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一种同时扩增人34个STR基因座的引物组、试剂盒及其应用

文献发布时间：2023-06-19 11:08:20

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，尤其涉及一种同时扩增人34个STR基因座的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

STR(short tandem repeats，短串连重复序列)又称微卫星序列，是大量存在于人类基因组DNA中的短串连重复序列，重复单位为2～6个核苷酸。由于具有高度多态性和稳定性，并且与AMP-FLP和VNTR等分型方法相比，STR基因分型方法所扩增的产物长度小得多(小于500bp)，因此对于模板质量要求较低，即使降解的DNA模板也可以进行分析。此外，STR分型适用于多种DNA纯化方法所纯化的DNA，而这些纯化方法所获得的DNA量往往不够作Southern印迹分析。鉴于以上这些特点，STR分型技术已经广泛应用于法医身份识别鉴定。

法医DNA数据库是集成现代DNA检验技术、信息技术、网络技术和科学管理等要素。法医DNA数据库的核心在于所收录的STR数据信息，一个完善的法医DNA数据库应该包含常染色体STR数据库和Y染色体STR数据库。Y染色体STR数据为案件提供侦查线索，缩小侦查范围，可以预测罪犯可能存在的地区、种族甚至姓氏，常染色体STR数据用于最后罪犯个体的筛查及确认。

目前公布的20个常染色体STR核心基因座(20个基因座，包含Amelogenin、CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、vWA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、Penta D、Penta E)及10个常染色体STR优选基因座(10个基因座，包含D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435用于扩大筛查使用)，相对应的，DNA法医鉴定对试剂盒的基因座数量、特异性及试剂盒的灵敏度就有了更高的需求。目前常染色体STR扩增试剂盒主要用于案件侦破、亲缘关系鉴定过程，市面上充斥着各类试剂盒，虽然都包含了13个CODIS核心基因座，但是其他基因座各不相同。公安在使用过程中极不方便，要想使用更多的基因座进行犯罪嫌疑人的判定，通常需要多款试剂盒联合使用，也需要耗费更多的时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时扩增人34个STR基因座的引物组、试剂盒及其应用，本发明的引物组和试剂盒扩增的基因座数量多、特异性强、灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种同时扩增人34个STR基因座的引物组，所述34个STR基因座包括29个常染色体STR基因座、1个Y染色体STR基因座和4个性别鉴定基因座；所述29个常染色体STR基因座分别为：D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，D2S1338，D15S659，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，Penta E，D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，D12S391，D10S1248，D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA，D3S3045，D10S1435，D19S253，D6S477，D8S1132和Penta D；所述1个Y染色体STR基因座为：DYS391；所述4个性别鉴定基因座分别为：RS759551978，RS2032678，RS771783753和Amelogenin；

用于扩增RS759551978的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；用于扩增RS2032678的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；用于扩增D3S1358的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；用于扩增TH01的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；用于扩增D21S11的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；用于扩增D18S51的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；用于扩增D2S1338的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；用于扩增D15S659的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；用于扩增RS771783753的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；用于扩增Amelogenin的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；用于扩增D5S818的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；用于扩增D13S317的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；用于扩增D7S820的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；用于扩增D16S539的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示；用于扩增CSF1PO的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示；用于扩增Penta E的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示；用于扩增D6S1043的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示；用于扩增D22S1045的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示；用于扩增D19S433的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示；用于扩增D1S1656的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示；用于扩增DYS391的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示；用于扩增D12S391的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：44所示；用于扩增D10S1248的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：45所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：46所示；用于扩增D2S441的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：47所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示；用于扩增vWA的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：49所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：50所示；用于扩增D8S1179的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示；用于扩增TPOX的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：53所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示；用于扩增FGA的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：55所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：56所示；用于扩增D3S3045的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：57所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：58所示；用于扩增D10S1435的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：59所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示；用于扩增D19S253的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：61所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：62所示；用于扩增D6S477的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：63所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：64所示；用于扩增D8S1132的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：65所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：66所示；用于扩增Penta D的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：67所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：68所示。

优选的，所述34个STR基因座分为五组，其中，

第一组包括：RS759551978，RS2032678，D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，D2S1338和D15S659；第二组包括：RS771783753，Amelogenin，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO和Penta E；第三组包括：D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，DYS391，D12S391和D10S1248；第四组包括：D2S441，vWA，D8S1179，TPOX和FGA；第五组包括：D3S3045，D10S1435，D19S253，D6S477，D8S1132和PentaD；所述第一组到第五组STR基因座的上游引物和/或下游引物分别采用不同的荧光染料。

