一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用

文献发布时间：2023-06-19 11:22:42

技术领域

本发明涉及基因和蛋白工程领域，特别是涉及一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用。

背景技术

利用基因工程和蛋白质工程技术在表达宿主体内制备和获取重组蛋白是目前应用十分广泛的技术。目前商业化的重组蛋白表达质粒，一般都需要添加诱导剂才能高效诱导蛋白表达，比如IPTG、阿拉伯糖等，这些诱导剂相对比较昂贵，尤其是在制备工业级数量的重组蛋白时，成本较高。虽然目前已有一些无需添加诱导剂的自诱导方法被报道，但一般这些自诱导方法需要使用专门的自诱导培养基(添加额外化合物)，配制起来仍显繁琐。此外，如果需要制备某种金属作为辅基的重组蛋白时，诱导时需要往培养基中添加相应的金属溶液。

细菌等微生物在进化过程中衍生出一套能够对抗环境中高浓度重金属毒性作用的自我保护机制。以铜离子为例，大肠杆菌(E.coli)体内存在一套铜耐受cop操纵子。当E.coli处在高浓度铜离子环境中时，cop系统被激活，其中的CopA和CueO蛋白被大量诱导表达，CopA的作用是将细胞质内的铜离子向周质泵出，CueO的作用是在周质内将Cu

目前没有利用微生物的重金属耐受机制及原理进行重组蛋白诱导表达的相关报道。而为了降低重组蛋白制备成本，且同时实现除污减排，利用细菌重金属耐受机制的优势发明一种新的重组蛋白诱导方法，将对改进现有技术产生相当重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用，只需要添加铜离子溶液或工业含铜废水，不需要使用其他诱导剂，即可高效诱导重组蛋白表达。该方法具有成本低廉、绿色环保的特点，具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

第一方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体中包括加入优化的MCS序列的copA启动子序列，所述加入优化的MCS序列的copA启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，提供了一种包含所述的表达载体的宿主大肠杆菌，其特征在于，所述的宿主大肠杆菌中copA和cueO基因被双敲除。

第三方面，提供了一种铜离子诱导的重组蛋白表达体系，所述的表达体系包括所述的宿主大肠杆菌和所述的表达载体。

第四方面，提供了一种铜离子诱导重组蛋白表达的方法，所述方法步骤包括：

1)将目的蛋白的编码序列克隆到所述的表达载体中；

2)得到的表达载体转化入所述的宿主大肠杆菌中过夜生长；

3)过夜生长的菌株加入培养基中培养至对数生长期；

4)再向菌株培养基中添加含铜离子液体进行诱导。

优选的，步骤3)中，所述的菌株培养基为新鲜的LB培养基或2×LB培养基。

优选的，步骤3)中过夜生长的菌株加入培养基中时，使起始菌夜OD

优选的，步骤4)中所述的含铜离子液体的浓度为2-2000μmol/L。

优选的，步骤4)中所述的含铜离子液体为含铜工业废水。

优选的，步骤4)中所述的诱导条件为16℃诱导24h。

优选的，所述的目的蛋白为Pfu蛋白或CueO蛋白。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过将大肠杆菌copA基因的启动子序列和优化的MCS(multiple cloningsite，多克隆位点)序列进行融合，并将融合片段克隆到pUC57K载体，构建得到铜离子诱导重组蛋白表达通用型载体PcopA-pUC57K。表达目的蛋白只需根据目的蛋白融合N端或C端组氨酸标签选择合适的MCS位点，将目的蛋白的编码序列克隆到PcopA-pUC57K，得到PcopA-M-pUC57K(M为任一目的蛋白编码基因)，并将此载体转化入ΔcopAΔcueO菌株。通过往菌株培养基中添加一定浓度的铜离子溶液或者含铜工业废水，即可诱导表达得到高产量、高活性的目的蛋白。本发明公开的该重组蛋白诱导表达方法具备简便、廉价的特点，并且可以实现除污减排、回收利用资源的目的，在蛋白工业化制备领域将具有广泛的推广价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明铜离子诱导重组蛋白表达通用型载体PcopA-pUC57K的质粒图谱；

