液，弃去上清液，得第二沉淀物，用DMEM/F12培养基和基质胶重悬第二沉淀物，接种，孵育；

(3)加入所述培养基培养，得到所述甲状腺癌类器官。

所述消化酶可以包括II型胶原酶和/或胰酶替代物。

所述基质胶与DMEM/F12培养基的体积比可以为3:1-10:1。

所述培养可以为于37℃培养6-14天，每3-5天更换一次所述培养基。

在一些本发明的实施方式中，一种前述培养基培养甲状腺癌类器官的方法，包括以下步骤：

(1)取甲状腺癌组织，清洗，剪碎，于37℃用II型胶原酶消化1小时；

(2)加入Hanks液终止消化；离心，弃去上清液，得第一沉淀物，用Hanks液重悬第一沉淀物，用70μm的滤网过滤，离心滤液，弃去上清液，得第二沉淀物，加入DMEM/F12培养基与第二沉淀物混合，再加基质胶进行重悬，所述基质胶与DMEM/F12培养基的体积比为3:1-10:1，接种，孵育；

(3)加入所述培养基于37℃培养7天，每3天更换一次所述培养基，得到所述甲状腺癌类器官。

第三方面，本发明提供一种甲状腺癌类器官的检测方法。

一种根据前述方法所得甲状腺癌类器官的检测方法，包括以下步骤：取所得甲状腺癌类器官与制备所述甲状腺癌类器官的甲状腺癌组织，分别进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、全基因组测序和外显子组测序。

所述免疫组织化学染色的鉴定标志物可以包括选自：半乳糖凝集素3、细胞角蛋白19、HBME-1、甲状腺球蛋白、降钙素、甲状腺转录因子1、基质金属蛋白酶、Ki-67、CD117和p53中的至少一种。

所述全外显子测序的数据量可以为24G。

所述全外显子测序的深度可以为200X。

所述甲状腺癌类器官与制备所述甲状腺癌类器官的甲状腺癌组织在基因突变和拷贝数变异上的相似度在80％以上。

有益效果

相比现有技术，本发明具有包括以下的有益效果：

1、本发明的甲状腺癌类器官的培养基、培养方法和鉴定方法是针对甲状腺癌细胞培养特点和甲状腺癌类器官的病理生理学特征设计的最佳的培养基、操作流程与鉴定方法。

2、根据甲状腺癌来源细胞的生长特点，本发明筛选了多种信号通路中关键的生长因子和抑制因子，并按照一定的比例进行调配，调配好的培养基中各因子含量适宜，甲状腺癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官，培养成功率可高达92％，传代次数至少可达15次。

3、在所述培养基中加入促甲状腺素，有利于提高甲状腺癌类器官的培养成功率和传代次数。

4、本发明建立的培养体系能够在体外长期、稳定地培养出甲状腺癌类器官，而且经历反复冻存和复苏后仍保持很高的生长效率。

5、本发明的甲状腺癌类器官模型能够在体外快速建成(1-2周)，能够用以放射性碘治疗前测试和药物敏感性测试，为患者的临床治疗给与有效指导。

6、本发明同时在组织病理学和基因组学上对甲状腺癌类器官进行了多维检测，显示其能够高度还原患者亲本肿瘤的特征，表明其能够有效的作为体内肿瘤的体外“替身”用以进一步的研究。

7、目前甲状腺癌的临床治疗上仍没有一个合适的体外模型。本发明获得的甲状腺癌类器官除了可以满足科研需要外，在预测甲状腺癌临床放射性碘治疗和指导临床用药方面，能够成为一个新型的、有效的临床前体外模型。