本发明还提供了一种包括上述方案所述引物组的试剂盒。

优选的，所述试剂盒还包括PCR反应预混液和去离子水。

优选的，所述试剂盒还包括分子量内标和等位基因阶梯。

优选的，所述引物组中，

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM；

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM；

SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物的浓度独立为0.08～0.13μM；

SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM；

SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物的浓度独立为0.2～0.25μM；

SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示引物的浓度独立为0.2～0.25μM；

SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示引物的浓度独立为0.35～0.45μM；

SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示引物的浓度独立为0.2～0.3μM；

SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示引物的浓度独立为0.08～0.13μM；

SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示引物的浓度独立为0.07～0.11μM；

SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示引物的浓度独立为0.07～0.11μM；

SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM；

SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示引物的浓度独立为0.4～0.5μM；

SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM；

SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM；

SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示引物的浓度独立为0.4～0.5μM；

SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM；

SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM；

SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM；

SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示引物的浓度独立为0.15～0.2μM；

SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示引物的浓度独立为0.2～0.3μM；

SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM；

SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM；

SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM；

SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM；

SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示引物的浓度独立为0.25～0.35μM；

SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54所示引物的浓度独立为0.4～0.5μM；

SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示引物的浓度独立为0.2～0.3μM；

SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58所示引物的浓度独立为0.08～0.13μM；

SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示引物的浓度独立为0.06～0.11μM；

SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM；

SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示引物的浓度独立为0.06～0.11μM；

SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM；

SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM。

优选的，所述PCR反应预混液以去离子水为溶剂，包括以下浓度的组分：0.19～0.38U/μl的热启动Taq DNA聚合酶、100～200mM的Tris缓冲液、100～200mM的KCL、3.75～7.5mM的MgCl

优选的，所述等位基因阶梯和所述STR基因座的对应关系为：

在第一组中：RS759551978对应1,2；RS2032678：1,2；D3S1358对应10,12,13,14,15,16,17,18,19,20；TH01对应5,6,8,9,9.3,10；D21S11对应26,27,28,28.2,29,29.2,30,31,31.2,32,32.2,33,33.2,34,34.2,35.2,36.2,38；D18S51对应8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,23,24,26,27；D2S1338对应16,17,18,20,21,23,24,25,26；D15S659对应10,12,13,14,15,16,17,18,19,20；

在第二组中：rs771783753对应1,2；Amelogenin对应X，Y；D5S818对应7,8,9,10,11,12,13,14,15；D13S317对应7,8,9,10,11,12,13,14；D7S820对应7,8,9,10,11,12,13,14,15；D16S539对应5,6,8,9,10,11,12,13；CSF1PO对应6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16；Penta E对应5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,19,20,21,22,23,24,26；

在第三组中：D6S1043对应9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21；D22S1045对应11,12,14,15,16,17,18,19；D19S433对应9,10,11,11.2,12,13,13.2,14,14.2,15,15.2,16,16.2,17,18.2；D1S1656对应10,11,12,13,14,15,16,17,18；DYS391对应6,7,8,9,10,11,12,13；D12S391对应15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27；D10S1248对应10,11,12,13,14,15,16,17,18；

在第四组中：D2S441对应8.1,9,10,11,12,13,14,15；vWA对应12,13,14,15,16,17,18,19,20,21；D8S1179对应7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18；TPOX对应5,6,7,8,9,10,11,12,13,14；FGA对应16,17,18,19,20,21,23,24,25,26,27,29,30,31.2,43.2,44.2,45.2,46.2；

在第五组中：D3S3045对应9,12,13,13.2,14,15；D10S1435对应7,8,9,10,11,12,13,14,15；D19S253对应7,9,11,12,13,14,15；D6S477对应11,14,15,16,18,19,20；D8S1132对应16,17,18,19,20,21,22,23,24,25；Penta D对应5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。

本发明还提供了上述方案所述的引物组或者所述试剂盒在法医个体识别、法医DNA数据库建设、嫌疑人家系排查或司法亲缘关系鉴定中的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：