图2为本发明铜离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的全细胞SDS-PAGE电泳分析结果；

图3为本发明铜离子诱导Pfu蛋白表达的蛋白产量结果；

图4为本发明铜离子诱导Pfu表达并纯化得到的Pfu蛋白SDS-PAGE电泳纯度分析结果；

图5为本发明铜离子诱导Pfu表达并纯化得到的Pfu蛋白的DNA聚合酶活性分析结果；

图6为本发明铜离子诱导Pfu表达对其他金属抗干扰实验的SDS-PAGE电泳分析结果；

图7为本发明铜离子诱导Pfu表达对其他金属抗干扰实验的蛋白产量结果；

图8为本发明铜离子诱导Pfu表达对其他金属抗干扰实验的DNA聚合酶活性分析结果；

图9为本发明铜离子诱导铜结合漆酶CueO蛋白表达的全细胞SDS-PAGE电泳分析结果；

图10为本发明铜离子诱导CueO蛋白表达的蛋白产量结果；

图11为本发明铜离子诱导CueO蛋白表达并纯化得到的CueO蛋白SDS-PAGE电泳纯度分析结果；

图12为本发明铜离子诱导CueO蛋白表达并纯化得到的CueO蛋白的铜结合含量结果；

图13为本发明铜离子诱导CueO蛋白表达并纯化得到的CueO蛋白的漆酶活性结果；

图14为本发明含铜工业废水诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的全细胞SDS-PAGE电泳分析结果；

图15为本发明含铜工业废水诱导Pfu蛋白表达并纯化得到的Pfu蛋白的DNA聚合酶活性分析结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

实施例1

1.敲除大肠杆菌copA和cueO基因，构建对铜离子敏感的ΔcopAΔcueO菌株

1.1敲除引物以及鉴定引物的设计

针对copA基因敲除，分别设计两对引物，其中一对引物是两端含有copA基因两翼50bp同源序列的敲除引物copA-Knockout-P1和copA-Knockout-P2，以及copA基因上下游分别为800bp位置处的序列作为外侧的一对鉴定引物copA-Check-P1和copA-Check-P2，序列信息如下：

copA-Knockout-P1(SEQ ID NO.2)：TGTCACAAACTATCGACCTGACCCTGGACGGCCTGTCCTGCGGTCACTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG；

copA-Knockout-P2(SEQ ID NO.3)：TTATTCCTTCGGTTTAAACCGCAGCAACCGGTTGGCGTTACTCACTACGGCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCT；

copA-Check-P1(SEQ ID NO.4)：CTCGCGATGGACGAGCGG；

copA-Check-P2(SEQ ID NO.5)：GAACAAATTACACAAACATACTAAGTCATACAAGAACG；

针对cueO基因敲除，敲除引物和鉴定引物序列如下：

cueO-Knockout-P1(SEQ ID NO.6)：ATGCTCAACGTTTGATTTTGTTTCGCCTGCTTAAGAATAAGGAAATAACTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC；

cueO-Knockout-P2(SEQ ID NO.7)：ATCAGTTTAATGCCCGGAGAGATCCGGGCATATTTCCGAATACGGTCTTTCATATGAATATCCTCCTTA；

cueO-Check-P1(SEQ ID NO.8)：AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCAAGCAGGCTTAAGGAATCG

cueO-Check-P1(SEQ ID NO.9)：CGCACGCATGTCGACCCCGATGCCGGTTCC；

1.2大肠杆菌copA基因的敲除

1)PCR扩增带FRT位点的氯霉素抗性基因

PCR体系为150μL反应体系，具体包括：ddH

PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃40s；55℃40s；72℃2min；循环35次；72℃10min。