附图说明

图1为实施例3中采用实施例1所述培养基培养的甲状腺癌类器官生长过程的明场图和苏木精-伊红(H&E)染色图片；标尺为100μm。

图2为实施例3中采用实施例1所述培养基培养的甲状腺癌类器官及其来源肿瘤组织的苏木精-伊红(H&E)染色图片和甲状腺癌类器官明场照片；标尺为100μm。

图3为实施例3中采用实施例1所述培养基培养的甲状腺癌类器官及其来源肿瘤组织的免疫组织化学染色图片；标尺为100μm。

图4为实施例3中采用实施例1所述培养基培养的甲状腺癌类器官与其来源肿瘤的基因组学分析；A图表示甲状腺癌组织和对应类器官的高频突变基因比较热点图；B图表示甲状腺癌组织和对应类器官的点突变类型比较柱状图；C图表示甲状腺癌组织和对应类器官的基因拷贝数变异比较；其中，病人2、4和6分别从甲状腺癌组织的不同位置取样建立了两种甲状腺癌类器官系。

图5为实施例3中采用实施例2所述培养基培养的甲状腺癌类器官及其来源肿瘤组织的苏木精-伊红(H&E)染色图片和甲状腺癌类器官明场照片；标尺为100μm。

图6为实施例3中采用实施例2所述培养基培养的甲状腺癌类器官及其来源肿瘤组织的免疫组织化学染色图片；标尺为100μm。

图7为实施例3和实施例4中甲状腺癌类器官的培养和检测流程图。

术语说明

本发明中，rpm表示转每分钟；μM表示微摩尔每升；nM表示纳摩尔每升；μg表示微克；μL表示微升；ng/mL表示纳克每毫升；mL表示毫升；离心时的g为离心加速度单位，例如200g表示离心加速度为200倍重力加速度；U/mL表示“单位每毫升”。

本发明中，CK19表示细胞角蛋白19；Galectin-3表示半乳糖凝集素3；Tg表示甲状腺球蛋白；TTF-1表示甲状腺转录因子1；CD117表示一种酪氨酸激酶受体蛋白；Ki-67为一种与细胞增殖相关的核蛋白。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发明作进一步的详细说明。

本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。

本发明中所用到的试剂、设备及其来源：

下述实施例使用的主要仪器，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

主要仪器：细胞培养箱(厂家：Thermo)、倒置显微镜(厂家：Leica)、生物安全柜(厂家：香港力康生物医疗科技控股有限公司)，低速台式离心机(厂家：Eppendorf)、恒温水浴锅(厂家：上海一恒科学仪器有限公司)、石蜡切片机(厂家：Thermo)、移液器(厂家：Eppendorf)等。

实施例1：培养基

一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基由Advanced DMEM/F12培养基和以下成分组成：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190、A83-01、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-10、促甲状腺激素和Y-27632；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为1％；所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM；所述烟酰胺的浓度为10mM；所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为500ng/mL；所述头蛋白的浓度为100ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL；所述SB202190的浓度为10μM；所述A83-01的浓度为500nM；所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为5ng/mL；所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为5ng/mL；所述促甲状腺激素的浓度为10μg/mL；所述Y-27632的浓度为10μM，余量为Advanced DMEM/F12培养基。

实施例2：培养基

一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基由Advanced DMEM/F12培养基和以下成分组成：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190和促甲状腺激素；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为1％；所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM；所述烟酰胺的浓度为10mM；所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为500ng/mL；所述头蛋白的浓度为100ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL；所述SB202190的浓度为10μM；所述促甲状腺激素的浓度为10μg/mL；余量为Advanced DMEM/F12培养基。

实施例3：甲状腺癌类器官的培养

操作：分别取实施例1或实施例2所述培养基，分别取临床获得的8例不同病人的甲状腺癌组织，按以下步骤培养甲状腺癌类器官：

(1)取甲状腺癌组织清洗，剪碎成约1mm

(2)加入Hanks液终止消化；离心，弃去上清液，得第一沉淀物，用Hanks液重悬第一沉淀物，用70μm的细胞滤网过滤，细胞计数，离心滤液，弃去上清液，得第二沉淀物，用DMEM/F12培养基与第二沉淀物混合，再加基质胶进行重悬，所述基质胶与DMEM/F12培养基的体积比为3:1，接种，孵育2分钟后，再倒置8分钟使基质胶凝固；