将待检测样品放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行检测；

当所述待检测样品为原始人体样品时，所述PCR扩增的扩增体系以10μL计，包括：2μl所述引物组的混合物、4μlPCR反应预混液和4μl去离子水；

当所述待检样品为人基因组DNA时，所述PCR扩增的扩增体系以10μL计，包括：1μl人基因组DNA、2μl所述引物组的混合物、4μlPCR反应预混液和3μl去离子水；

所述PCR扩增的扩增程序为：95℃、5min；94℃、10sec，59℃、90sec，72℃、30sec，29个循环；60℃、30min。

本发明的有益效果：本发明提供了一种同时扩增人34个STR基因座的引物组，所述34个STR基因座包括29个常染色体STR基因座、1个Y染色体STR基因座和4个性别鉴定STR基因座。本发明扩增的34个STR基因座包含了公安部规定的20个核心基因座以及10个优选基因座，包含了目前市面上主流试剂盒的所有位点，同时还包含了5个性别鉴定基因座，可有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险。34个STR基因座联合起来，具有高个体识别力、高非父排除率的特征。本发明的引物组能够实现快速扩增，且扩增特异性强，无非特异性扩增，同时各条引物之间不互相产生干扰，不形成引物二聚体。引物长度皆在18bp～32bp之间，TM值在60℃左右，且每对引物均具有很高的特异性，所有34对引物之间均无相互作用，使得34个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在66～500bp之间。经过扩增反应，每个基因座均能得到特异性的1～2条扩增带，无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰。本发明的引物组还具有灵敏度高的优势，同时可适用于各种检材的常染色体STR扩增检测，可以满足当前法医身份鉴定、法医DNA数据库建设、司法亲缘关系鉴定的多功能STR身份鉴定需求。

附图说明

图1为阳性对照DNA9948基因分型图；

图2为等位基因阶梯分型图；

图3为分子量内标BTY-550图谱；

图4为疑似子基因分型图；

图5为疑似父基因分型图；

图6为血卡检材基因分型图；

图7为提取DNA检材基因分型图。

具体实施方式

本发明提供了一种同时扩增人34个STR基因座的引物组，所述34个STR基因座包括29个常染色体STR基因座、1个Y染色体STR基因座和4个性别鉴定STR基因座；所述29个常染色体STR基因座分别为：D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，D2S1338，D15S659，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，Penta E，D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，D12S391，D10S1248，D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA，D3S3045，D10S1435，D19S253，D6S477，D8S1132和Penta D；所述1个Y染色体STR基因座为：DYS391；所述4个性别鉴定STR基因座分别为：RS759551978，RS2032678，RS771783753和Amelogenin；

本发明检测的34个基因座包含：29个常染色体STR基因座，分别是：D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，D2S1338，D15S659，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，Penta E，D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，D12S391，D10S1248，D2S441，vWA，D8S1179，TPOX，FGA，D3S3045，D10S1435，D19S253，D6S477，D8S1132，Penta D；1个Y染色体STR基因座DYS391；4个性别鉴定基因座RS759551978，RS2032678，RS771783753和Amelogenin。本发明的引物组中包含34对引物，分别对应本发明中涉及的34个基因座。针对34个基因座，设计了34对引物，引物长度在18～30bp之间，TM值在60℃左右，且每对引物均具有很高的特异性，所有34对引物之间均无相互作用，使得34个基因座对应的引物可以兼容于一个单管中。总体扩增产物长度在66～500bp之间。经过扩增反应，每个基因座均能得到特异性的1～2条扩增带，无非特异性扩增峰及引物峰等其他杂峰。在本发明中，所述引物组中各对引物能在一个管中稳定兼容互不反应，且特异性、二级结构、扩增效率、稳定性等大大提高。本发明所述34个STR基因座包含了公安部规定的20个核心基因座，以及10个优选基因座，包含了目前市面上主流试剂盒的所有位点。同时还包含了5个性别鉴定基因座，可以有效的预防由于Y染色体缺失导致的性别鉴定错误的风险。34个基因座联合起来，具有高个体识别力、高非父排除率的特征。本发明引物组中的STR基因座与市面主流试剂盒位点对比参见表1。

表1本发明引物组中的STR基因座与市面主流试剂盒位点对比参见表1。

在本发明中，所述引物组的扩增均衡性全面超越《GB/T 37226-2018法庭科学人类荧光标记STR复合扩增检测试剂质量基本要求》中所述标准(基因座内≥70％、同一颜色组内≥50％、不同颜色组间≥30)。