取2-3μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。在1200bp附近有一条明亮条带扩增出来，则说明氯霉素抗性基因打靶片段扩增成功，剩余的所有扩增产物用宝生物DNA胶回收试剂盒进行跑胶回收纯化，加入20μL的无菌去离子水洗脱回收的DNA，再次取1-2μL电泳鉴定，确保条带大小正确，纯度较高，并储存备用。

2)pKD46质粒转化入野生型MC4100菌株，获得pKD46/MC4100菌株。

3)大肠杆菌pKD46/MC4100具备重组能力的电转化感受态细胞制备。

(1)将-80℃冻存的pKD46/MC4100接种于5mL含有氨苄霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。

(2)将过夜长浓的细菌以1:100的比例稀释加入到含有50ml Amp+/LB液体培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养至OD

(3)将菌液转移至冰上预冷的灭菌的50mL塑料离心管中，冰上放置30min。

(4)4℃，4000rpm离心15min，去上清，用30mL预冷的10％无菌甘油重悬菌体。

(5)4℃，4000rpm离心15min，去上清。

(6)重复步骤5一次。

(7)用400mL 10％甘油重悬菌体，小心混匀后每管40μL分装，放-80℃冻存或直接用来转化。

4)打靶PCR扩增DNA片段的电转化

(1)取40μL pKD46/MC4100感受态细胞，加入纯化的打靶DNA片段若干微升，确保至少有3-4μg的DNA量，轻轻混匀后转入电击杯，冰上放置5分钟。

(2)用Bio-Rad电击仪进行电击转化。条件：200Ω，25mF，电压2.3kV，持续时间5ms。

(3)电击后迅速加入1mL液体LB培养基，37℃振荡培养1-2h，之后吸取一半菌液涂到氯霉素平板(氯霉素浓度20mg/mL)，37℃培养。

5)PCR鉴定长出的氯霉素抗性克隆，挑选敲除成功的阳性转化子。

用高压灭菌的枪头挑取平板上长出的菌落，涂到已经分隔划线并编号的氯霉素平板上，37℃培养过夜，第二天用枪头挑取少许涂开的菌斑，混于事先配制好的总体积20μLPCR体系中，做好PCR管上的编号，直接上PCR仪扩增。扩增体系与普通无特殊区别，扩增引物使用copA基因的外侧引物，并且加入一管野生型MC4100菌液作为扩增模板的对照。

PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃40s；55℃40s；72℃2min；循环35次；72℃10min。

PCR结束后取3-5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。用设计在copA基因上下游800bp的鉴定引物，以野生型菌株为模板，扩增出4102bp的条带，以待鉴定的敲除菌株ΔcopA为模板扩增出2749bp的条带，表明已经在野生型MC4100菌株的基础上成功敲除了copA基因，得到ΔcopA菌株。

6)pCP20质粒的转化

将pCP20质粒转化入通过冷CaCl

7)氯霉素抗性基因的消除

用接种针从pCP20-ΔcopA细菌转化平板上取一个单菌落接种于3mL LB液体培养基中，42℃，250rpm振荡培养4h；取一菌环分区划线接种于LB平板上，37℃培养过夜。用接种针分别从37℃培养过夜的细菌(此时氯霉素抗性基因已去除，pCP20质粒已丢失)平板上挑取3个单菌落分别点种于LB/Cm

8)ΔcopA单敲除菌的纯化

从ΔcopA分区划线平板上挑取单菌落，用接种环蘸取少许细菌分区划线于新的LB平板，37℃培养过夜。余下菌落挑至100μL无菌水中，煮沸10min后离心，取上清作为模板进行PCR鉴定，鉴定正确后得到纯化的ΔcopA单敲除菌。

1.3大肠杆菌ΔcopAΔcueO双敲除菌株的构建

在ΔcopA单敲除菌的基础上进一步敲除cueO基因，构建得到copA和cueO双敲除菌株，方法同ΔcopA单敲除菌的构建。用鉴定引物鉴定后，完成ΔcopAΔcueO双敲除菌株的构建。

