一种2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

神经氨酸酶是分布于流感病毒被膜上的一种糖蛋白，可以协助成熟的流感病毒脱离原来的宿主细胞去感染新的细胞，因此神经氨酸酶是抗流感病毒药物研发的重要靶点之一。

目前，美国FDA批准的抗流感病毒的药物仅6个，2个M2质子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚烷乙胺)、3个神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦)和1个RNA依赖RNA聚合酶抑制剂(索夫鲁扎)。以神经氨酸酶为靶点开发的抗流感药物可根据结构分为以下几类：环己烯类、吡喃类、吡咯烷类、苯甲酸衍生物类以及天然产物类等。目前使用最广的抗流感药物是达菲，但是随着药物的广泛使用，流感病毒对达菲的耐药性也随之出现，而且达菲的生产原料极其昂贵，合成工艺复杂。

因此，开发出一款结构新型并具有更好抑制效果神经氨酸酶的抑制剂迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用，该抑制剂结构新颖，实验表明具有良好的神经氨酸酶抑制活性，可用于制备抑制神经氨酸酶活性的药物。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂，所述抑制剂具有式(I)所示的结构：

其中，Ar选自如下结构式中的任意一种：

优选地，Ar选自如下结构式中的任意一种：

进一步优选，所述抑制剂具有如下结构：

一种如上所述的2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，所述制备方法的方程式如下所示：

所述制备方法具体包括以下步骤：

(1)将乙酰乙酸甲酯，升华硫和氰基乙酸乙酯形成反应体系，反应后经后处理得到式(II)中间体；

(2)取步骤(1)得到的式(II)中间体溶于有机溶剂中和氯乙酰氯形成反应体系，反应后得到式(III)中间体；

(3)取步骤(2)得到的式(III)中间体和取代芳香酚溶于有机溶剂中形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的2-氨基噻吩类抑制剂；

步骤(1)中，采用二乙胺作为催化剂，所述有机溶剂采用无水乙醇。

步骤(1)中，所述反应体系置于温度为25-80℃，优选为25℃，反应的时间为14-48h，优选为26h。

步骤(1)中，后处理的过程具体为：将反应体系进行过滤操作，用50％的乙醇水溶液洗涤滤饼，再将滤饼进行常温干燥得到式(II)中间体。

步骤(1)中，所述乙酰乙酸甲酯、升华硫、氰基乙酸乙酯、二乙胺和有机溶剂的添加量比为(90-120)mmoL:(90-120)mmoL:(90-120)mmoL:(5-10)mL：(10-40)mL，优选为100mmoL:100mmoL:100mmoL:8mL：20mL。

步骤(2)中，采用三乙胺作为傅酸剂，所述有机溶剂采用干燥的二氯甲烷。

步骤(2)中，所述反应体系置于温度为0-35℃，优选为25℃，反应的时间为4.5-18h，优选为15h。

步骤(2)中，所述式(II)中间体、三乙胺和氯乙酰氯的添加量比为(20-30)mmoL:(21-31.5)mmoL：(21-31.5)mmoL，优选为20mmoL:21mmoL：21mmoL。

步骤(3)中，所述有机溶剂采用丙酮、乙腈、甲苯、四氢呋喃和DMF，优选为DMF。

步骤(3)中，所述反应体系置于油浴中进行加热，反应的温度为55-95℃，优选为85℃，反应的时间为6.5-11.5h，优选为9.5h。

步骤(3)中，后处理的过程具体为：取出反应体系进行冷却、将反应液倒入饱和食盐水中，加入乙酸乙酯萃取多次，有机相用无水硫酸钠进行干燥，再用活性炭对有机相进行脱色处理。柱层析得到式(I)所示的抑制剂。

步骤(3)中，所述式(III)中间体、芳香酚、无水碳酸钾、碘化钾和有机溶剂的添加量比为5mmoL:(5-5.5)mmoL:(5-15)mmoL：(0.01-1)mmoL：(10-20)mL，优选为5mmoL:5.1mmoL:10mmoL：0.05mmoL：15mL。

一种如上述所述的含有2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂在制备能够抑制神经氨酸酶活性的药物中的应用。

本发明利用基于受体的分子对接虚拟筛选方法，从ZINC数据库中筛选了190000个化合物，得到了理论上具有神经氨酸酶抑制活性的一个化合物，继而对其结构进行改造，设计出了更为合理的化合物，并对其中十个化合物进行了神经氨酸酶测试，以Oseltamivircarboxlate(OSC)作为阳性对照，其中OSC的IC