在本发明中，所述34个STR基因座分为五组，其中，第一组包括：RS759551978，RS2032678，D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，D2S1338和D15S659；第二组包括：RS771783753，Amelogenin，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO和Penta E；第三组包括：D6S1043，D22S1045，D19S433，D1S1656，DYS391，D12S391和D10S1248；第四组包括：D2S441，vWA，D8S1179，TPOX和FGA；第五组包括：D3S3045，D10S1435，D19S253，D6S477，D8S1132和PentaD；所述第一组到第五组STR基因座的上游引物和/或下游引物分别采用不同的荧光染料。

在本发明中，所述第一组采用的荧光染料优选为FAM；所述第二组采用的荧光染料优选为HEX；所述第三组采用的荧光染料优选为TAMAR；所述第四组采用的荧光染料优选为ROX；所述第五组采用的荧光染料优选为PURPLE；ORG用于内标。本发明采用六色荧光标记系统，分别是FAM、HEX、TAMAR、ROX、PURPLE、ORG。其中FAM代表蓝色，HEX代表绿色，TAMAR代表黄色，ROX代表红色，PURPLE代表紫色，ORG代表橙色。本发明能够在一个反应中可以同时扩增34个STR基因座，充分满足了目前公安DNA数据库对比的兼容性。

在本发明中，每个所述STR基因座的上游引物和/或下游引物的5’端通过荧光染料进行标记。本发明应用荧光标记的方法在引物的5’端标记一个荧光染料，PCR产物在激光激发状态下，可以发射特定波长的光信号，通过遗传分析仪(ABI3130\ABI3500\ABI3730系列一传一)进行电泳检测可以收集到光信号，通过收集的光信号进行检测。

本发明还提供了一种包括上述方案所述引物组的试剂盒。

在本发明中，所述试剂盒优选的还包括PCR反应预混液和去离子水。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照DNA9948。在本发明中，引物组、PCR反应预混液和去离子水组成了试剂盒的反应体系。

在本发明中，所述引物组中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM，进一步优选为0.361μM；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM，进一步优选为0.166μM；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物的浓度独立为0.08～0.13μM，进一步优选为0.099μM；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM，进一步优选为0.130μM；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物的浓度独立为0.2～0.25μM，进一步优选为0.227μM；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示引物的浓度独立为0.2～0.25μM，进一步优选为0.224μM；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示引物的浓度独立为0.35～0.45μM，进一步优选为0.428μM；SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示引物的浓度独立为0.2～0.3μM，进一步优选为0.277μM；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示引物的浓度独立为0.08～0.13μM，进一步优选为0.110μM；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示引物的浓度独立为0.07～0.11μM，进一步优选为0.08μM；SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示引物的浓度独立为0.07～0.11μM，进一步优选为0.083μM；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM，进一步优选为0.121μM；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示引物的浓度独立为0.4～0.5μM，进一步优选为0.448μM；SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM，进一步优选为0.129μM；SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM，进一步优选为0.124μM；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示引物的浓度独立为0.4～0.5μM，进一步优选为0.449μM；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM，进一步优选为0.358μM；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM，进一步优选为0.149μM；SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM，进一步优选为0.332μM；SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示引物的浓度独立为0.15～0.2μM，进一步优选为0.174μM；SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示引物的浓度独立为0.2～0.3μM，进一步优选为0.224μM；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM，进一步优选为0.361μM；SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示引物的浓度独立为0.3～0.4μM，进一步优选为0.333μM；SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM，进一步优选为0.150μM；SEQ ID NO：49和SEQ IDNO：50所示引物的浓度独立为0.12～0.18μM，进一步优选为0.159μM；SEQ ID NO：51和SEQID NO：52所示引物的浓度独立为0.25～0.35μM，进一步优选为0.284μM；SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54所示引物的浓度独立为0.4～0.5μM，进一步优选为0.421μM；SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示引物的浓度独立为0.2～0.3μM，进一步优选为0.240μM；SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：58所示引物的浓度独立为0.08～0.13μM，进一步优选为0.090μM；SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示引物的浓度独立为0.06～0.11μM，进一步优选为0.085μM；SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM，进一步优选为0.123μM；SEQ IDNO：63和SEQ ID NO：64所示引物的浓度独立为0.06～0.11μM，进一步优选为0.078μM；SEQID NO：65和SEQ ID NO：66所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM，进一步优选为0.111μM；SEQID NO：67和SEQ ID NO：68所示引物的浓度独立为0.1～0.15μM，进一步优选为0.126μM。