(3)加入所述培养基于37℃培养8天，每3天更换一次所述培养基，得到所述甲状腺癌类器官。

结果：采用实施例1所述培养基所得甲状腺癌类器官如图1和图2所示；采用实施例2所述培养基所得甲状腺癌类器官如图5所示。

结果分析：

(1)图1显示了采用实施例1所述培养基培养14天后，甲状腺癌类器官可以达到直径100-150μm，培养21天后直径进一步扩大为200μm或以上；另外发现甲状腺癌类器官多为单个细胞的单克隆生长为类器官。

(2)图2和图5的中间列分别显示了分别采用实施例1和实施例2所述培养基成功培养的甲状腺癌类器官明场图片；光镜下观察发现，甲状腺癌类器官形态多为紧密的实心球状，也有如图2中病人2和4所显示的不规则形状。

实施例4：甲状腺癌类器官的检测

操作：取实施例3中所得甲状腺癌类器官及其来源甲状腺癌组织，进行苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色，分析类器官是否在形态学、组织病理学、和肿瘤标志物表达等方面重现其来源的肿瘤组织的特征；取培养的甲状腺癌类器官及其来源甲状腺癌组织，提取基因组DNA进行全基因组外显子建库和测序，检验培养的甲状腺癌类器官能否还原其来源肿瘤的基因突变和拷贝数变异等特征。其中，甲状腺癌组织和类器官的鉴别标志物包括：半乳糖凝集素3(Galectin-3)、细胞角蛋白19(CK19)、甲状腺球蛋白(Tg)、甲状腺转录因子1(TTF-1)、Ki-67和CD117；甲状腺癌组织和类器官的全外显子测序的数据量为24G，深度为200X。

结果：如图2-图6所示。

结果分析：

(1)图2和图5分别显示了分别采用实施例1和实施例2所述培养基培养的甲状腺癌类器官的明场图以及和它来源肿瘤组织的苏木精-伊红染色对比图，表明甲状腺癌类器官在形态和染色特征上与其来源肿瘤组织非常相似。

(2)图3和图6分别显示了分别采用实施例1和实施例2所述培养基培养的甲状腺癌类器官及其来源肿瘤组织的免疫组织化学图，表明甲状腺癌类器官能够还原其来源的肿瘤组织的病理学和标志蛋白表达的特征。

(3)图4显示了甲状腺癌类器官能够在基因突变和拷贝数变异上高度还原其来源肿瘤的特征。

这些结果表明，本发明建立的甲状腺癌类器官可以高度还原亲本肿瘤的组织病理学和基因组学特征，所述检测方法全面、准确。

对比例1：培养基(参考CN 111411083 B中配方)

一种培养基，包括基础培养基1640、特异性添加因子和无菌水；其中，所述基础培养基1640和所述无菌水的质量比为99:1；所述特异性添加因子包括：不含维生素A的B27，2X；N-acetylcysteine，0.5μM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R-spondin 1，800ng/mL；Wnt3a，100ng/mL；CHIR99021，8μM；thiazovivin，1.5μM；Gastrin I，25ng/mL；丙戊酸，0.5mM；青霉素链霉素混合液，1.2X；两性霉素B，0.8μg/mL；Primocin，1mg/mL；上述特异性添加因子各组分的终浓度均以其在基础培养基和无菌水的混合液中的终浓度为准。

对比例2：培养基(参考CN109837242A中配方)

一种培养基，所述培养基含有1％青霉素、1％链霉素、50ng/mL的EGF、50ng/mL的成纤维细胞生长因子、50ng/mL的Noggin重组蛋白、20mM的HEPES、500nM的A83-01、1.0μg/mL的R-spondin 3、5μM的Y-27632、5μM的SB202190、1％的B27、3mM的Glutamax、含体积百分比为8％FBS的Advanced DMEM/F12培养基。

对比例3：培养基(参考CN108396010A中配方)