本发明所合成的如下四个化合物的IC

其中，抑制效果最好的化合物

与现有技术相比，本发明提供一种具有新骨架结构的神经氨酸酶抑制剂及其制备方法和应用，合成方法简单，制得的抑制剂神经氨酸酶抑制活性好，具有优异的神经氨酸酶抑制效果，可应用于制备抑制神经氨酸酶活性的药物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。

一种2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂，所述抑制剂具有式(I)所示的结构：

其中，Ar选自

上述的2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，制备方法的方程式如下所示：

所述制备方法具体包括以下步骤：

(1)将乙酰乙酸甲酯，升华硫和氰基乙酸乙酯形成反应体系，反应后经后处理得到式(II)中间体；

(2)取步骤(1)得到的式(II)中间体溶于有机溶剂中和氯乙酰氯形成反应体系，反应后得到式(III)中间体；

(3)取步骤(2)得到的式(III)中间体和取代芳香酚溶于有机溶剂中形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的2-氨基噻吩类抑制剂；

步骤(1)中，采用二乙胺作为催化剂，所述有机溶剂采用无水乙醇，所述反应体系置于温度为25-80℃，优选为25℃，反应的时间为14-48h，优选为26h，后处理的过程具体为：将反应体系进行过滤操作，用50％的乙醇水溶液洗涤滤饼，再将滤饼进行常温干燥得到式(II)中间体，所述所述乙酰乙酸甲酯、升华硫、氰基乙酸乙酯、二乙胺和有机溶剂的添加量比为(90-120)mmoL:(90-120)mmoL:(90-120)mmoL:(5-10)mL，(10-40)mL，优选为100mmoL:100mmoL:100mmoL:8mL：20mL。

步骤(2)中，所述反应体系置于温度为0-35℃，优选为25℃，反应的时间为4.5-18h，优选为15h。所述式(II)中间体、三乙胺和氯乙酰氯的添加量比为(20-30)mmoL:(21-31.5)mmoL：(21-31.5)mmoL，优选为20mmoL:21mmoL：21mmoL。

步骤(3)中，所述有机溶剂采用丙酮、乙腈、甲苯、四氢呋喃和DMF，优选为DMF。所述反应体系置于油浴中进行加热，反应的温度为55-95℃，优选为85℃，反应的时间为6.5-11.5h，优选为9.5h。后处理的过程具体为：取出反应体系进行冷却、将反应液倒入饱和食盐水中，加入乙酸乙酯萃取多次，有机相用无水硫酸钠进行干燥，再用活性炭对有机相进行脱色处理。柱层析得到式(I)所示的抑制剂。所述式(III)中间体、芳香酚、无水碳酸钾、碘化钾和有机溶剂的添加量比为5mmoL:(5-5.5)mmoL:(5-15)mmoL：(0.01-1)mmoL：(10-20)mL，优选为5mmoL:5.1mmoL:10mmoL：0.05mmoL：15mL。

对制备得到的抑制剂进行抑制神经氨酸酶活性测试，具体测试方法如下：

1.实验仪器和材料

多功能荧光酶标仪，SP-Max 3500FL型，上海闪谱生物科技有限公司；

超净工作台；

Bond A3Pipette手动单道可调试移液器，0.5-10ul，10-100ul，100-1000ul泰坦科技；

96孔板(黑色)，灭菌，康宁；

H5N1神经氨酸酶，购自北京义翘神州科技股份有限公司；酶抑制实验中使用的荧光底物2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-乙酰神经氨酸钠水合物(4-MUNANA)(Sigma，M8639)，购自Sigma公司；2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、氯化钙、氢氧化钠、无水乙醇，购自泰坦科技。

阳性对照药，奥司他韦酸(Oseltamivir carboxlate，简写为OSC)，上海贺康生物技术有限公司。

2.实验方法

将阳性对照药及实施例制备的目标化合物用DMSO溶解，初始浓度配制成1000μm/l，将其按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为500μm/l、250μm/l、125μm/l、62.5μm/l、31.25μm/l、15.625μm/l，每个浓度梯度依次配制三组；

