一种肠道菌群的收集方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种肠道菌群的收集方法及其应用，属于医学领域。

背景技术

肠道菌群是人体肠道的正常微生物，其构成主要为细菌、古细菌、真菌、病毒等。肠道细菌的总数达100万亿，是人体细胞总数的10倍，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应。

人体可以被认为是“行走的微生物体”。肠道菌群紊乱与人体健康异常间的因果联系被广泛证明，并且特定肠道菌群成员的丰度与各类疾病的相关关系也被发现。特定紊乱菌可能本身就是肠道功能的“破坏者”，肠道菌群组成与多样性平衡被打破后，会导致肠道微生态紊乱，继而造成肠道菌群代谢活动和免疫应答偏移，可能会引起机体发生严重的生理或病理后果，因此，取样检测分析肠道微生物的变化对人体的健康具有重要的意义。

粪便通常用于非侵入性的肠道取样，以评估肠道微生物群。但是，粪便样本是自采样的，参与者的复杂性、采样位置或采样时间的不确定性均会导致较大的误差。目前，肠道粘膜微生物的提取是通过活检钳收集肠道粘膜来完成的，这种取样方法具有的一定的侵袭性，对参与者的身体具有损伤。

结肠镜是一种临床常用的纤维内窥镜。通过肛门插入逆行向下可检查到直肠、乙状结肠、降结肠、横结肠、升结肠和盲肠以及与大肠相连的一小段小肠(回盲末端)。可以清楚地发现肠道病变，同时还可对部分肠道病变进行治疗，如：大肠息肉等良性病变镜下直接摘除，对肠道出血进行镜下止血，对大肠内异物进行清除。在进行结肠镜检查的过程中，医师往往需要利用医用纯净水对肠道进行灌洗，以洗掉肠道准备后依然留在肠道内的、会干扰检查的物质。灌洗液通常作为医疗废弃物进行处理。

发明内容

[技术问题]

现有的用于对肠道微生物取样的方法存在一定缺陷，其中，粪便采样误差大、分析结果不稳定可靠，活检钳取样则因具有侵袭性对人体有伤害。

[技术方案]

本发明提供一种非介入性的肠道菌群的收集方法，包括以下步骤：

(1)等待收集肠道菌群的对象排空肠道，做肠道准备；

(2)内镜医师通过内窥镜影像系统，利用医用纯净水灌洗结肠粘膜，并将灌洗液吸入一次性无菌负压引流袋；

(3)将负压引流袋中的灌洗液离心收集沉淀，沉淀即为收集得到的肠道菌群。

优选的，以波士顿肠准备量表(BBPS)测量肠道准备质量评价。波士顿肠准备量表得分≥6分的粘膜灌洗液样本为合格可用样本。

优选的，将负压引流袋中的灌洗液采用9000rpm离心10min收集沉淀，为肠道菌群样品(粘膜灌洗液样品)。

本发明提供一种非介入性的检测肠道菌群的方法，包括以下步骤：

(1)将肠道灌洗液离心、收集沉淀，沉淀是肠道菌群样本；

(2)提取肠道菌群样本的基因组，并对核糖体16S rRNA的V3-V4区片段进行扩增，将扩增得到的片段进行高通量测序，得到样本的细菌组成。

优选的，肠道灌洗液的波士顿肠准备量表得分≥6分。

本发明提供一种非介入性的分析肠道菌群的方法，包括以下步骤：

(1)将肠道灌洗液离心、收集沉淀，沉淀是肠道菌群样本；

(2)提取肠道菌群样本的基因组，并对核糖体16S rRNA的V3-V4区片段进行扩增，将扩增得到的片段进行高通量测序；

(3)将测序结果进行生物信息学分析。

优选的，所述生物信息学分析是不同样本的微生物群落多样性分析、不同样本的主成分分析、不同样本在细菌门分类水平上的组成差异分析。

优选的，微生物群落多样性分析结果用物种多样性指数和物种丰富度来表示。

[有益效果]

本发明的发明人在研究过程中发现，在进行结直肠镜检查时，粘膜灌洗液中也含有一定的肠道微生物。因而，由内镜医师在结肠镜检查时，使用医用纯净水灌洗结肠粘膜并收集灌洗液，灌洗液可以用于更加准确地检测分析肠道微生物丰度，分析结果能较好地反应疾病状态下肠道菌群的的变化情况。

本发明提供的肠道微生物收集方法还具有无创伤的优点。

附图说明

图1是实施例1中粪便样本与粘膜灌洗液样本的取样过程。

图2是实施例1中的粘膜灌洗液与粪便样品的V3-V4区片段电泳检测比较图，其中，最左侧一列的M表示Marker，CK表示灭菌水，Y1表示医用纯净水，1-91为粘膜灌洗液与粪便样品。

图3是实施例1的粘膜灌洗液与粪便样品的微生物分析比较图，(1)健康对照组的粪便样本和粘膜灌洗液样品，(2)息肉病例的粪便样本和粘膜灌洗液样品，(3)腺瘤病例的粪便样本和粘膜灌洗液样品，(4)健康对照组、腺瘤组的粪便样本，(5)健康对照组、腺瘤组的粘膜灌洗液样品。