2.铜离子诱导重组蛋白表达通用型载体PcopA-pUC57K的构建

根据大肠杆菌copA启动子序列PcopA，加上一段优化的MCS序列，由南京金斯瑞生物科技公司直接合成此融合序列PcopA-MCS。用引物PcopA-MCS-1和PcopA-MCS-2进行PCR扩增PcopA-MCS基因片段；上述引物序列分别为：

PcopA-MCS-1(SEQ ID NO.10)：AATTCCTCACCCCGGTGCCG；

PcopA-MCS-2(SEQ ID NO.11)：AAGTCAGTGGTGGTGGTGGT；

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

用引物pUC57K-1和pUC57K-2进行PCR扩增线性pUC57K载体；上述引物序列分别为：

pUC57K-1(SEQ ID NO.12)：ACCACCACCACCACTGACTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTG；

pUC57K-2(SEQ ID NO.13)：

CGGCACCGGGGTGAGGAATTGATATCTAGATGTATTCGCGAGGTAC；

电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将PcopA-MCS基因片段和线性pUC57K载体分别进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作将两个片段混合进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，挑取阳性克隆，测序验证并构建得到铜离子诱导重组蛋白表达通用型载体PcopA-pUC57K(图谱如图1所示，DNA序列如SEQ ID NO：14所示)。

3.铜离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的载体PcopA-Pfu-pUC57K的构建

根据高温嗜热菌Pyrococcus furiosis的DNA聚合酶Pfu蛋白的氨基酸序列，由南京金斯瑞生物科技公司按照大肠杆菌密码子偏好性，直接合成此蛋白的编码基因pfu。用引物Pfu-1和Pfu-2进行PCR扩增pfu基因片段；上述引物序列分别为：

Pfu-1(SEQ ID NO.15)：GTGCCGCGCGGCAGCGTCGACATGATCCTGGACGTGGACTAC；

Pfu-2(SEQ ID NO.16)：

CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGCTTTTCTTGATGTTCAGCCAGC；

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃3min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将pfu基因片段进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作，与经Sal I和Hind III双酶切后的PcopA-pUC57K线性载体进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到铜离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的载体PcopA-Pfu-pUC57K(DNA序列如SEQ IDNO：17所示)。

4.铜离子诱导铜结合漆酶CueO蛋白表达的载体PcopA-CueO-pUC57K的构建

根据大肠杆菌的铜结合漆酶CueO蛋白的氨基酸序列，由南京金斯瑞生物科技公司进行密码子序列优化，直接合成此蛋白的编码基因cueO。用引物CueO-1和CueO-2进行PCR扩增cueO基因片段；上述引物序列分别为：

CueO-1(SEQ ID NO.18)：

GTGCCGCGCGGCAGCGTCGACATGGCTGAAAGGCCTACACTACCC

CueO-2(SEQ ID NO.19)：

CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCACACGGTAAAGCCCAGC

电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将cueO基因片段进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作，与经Sal I和Hind III双酶切后的PcopA-pUC57K线性载体进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到铜离子诱导铜结合漆酶CueO蛋白表达的载体PcopA-CueO-pUC57K(DNA序列如SEQ IDNO：20所示)。

5.菌株的获得

将所得PcopA-Pfu-pUC57K和PcopA-CueO-pUC57K质粒分别转化入野生菌MC4110和ΔcopAΔcueO感受态细胞，得到PcopA-Pfu-pUC57K/MC4100、PcopA-CueO-pUC57K/MC4100、PcopA-Pfu-pUC57K/ΔcopAΔcueO、PcopA-CueO-pUC57K/ΔcopAΔcueO菌株。

6.铜离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达情况分析和Pfu蛋白的活性测定

将PcopA-Pfu-pUC57K/MC4100和PcopA-Pfu-pUC57K/ΔcopAΔcueO菌株过夜生长。吸取10μL过夜生长的上述菌液分别加入到1L新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD

如图2所示，为不同浓度铜离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析图。结果显示：PcopA-Pfu-pUC57K质粒在MC4100菌株内，只有当铜离子浓度升高到2000μmol/L时，Pfu蛋白才有较明显地表达。但是在ΔcopAΔcueO菌株中，2μmol/L的铜离子浓度即可显著诱导表达Pfu蛋白。这表明copA和cueO基因敲除后，大肠杆菌对铜离子非常敏感，只需要很低浓度的铜离子即可诱导重组蛋白表达。所以从节约成本提高蛋白产量的角度出发，后续将使用ΔcopAΔcueO菌株作为铜离子诱导重组蛋白表达的宿主。另外从电泳分析结果可知，Pfu在ΔcopAΔcueO菌株中表达，当培养基中铜离子浓度为25μmol/L时，单位菌量的蛋白表达量即可达到饱和，继续增加铜离子浓度不会增加蛋白表达量。

接着对单位体积的含菌培养基能产生的蛋白产量进行分析。从图3可知，单位体积蛋白产量首先随着铜离子浓度升高而逐渐增加，当铜离子浓度为25μmol/L时，单位体积蛋白产量达到最高值，为68.23mg/L(每升菌液可获得68.23mg的Pfu蛋白)。由于高浓度的铜离子会抑制细菌的生长，当培养基铜离子浓度继续升高时，单位体积蛋白产量反而会逐步减少，所以25μmol/L可认为是铜离子诱导Pfu蛋白表达的最佳浓度。将诱导后的菌体破碎，离心后取上清，用镍柱进行纯化，可得到纯度大于95％的Pfu纯化蛋白(如图4所示)。

之后对纯化的Pfu蛋白的DNA聚合酶活性进行分析。50μL的PCR体系如下：模板PcopA-CueO-pUC57K质粒20ng，上下引物各1μL(20μM，序列分别为SEQ ID21:GGTGATGACGGTGAAAACCTCTGAC和SEQ ID 22:CAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCG)，纯化的Pfu蛋白0.5μL(浓度分别为3μM(泳道3)、1.5μM(泳道4)、0.75μM(泳道5))，Pfu缓冲液和水补齐到50μL。另外用购买的商业化Pfu酶(5U/μL)作为阳性对照(泳道1)，以及不加任何酶作为阴性对照(泳道2)。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

如图5结果所示，用铜离子诱导的Pfu蛋白与商品化的Pfu相似，具有较高的DNA聚合酶活性，比活性为36,122U/mg。

此外，我们还分析了铜离子诱导重组蛋白表达系统的抗干扰能力。当PcopA-Pfu-pUC57K/ΔcopAΔcueO菌株生长至其OD

7.铜离子诱导铜结合漆酶CueO蛋白表达情况分析和CueO蛋白的活性测定

将PcopA-CueO-pUC57K/MC4100和PcopA-CueO-pUC57K/ΔcopAΔcueO菌株过夜生长。吸取10μL过夜生长的上述菌液分别加入到1L新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD

如图9所示，为不同浓度铜离子诱导铜结合漆酶CueO蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析图。结果显示：PcopA-CueO-pUC57K质粒在MC4100菌株内，即使铜离子浓度升高到2000μmol/L也不能诱导CueO蛋白表达。而在ΔcopAΔcueO菌株中，CueO蛋白的表达随着铜离子浓度的增加而逐步增多。所以使用ΔcopAΔcueO菌株作为铜离子诱导CueO蛋白表达的宿主。另外从电泳分析结果可知，Pfu在ΔcopAΔcueO菌株中表达，当培养基中铜离子浓度为500μmol/L时，单位菌量的蛋白表达量可达到最高值。从图10可知，单位体积蛋白产量首先随着铜离子浓度升高而逐渐增加，当铜离子浓度为500μmol/L时，单位体积蛋白产量达到最高值，为47.94mg/L(每升菌液可获得47.94mg的CueO蛋白)。高浓度的铜离子会抑制细菌的生长，所以培养基铜离子浓度继续升高时，单位体积蛋白产量会有所下降。将诱导后的菌体破碎，离心后取上清，用镍柱进行纯化，可得到纯度大于95％的CueO纯化蛋白(如图11所示)。

CueO蛋白是铜结合的漆酶，所以用ICP-MS仪器对CueO蛋白的铜结合含量进行测定。如图12所示，CueO蛋白的铜结合含量随着培养基中铜离子浓度的升高而增加，当培养基中添加1000μmol/L铜离子时，CueO结合铜含量基本达到最高(每分子蛋白结合3.80个铜离子)。

另外用ABTS作为底物对CueO的漆酶活性进行分析。150uL活性测定体系如下：CueO蛋白15μL，终浓度为1mM的ABTS 50μL，柠檬酸缓冲液(pH 3.0)85μL。50℃水浴孵育20min，阴性对照用相同体积蛋白缓冲液替代蛋白，测定420nm的吸光度OD值。产物生成量计算(μM)＝(OD

8.利用含铜工业废水诱导重组蛋白表达和活性分析

工业上涉及电镀加工、材料铸造等行业，日常生产中会产生大量的含铜废水，这些废水需要经过除污处理才能排放到环境中。由于本发明描述的铜离子诱导重组蛋白表达系统具有较强的抗干扰能力，我们尝试直接用含铜的工业废水对重组蛋白进行诱导表达。

我们从电镀工业园区随机采集了36份水样，用ICP-MS对水样中的铜离子进行测定，从中随机挑选了铜离子含量超标(>1.5mg/L，依据WHO最高允许铜排放浓度)的5份水样和铜离子含量较低的1份水样(阴性对照)。之后对6份水样的酸碱度(pH)、总溶解固体含量(TDS)也分别进行检测，结果如表1所示：

表1 6份水样的理化性质

将PcopA-Pfu-pUC57K/ΔcopAΔcueO菌株过夜生长。吸取10μL过夜生长的上述菌液分别加入到7瓶250mL的2×LB液体培养基(各成分含量是常规用量的2倍，抗生素浓度不变)中，使起始菌液OD

如图14所示，为不同工业废水水样诱导Pfu蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析图。NC为去离子水的阴性对照，没有看到Pfu表达。由于1–5号水样含有较高浓度的铜离子，均可明显诱导Pfu蛋白的表达，而6号铜离子含量低，不能诱导表达Pfu。图15显示1–5号水样诱导的Pfu蛋白具有较高的酶活性。

值得强调的是，如上述表格所示，1–5号水样呈现不同程度的酸性，且均含有高含量的可溶性固体杂质，此结果表明本发明的铜离子诱导重组蛋白表达系统具有较好的抗干扰能力，能够直接用含铜工业废水诱导表达重组蛋白，具有良好的应用前景。

DNA聚合酶Pfu是一种在生物医学研究中经常用到的高保真DNA聚合酶，商品化的Pfu酶价格相比其他普通DNA聚合酶较贵。漆酶是一种以铜离子为辅基的多酚氧化酶，普遍应用于食品、造纸、纺织工业以及环保、生物医学等领域。上述两种重组蛋白由于应用广泛，需求量大，所以一般都是以工业级规模进行大量发酵以诱导蛋白表达。一般诱导蛋白表达都需要较为昂贵的诱导剂，在大规模制备时成本较高。而且对于诱导以铜离子为辅基的重组蛋白，诱导时除需要使用常规诱导剂外，还需要额外添加铜离子溶液，较为繁琐。本发明描述了一种以铜离子为诱导剂的重组蛋白表达方法及其应用。主要构建了一种铜离子诱导重组蛋白的通用表达载体，即PcopA-pUC57K，将目的蛋白的编码基因序列克隆到PcopA-pUC57K的MCS合适位点，并转化到对铜离子敏感的ΔcopAΔcueO菌株。只需要添加一定浓度的铜离子溶液或者含有铜离子的废水，即可高效诱导表达具有活性的重组蛋白。该方法简便廉价、绿色环保，能够节能减排、回收利用废弃铜离子，在大规模制备重组蛋白方面具有较强的推广价值和应用前景。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种铜离子诱导重组蛋白表达体系及其诱导方法和应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 392

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattcctcac cccggtgccg attttcaggc atcctgattt aacttagcac ccgcaactta 60

actacaggaa aacaaagaga taaatgtcta atcctgatgc aaatcgagcc gattttttaa 120

tctttacgga cttttacccg cctggtttat taatttcttg accttcccct tgctggaagg 180

tttaaccttt atcacagcca gtcaaaactg tcttaaagga gtgttttatg gctagcagcc 240

atcatcatca tcatcacagc agcggcctgg tgccgcgcgg cagcgtcgac gctaccatga 300

ctggtggaca gcaaatgggt cgggatccga attcgagctc cgtcatcaag cttgcggccg 360

cactcgagca ccaccaccac caccactgac tt 392

<210> 2

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtcacaaac tatcgacctg accctggacg gcctgtcctg cggtcactgt gtgtaggctg 60

gagctgcttc g 71

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttattccttc ggtttaaacc gcagcaaccg gttggcgtta ctcactacgg catatgaata 60

tcctccttag ttcct 75

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgcgatgg acgagcgg 18

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaacaaatta cacaaacata ctaagtcata caagaacg 38

<210> 6

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgctcaacg tttgattttg tttcgcctgc ttaagaataa ggaaataact gtgtaggctg 60

gagctgcttc 70

<210> 7

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcagtttaa tgcccggaga gatccgggca tatttccgaa tacggtcttt catatgaata 60

tcctcctta 69

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaggaaaaaa gcggccgcgc aagcaggctt aaggaatcg 39

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcacgcatg tcgaccccga tgccggttcc 30

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aattcctcac cccggtgccg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtcagtgg tggtggtggt 20

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accaccacca ccactgactt ggtgtaatca tggtcatagc tg 42

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggcaccggg gtgaggaatt gatatctaga tgtattcgcg aggtac 46

<210> 14

<211> 2929

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tacatctaga tatcaattcc tcaccccggt gccgattttc aggcatcctg atttaactta 480

gcacccgcaa cttaactaca ggaaaacaaa gagataaatg tctaatcctg atgcaaatcg 540

agccgatttt ttaatcttta cggactttta cccgcctggt ttattaattt cttgaccttc 600

cccttgctgg aaggtttaac ctttatcaca gccagtcaaa actgtcttaa aggagtgttt 660

tatggctagc agccatcatc atcatcatca cagcagcggc ctggtgccgc gcggcagcgt 720

cgacgctacc atgactggtg gacagcaaat gggtcgggat ccgaattcga gctccgtcat 780

caagcttgcg gccgcactcg agcaccacca ccaccaccac tgacttggtg taatcatggt 840

catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 900

gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 960

tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 1020

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 1080

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 1140

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 1200

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 1260

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 1320

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 1380

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 1440

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 1500

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 1560

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 1620

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 1680

gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 1740

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 1800

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 1860

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 1920

tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaagccca atctgaataa 1980

tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc 2040

aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa 2100

ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt 2160

ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca 2220

agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag tttatgcatt 2280

tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca 2340

accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta 2400

aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca 2460

acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt ttttccgggg 2520

atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga 2580

agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca 2640

acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaagcga 2700

tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca 2760

gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca 2820

ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac agttttattg ttcatgatga tatattttta 2880

tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacgggcc agagctgca 2929

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtgccgcgcg gcagcgtcga catgatcctg gacgtggact ac 42

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgagtgcg gccgcaagct tttagctttt cttgatgttc agccagc 47

<210> 17

<211> 5200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17