2.1样品检测准备

a.缓冲液(33mM MES，4mM CaCl

b.神经氨酸酶每孔加入10μL；

c.每孔加入10μL配好浓度的待测神经氨酸酶抑制剂样品或阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照；

d.神经氨酸酶底物(100μM·L

2.2检测

a.将96孔板置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；

b.温度设置为37摄氏度，孵育5分钟，使神经氨酸酶与待测样品充分混匀、相互作用；

c.取出96孔板，每孔再加入神经氨酸酶荧光底物10μL；

d.再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；

e.于37摄氏度下孵育30分钟，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L

f.重复上述操作步骤，做3组平行实验。

注：96孔板中的第一个孔作为空白组，不加待测样品，加入10微升DMSO溶液。

算出每次平行实验中每个梯度浓度下的样品的抑制率的平均值，再通过Origin拟合出相应IC

将阳性对照药及目标化合物用DMSO溶液均配制成初始浓度1000μm/L的混合溶液，再将这两种混合溶液按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为500μm/l、250μm/l、125μm/l、62.5μm/l、31.25μm/l、/15.625μm/l，每个浓度梯度依次配制三组。在96孔黑色荧光酶标板中加入神经氨酸酶缓冲液70μL，神经氨酸酶10μL，以及待测的每个梯度浓度的阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照。在多功能荧光酶标仪中震荡1分钟混匀，37℃孵育5min；取出96孔酶标板，每孔加入10μL的神经氨酸酶底物，震荡1分钟混匀，在37℃孵育30min后，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L

以下为具体示例：

实施例1

4-乙基-2-甲基-5-(2-(5-溴-2-甲基苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如式I所示：

具体合成步骤如下：

(1)用量筒准确量取10.78mL(100mmoL)乙酰乙酸甲酯、10.65mL(100mmoL)氰基乙酸乙酯，倒入50ml圆底烧瓶中，再准确称量升华硫3.21g(100mmoL)加入圆底烧瓶，倒入20mL无水乙醇，搅拌。再用恒压滴液漏斗滴加8mL的二乙胺。滴加完毕后取走恒压地液漏斗，置于室温25℃下搅拌反应26小时，反应结束后，体系溶液产生大量固体。将固体过滤得到滤饼，滤饼用50％乙醇水溶液洗涤多遍，之后在常温干燥，得到式(II)中间体。

(2)准确称量式(II)中间体4.58g(20mmoL)于50mL圆底烧瓶中，加入干燥的二氯甲烷25mL，用5mL一次性注射器吸取2.92mL(21mmoL)三乙胺加入体系中，再准确用2mL一次性注射器吸取1.58mL(21mmoL)氯乙酰氯缓慢滴加至体系中，25℃下反应15小时。反应完毕后，将反应液倒入100mL冷水中，加入3x15mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，依次用1moL

(3)取式(IV)中间体1.60g(5mmoL)、5-溴-2-甲氧基苯酚1.03g(5.1mmoL)、无水碳酸钾1.38g(10mmoL)、碘化钾0.008g(0.05mmoL)于25mL圆底烧瓶中，加入15mL DMF，置于油浴中在85℃下加热搅拌9.5小时，取出将反应液冷却，倒入50mL饱和食盐水，再加入3x30mL乙酸乙酯萃取，有机相再用3x50mL饱和食盐水洗涤，收集有机相。用无水硫酸钠干燥，活性炭脱色处理，柱层析得式(I)所示的抑制剂。

实验结果

4-乙基-2-甲基-5-(2-(5-溴-2-甲基苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，为淡黄色固体，产率93％，其IC

实施例2

4-乙基-2-甲基-5-(2-(喹啉-6-酰氧基)-乙酰氨基)-噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率94％，IC

实施例3

4-乙基-2-甲基-5-(2-(4-甲酰基苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率86％，IC

实施例4

4-乙基-2-甲基-5-(2-(4-乙酰氨基苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

淡黄色固体，产率95％，IC

实施例5

4-乙基-2-甲基-5-(2-(吡啶-2-基氧基)乙酰氨基)-噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率89％，IC

实施例6

4-乙基-2-甲基-5-(4-(甲酰基-3-甲氧基苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率85％，IC

实施例7

4-乙基-2-甲基-5-(2-(喹啉-3-基氧基)乙酰氨基)-噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率92％，IC

实施例8

4-乙基-2-甲基-5-(2-(3-乙酰苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率73％，IC

实施例9

4-乙基-2-甲基-5-(2-(3-甲酰基苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率69％，IC

实施例10

4-乙基-2-甲基-5-((2-(2-乙氧基-4-甲酰基苯氧基)乙酰氨基)-3-甲基噻吩-2,4-二羧酸酯，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

白色固体，产率78％，IC

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。