在本发明中，所述PCR反应预混液中优选的包括热启动DNA聚合酶、dNTP、镁离子、钾离子、Tris缓冲液及增强剂；所述PCR反应预混液以去离子水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分：0.19～0.38U/μl的热启动Taq DNA聚合酶、100～200mM的Tris缓冲液、100～200mM的KCL、3.75～7.5mM的MgCl

表2本发明实施例的PCR反应预混液配方

表2中的H

在本发明中，所述PCR反应预混液具有快速、灵敏度高、适应性强等特点，并且PCR反应预混液可以在-20℃条件下不结冰，可以有效的防止冻融对试剂性能的影响。本发明的PCR反应预混液灵敏度高达0.03ngDNA，有效扩增时间降低到1.5h以内，并且对不同来源(血液、血痕、精液、精斑、唾液、唾液斑、毛发、组织、指甲、体液等)的DNA均具有优良的扩增效果，同时对特种血卡、唾液卡、FTA卡也有非常好的扩增效果。

在本发明中，所述阳性对照DNA9948作为扩增标准品，用来检验扩增体系质量好坏。在本发明优选方案中，阳性对照均可以得到正确分型，灵敏度高达0.03ng，远低于标准的0.125ng。本发明扩增的9948分形图见图1和表3。

表3 9948的基因分型

在本发明中，所述试剂盒优选的还包括分子量内标和等位基因阶梯。在本发明中，所述分子量内标和等位基因阶梯为所述试剂盒的检测试剂。在本发明中，所述等位基因阶梯和所述Y染色体STR基因座的对应关系具体参见表4。

表4等位基因阶梯和所述Y染色体STR基因座的对应关系

本发明的等位基因阶梯34A囊括了各个基因座绝常见的所有等位基因及绝大多数的稀有等位基因，更加方便基因分型结果的比对。

在本发明中，所述分子量内标为BTY-550；所述BTY-550包含的DNA片段有：65、75、100、139、150、160、200、250、300、340、400、450、490、500、540和550。在本发明中，所述分子量内标标记有荧光染料ORG，代表橙色。本发明的分子量内标能够有效的区分65～550bp的DNA片段的大小。

本发明具体实施过程中，所述试剂盒共包括两部分，第一部分为反应体系，包含引物组、反应预混液、阳性对照DNA9948、去离子水；第二部分为检测试剂，包括分子量内标和等位基因阶梯。

本发明还提供了上述方案所述的引物组和所述的试剂盒在法医个体识别、法医DNA数据库建设、嫌疑人家系排查或司法亲缘关系鉴定中的应用。

在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：

将待检测样品放入含有上述方案所述引物组的扩增体系中，进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进行检测；

当所述待检测样品为原始人体样品时，所述PCR扩增的扩增体系以10μL计，包括：2μl所述引物组的混合物、4μlPCR反应预混液和4μl去离子水；

当所述待检样品为人基因组DNA时，所述PCR扩增的扩增体系以10μL计，包括：1μl人基因组DNA、2μl所述引物组的混合物、4μlPCR反应预混液和3μl去离子水；

所述PCR扩增的扩增程序为：95℃、5min；94℃、10sec，59℃、90sec，72℃、30sec，29个循环；60℃、30min。

在本发明中，所述待检测样品优选的包括人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、唾液斑、毛发、组织、指甲或体液。

在本发明中，所述PCR扩增的标准扩增体系以25μl计，包括5μl引物组的混合物、10μl PCR反应预混液、7.5μl去离子水和2.5μl阳性对照DNA9948。所述标准扩增体系的扩增程序如表5所示。

表5标准扩增体系的扩增程序

本发明对所述扩增产物进行检测的方法优选的包括：对所述扩增产物进行电泳检测；所述电泳检测的设备优选为ABI 3500XL；本发明具体实施过程中，将HiDi甲酰胺、分子量内标BTY-500、PCR扩增产物或等位基因阶梯34A混合，得到混合物；以HiDi甲酰胺的体积为8.5μl计，分子量内标BTY-5000.5μl、PCR扩增产物或等位基因阶梯34A 1μl；将所述混合物分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8kVolts，进样时间12sec，之后开始电泳。