一种培养基，所述培养基含有50ng/mL的EGF、100ng/mL的Wnt-3a、1μg/mL的R-spondin 1、500nM的A83-01、10μM的Y-27632、50ng/mL的Noggin重组蛋白、12μM SB202190、1X N2、1X B27补充剂、10mM的HEPES、2mM的Glutamax、500单位/mL青霉素、500单位/mL链霉素、12.5μg/mL两性霉素、含体积百分比为10％FBS的DMEM/F12培养基。

对比例4：培养基(参考CN111876386A中配方)

按表1配制培养基：

表1：培养基的配方

对比例5：缺失促甲状腺素的培养基

一种甲状腺癌类器官的培养基，所述培养基由Advanced DMEM/F12培养基和以下成分组成：B-27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、R-spondin 1重组蛋白、头蛋白、表皮细胞生长因子、SB202190、A83-01、成纤维细胞生长因子-7、成纤维细胞生长因子-10、促甲状腺激素和Y-27632；所述培养基中，以所述培养基的总体积计，所述B-27的体积百分比为1％；所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mM；所述烟酰胺的浓度为10mM；所述R-spondin 1重组蛋白的浓度为500ng/mL；所述头蛋白的浓度为100ng/mL；所述表皮细胞生长因子的浓度为50ng/mL；所述SB202190的浓度为10μM；所述A83-01的浓度为500nM；所述成纤维细胞生长因子-7的浓度为5ng/mL；所述成纤维细胞生长因子-10的浓度为5ng/mL；所述Y-27632的浓度为10μM，余量为Advanced DMEM/F12培养基。

对比例6：类器官的培养

操作：分别取对比例1-5所述培养基，按以下步骤培养类器官：

(1)取临床获得的甲状腺癌组织，清洗，剪碎成约1mm

(2)加入Hanks液终止消化；离心，弃去上清液，得第一沉淀物，用Hanks液重悬第一沉淀物，用70μm的细胞滤网过滤，细胞计数，离心滤液，弃去上清液，得第二沉淀物，加入DMEM/F12培养基与第二沉淀物混合，再加基质胶进行重悬，所述基质胶与DMEM/F12培养基的体积比为3:1，接种，孵育2分钟后，再倒置8分钟使基质胶凝固；

(3)加入所述培养基于37℃培养8天，每3天更换一次所述培养基，得到所述甲状腺癌类器官。

实施例5：不同培养基的培养成功率

分别取不同患者的甲状腺癌组织，分别取实施例1、实施例2、对比例1-对比例5所述培养基，按照实施例3、对比例6的培养方法分别培养25例。各培养基及其培养方法的培养成功率如表2所示。

表2：不同培养基的培养成功率

实施例6：类器官的传代

一、类器官的传代

试剂：

第二消化液：含10μM的Y-27632的胰酶替代物溶液。

培养基：实施例1、实施例2、对比例1-对比例5中任一种(传代采用的培养基与培养类器官时所用培养基相同)。

操作：

取实施例3或对比例6所得甲状腺癌类器官，在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第四沉淀物，往第四沉淀物中加入第二消化液，在37℃、转速为120rpm的摇床消化5分钟；加含体积分数为20％的胎牛血清的Advanced DMEM/F12培养基以终止消化；在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第五沉淀物，用10mL冷的Advanced DMEM/F-12重悬第五沉淀物，使用10mL移液管进行吹打，将类器官吹打成较小的细胞团，在4℃，200g条件下离心5分钟，弃去上清液，得第六沉淀物，加入200μL预冷的DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀后，加入600μL的基质胶，接种，在接种后的基质胶凝固后，加入所述培养基8天，得到传代的甲状腺癌类器官，所述培养基每3天更换一次。

二、最少可传代次数统计

按以上操作对实施例3和对比例6所得类器官进行连续传代，每当30％的类器官扩增形成直径超过200μm大小的细胞团时就进行传代，记录最少可传代次数。统计结果如表3所示。

表3：最少可传代次数统计表

本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。