图4是实施例1的粘膜灌洗液与粪便样品的微生物门分类水平的比较。

具体实施方式

实施例1

在2018年12月至2019年6月期间，基于筛选标准在无锡市江南大学附属医院招募名志愿者，志愿者年龄在18岁以上，并且没有接受过抗生素的治疗，一共收集符合标准的志愿者62名，其中，健康对照组22名，腺瘤组40名。

表1志愿者的基本信息和息肉特征

结直肠息肉经结直肠镜检查剂病理证实。健康对照组为：结直肠镜检查中未发现息肉，既往无结直肠息肉病史和无其他结直肠病变的患者。息肉病例被定义为：至少有一个增生性或炎性息肉，没有其他腺瘤息肉，或组织学未分类。腺瘤病例定义为：至少有一个管状腺瘤、绒毛状腺瘤、管状绒毛状腺瘤或无固定锯齿状腺瘤，且无其他增生性息肉或组织学未分类。

如图1展示的是粪便样本和粘膜灌洗液样本收集过程。其中，粪便样本由志愿者在肠道准备前，收集中段粪便样本，样本在-80℃冻存。收集好粪便样本后，志愿者服用3盒轻泻剂(每盒含有聚乙二醇59.0g，硫酸钠5.68g，碳酸氢钠1.68g，氯化钠1.46g，氯化钾0.74g)进行肠道准备。第二天，进行粘膜灌洗液样本的采集：内镜医师使用数字式电子内窥镜影像系统(日本潘太克斯EKP-150C)对志愿者进行结肠镜检查，在结肠镜检查过程中，内镜医师使用100mL医用纯净水灌洗结肠粘膜，并将灌洗液立即吸入一次性无菌负压引流袋。结肠镜检查结束后，收集无菌负压引流袋中的积液，将积液高速(9000r/min)离心后，收集沉淀即为粘膜灌洗液样本，将该样本在-80℃冻存。以波士顿肠准备量表(BBPS)测量肠准备质量评价，挑选出BBPS总分≥6分的粘膜灌洗液样本用于后续的微生物菌群分析。

对利用以上2种方式收集的样本进行基因组的提取，并对核糖体16S rRNA基因V3-V4区片段扩增，扩增后得到的片段进行琼脂糖电泳进行切胶纯化，使用Illumina MiSeq测序平台你以PE300模式进行测序。图2展示的是粘膜灌洗液与粪便样品的基因组中的16SrRNA V3-V4区片段PCR扩增电泳结果，粘膜灌洗液与粪便样品均在250bp附近有条带，说明粘膜灌洗液与粪便样品中均是含有细菌的。

将测序结果进行分析及比较。获取62名志愿者的粪便样本及粘膜灌洗液样本，测得菌群多样性测序结果，并进行生物信息学分析，每个样本的微生物群落多样性分析结果用物种多样性指数(Shannon指数)和物种丰富度(即物种数目，以操作分类单元，OUT数目)来进行表示。样本的Shannon指数曲线已经饱和，表明随着测序量增加也不会增加新的种属，微生物的多样性也不会变化，当前的测序量已经满足实验。在研究粘膜灌洗液菌群组成的实验中，通过MiSeq高通量测序，共产生1265446条高质量的16SrRNA的V4序列，平均每个样品10606条，左右序列根据参考序列聚类，按照97％序列相似性划分OUT，共产生123624个OUT。

通过生物信息学分析，计算不同样本之间的加权UniFrace距离，并做主成分分析，进行比较。如图3所示，基于加权UniFrac距离的PCoA所显示，粪便样本和粘膜灌洗液样本数据点在第一个轴(PC1)上很好地分离。在结直肠腺瘤病例中，粘膜灌洗液样本的差异略高于粪便样本。总的来说，来自同一志愿者的两种非侵入性采样类型显示了不同的微生物群，反映了粘膜灌洗液标本类型在疾病肠道微生物群中更普遍的优势。

通过生物信息学分析及比对，比较不同样本在细菌门分类水平上的组成差异。如图4所示，在所有志愿者中，肠道菌群中含量较多的细菌依次是以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)，变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)。梭杆菌门在结肠肠腺瘤患者肠道中富集，并且已有报道证明梭杆菌门在结直肠癌组织中的含量较高。与粪便样本相比较，粘膜灌洗液中的梭菌门的丰度有所增加；例如，腺瘤组中，其粪便样本中梭杆菌门的丰度仅为2.2％，而其粘膜灌洗液样本中梭杆菌门的丰度维持在11.7％，并且，腺瘤组的梭杆菌门的丰度高于健康对照组，健康对照组粘膜灌洗液中梭杆菌门的丰度为4.4％，健康对照组粪便中梭杆菌门的丰度为0.4％。

通过生物信息学分析及比对，在粪便样本和粘膜灌洗液中鉴定30个差异丰富的OTU，来自嗜血杆菌属、梭杆菌属、胃链球菌属、颗粒菌属和其他病原体或机会病原体的20个OTU在粘膜灌洗液中有所增加。并且与健康对照组相比，腺瘤组粘膜灌洗液样本与粪便样本的差异性更明显。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。