本发明在所述电泳后，优选的还包括在GeneMapper_IDX软件上分析电泳结果。阳性对照9948分型图见图1，等位基因阶梯图见图2；分子量内标BTY-550见图3。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

对来自疑似父子的两份头发进行直接复合扩增，检测34个基因座。扩增方法采用直接扩增的方法:取一段带有毛囊的头发，直接放入扩增体系中，使毛囊完全浸入液体以内，扩增程序采用本发明标准扩增程序，扩增仪器采用ABI Proflex PCR仪，遗传分析仪采用3500xl遗传分析仪，分析软件采用GeneMapper-ID-X分析软件。本实施例操作步骤如下：

①用剪刀在头发毛囊上方0.5cm处剪短，将剪短的带有毛囊的头发放入200μlPCR管中。

②根据本发明的标准反应体系配制10μl扩增体系：2μl引物混合物、4μl反应预混液、4μl去离子水，加入带有剪好头发的PCR管中。在ABI Proflex PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为：95℃、5min；94℃、10sec，59℃、90sec，72℃、30sec，29个循环；60℃、30min；15℃恒温保存。

③遗传分析仪检测并进行数据分析

PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500XL进行检测。8.5μl HiDi甲酰胺+0.5μl分子量内标BTY-500+1μl PCR产物/1μl等位基因阶梯34A；分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8kVolts，进样时间12sec，之后开始电泳。

④电泳结束后在GeneMapper_IDX软件上进行分析，见图4：疑似子基因分形图；图5：疑似父基因分型图；疑似父、子基因分型结果见表6。

表6：疑似父子基因分型

利用本发明对获得的34个基因座的基因分型进行分析比对，可以发现疑似父子的34个基因座基因信息均符合遗传规律，可以判定为父子关系。

实施例2：本发明试剂盒在法医当中的应用

本发明在法医领域主要用于违法犯罪人员DNA数据库的建设及对违法犯罪嫌疑人身份的鉴定。全国法医DNA数据库是我国公安部建设的全国违法犯罪人员DNA数据库，如今数据库突破5000万数据，是公安系统案件侦破的主要工具。数据库通常采用血样直接扩增检测的方法建库，违法犯罪嫌疑人身份的鉴定工作中检材通常为复杂检材，采用提取DNA后进行扩增检测方法进行检测。本发明可以兼顾两种不同的检材，方便全国DNA数据库的建设及对违法犯罪嫌疑人身份的鉴定。操作的详细部分如下：

①已知违法犯罪人员检材通常为血卡，可以直接扩增。使用直径1mm的打孔器，直接在干燥血卡上打取直径1mm血片，放入200μlPCR管中。

②未知违法犯罪人员通常为案件现场检材，检材复杂，通常采用先提取DNA，后扩增的方法进行数据的检测分析。DNA通过Chelex-100和磁珠法进行DNA的提取。(提取方法参照郑秀芬《法医DNA分析》第四章DNA提取)。

③反应体系的配制及扩增，参照本发明标准体系配制10μl反应体系，见下表7。在ABI Proflex PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为：95℃、5min；94℃、10sec，59℃、90sec，72℃、30sec，29个循环；60℃、30min；10℃恒温保存。

表7：本实施例的反应体系

④遗传分析仪检测并进行数据分析

PCR扩增结束后，将扩增产物在ABI 3500xl上进行检测。8.5μl HiDi甲酰胺+0.5μl分子量内标BTY-500+1μl PCR产物/1μl等位基因阶梯44Y；分装进96孔板后，离心，去掉气泡，将96孔板放进上样托盘，然后放进3500xl遗传分析仪，进样电压为1.8kVolts，进样时间12sec，之后开始电泳。电泳结束后在GeneMapper_IDX软件上进行分析，分析完成后将分析的数据导出CODIS格式文件，然后将导出的数据上传全国DNA数据库。图6为血卡检材分型图，图7为DNA提取检材分型图。本发明对直扩样本及提取DNA样本进行检测，所得结果正确无误，图形均衡性好，完全可以满足法医的日常应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 百特元生物科技（北京）有限公司

<120> 一种同时扩增人34个STR基因座的引物组、试剂盒及其应用

<160> 68

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA