一种富硒灵芝的生产方法

一、技术领域：

本发明属于硒深加工技术领域，具体涉及一种富硒灵芝的生产方法。

二、背景技术：

从世界卫生组织公布的数据来看，地球表面的硒含量分布很不均匀，有近50多个国家和地区出现缺硒现象。在我国有22个省份的几亿人口都处于缺硒或低硒地带。人体硒科学含量的标准包括最低硒需要量(17μg/d)、生理硒需要量(40μg/d)、膳食硒供给量(50～250μg/d)、膳食硒最高安全摄入量(400μg/d)、界限中毒剂量(400μg/d)，被世界粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)、国际原子能机构(IAEA)认可采用。经常性的硒缺乏将引起含硒酶活性降低、氧自由基清除受阻、生物膜受损、解毒和免疫功能减退等一系列机体功能障碍，从而导致多种疾病发生。为了改善整个食物链的低硒状态，硒的补充十分必要。中国营养学会“每日膳食营养素供给量”已将硒列为15种每日膳食营养素之一，提出一个成年人每天对硒的适宜摄入量是50～250μg。

人们在补硒时，通常选用无机硒和有机硒产品。无机硒常用产品大都是亚硒酸钠，它存在很大的毒性，生物利用效性低，对人体有着潜在的危害，在一些欧美国家已经将亚硒酸钠列入了食品添加剂的黑名单。对于有机硒而言，只有硒代蛋氨酸可直接参入到蛋白质中而贮存于机体内，并可通过正常的代谢过程可逆性地释放出来。补充硒代蛋氨酸的动物较补充亚硒酸钠的动物在停止补充硒后，可在更长的时间内保持含硒酶的更高活性。由于有机硒补剂特别是富含硒代氨基酸的产品在毒理安全性、生理活性和吸收率上的优越性，因此这类产品的开发与研究一直广为关注。

生物有机硒开发通常是通过添加亚硒酸钠，结合自身的转化特性将无机硒转变成有机硒。因此，目前广泛应用的获取生物有机硒的方式是生物转化法。主要包括植物法、微生物法、动物法等3种方法。目前，人们主要青睐前两种合成有机硒的方法。但是对于植物转化合成有机硒而言，很容易受到限制，比如：生长周期长，受季节因素影响大等。由于微生物繁殖迅速，生长周期短，培养环境易于控制，已经成为转化合成有机硒的首选方法。在微生物法转化有机硒中，目前比较多的是酵母法。但酵母及其培养液残留给产品带来较大的味道，其产品形态大多是片剂，以保健品的形态进行销售，越来越不被人们接受。

灵芝作为我国常见的药(食)用菌，其药(食)用价值极高，不仅营养丰富，而且具有抗肿瘤、增强人体免疫等功效。硒(Se)是一种多功能生命营养元素，可用于多种疾病的治疗，且可提高机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤等。将灵芝作为硒的转化生物体进行栽培，获取的子实体不仅具有食用菌本身的营养价值，且兼具硒的生物活性，因此，具有很高的药用价值。

目前，富硒灵芝生产主要是采用外加亚硒酸钠进行培养的方式。亚硒酸钠在低浓度时就主要表现为细胞毒性作用(如细胞脱壁、细胞内空泡增多、细胞膜破裂、细胞坏死和急性溶解)，并伴有DNA合成减少和阻断细胞周期于S/G2-M期。相关研究发现，亚硒酸钠对灵芝的生长速度、子实体生物量、子实体质量(菌盖的大小厚度等)有较大的抑制作用。而且，采用这种方式获得的灵芝富硒量远小于现有的富硒酵母1200～5000μg/g。因此，富硒灵芝的生产工艺尚有改进的空间。

三、发明内容：

本发明要解决的技术问题是：基于现有富硒灵芝生产加工方法中存在的技术问题，本发明提供一种新的富硒灵芝的生产方法，本发明技术方案采用外加L-硒-甲基硒代半胱氨酸的方式进行富硒灵芝的生产，L-硒-甲基硒代半胱氨酸是经过国家批准的食品添加剂，其在高浓度时对细胞形态的改变不大，对细胞生长有抑制作用但较温和，一般不引起DNA的断裂，毒性极低。

为了解决上述问题，本发明采取的技术方案是：

本发明提供一种富硒灵芝的生产方法，所述生产方法包括以下步骤：

1)、椴木的处理：

选择当年11月至次年1月进行椴木砍伐(因为这段时期气温低、少雨，接种成活率高，同时经过较长一段时间发菌，菌丝积累养分多，为子实体正常生育提供了物资保证)，砍倒后带枝叶置于原地；当椴木截面木心处有小裂纹时，将椴木截断成椴木块，在椴木块上用电钻钻出接种穴；

2)、接种(在当年12月至次年1月)：

在椴木上钻接种穴的同时挖取培养好的木屑菌种(盛放菌种的器具要清洁)，将挖出的菌种覆盖上塑料薄膜(以免干掉)；接种时将木屑菌种塞入接种穴，接种穴口(要用相应大小的)采用树皮块盖于穴面(以防菌种干萎、死亡)，处理后得到接种后的椴木块；

所述木屑菌种的制作方法为：首先将赤灵芝菌种在无菌条件下进行母种转管扩接，然后将母种接入原种培养基中进行扩接原种，最后将原种接入栽培种培养基中进行扩接栽培种；接种完毕后，及时将接好的盛装器皿移入经过消毒的培养箱中进行培养，培养过程中温度为24～26℃、湿度为60％～70％(有利于菌丝生长)；

3)上堆发菌：

将步骤2)接种后的椴木块进行堆拢发菌，堆拢过程中控制温度为22～25℃、湿度为60％～70％(接种后的椴木块堆于地面时预先要做好堆角，堆角的四角各垫两块砖，再在两个堆角砖上架毛竹或者木条一根即成，然后将接种好的椴木块以一层直放一层横放的方向上堆叠，堆的大小为：宽为一根椴木块长，长不限，高不超过1米；堆过高，堆的上下温差大，发菌不均匀)；堆拢后用塑料薄膜覆盖，薄膜外再盖草帘；堆温用覆盖物的启闭和加温来控制，当堆温小于22℃时，室内加温并用热水泼浇于堆基下，覆盖物密闭；堆温大于25℃时，覆盖物慢慢张开；堆拢发菌期间每隔7～10天进行翻堆(以便使上下层椴木块能同步发力)，第二、三次翻堆时(椴木块可能因为水分蒸发而变得含水量不足，树皮颜色变浅，断面裂口增大，重量变轻)向椴木块上喷水，喷到椴木块表面湿润为止(一面翻堆，一面喷水)，最后至椴木块表面无游离水时盖好塑料薄膜；椴木块堆拢发菌共40～50天，发菌过程中，当接种穴菌落直径达到7～8厘米时，椴木块进行埋土栽培；

4)栽培管理：

a、选择海拔600～800米的汝阳鸡冠山作为灵芝培育基地，该基地出芝时湿度为84％～86％、温度为24～26℃；

b、对选择的灵芝培育基地进行土壤翻耕，去掉杂物和石块，在地面上开畦，并做排水沟和工人行道(畦长度不限，因地势而异)；

c、在3～4月份将步骤3)处理后的椴木块进行埋土栽培，椴木块与椴木块之间相距为4～7厘米，覆盖土壤，覆土厚为2～3厘米，在畦床四周开好排水沟；

5)出芝管理与采收：

a、出芝管理：栽培灵芝的椴木块埋土后(防止土壤干燥)，每周喷雾浇水1～2次，喷水量控制覆土含水量为24～26％；病虫害管理按照GB4285-1989农药安全使用标准的规范选用农药，进行合理方法喷施(不得直接向芝体上喷施农药)；

b、当灵芝子实体长到菌盖边缘由黄色转变为褐色，菌盖下面的菌管层为淡草绿色时，停止喷水一天，然后在晴天采收(采收时，成熟一个收一个；灵芝成熟的标志是菌盖下方弹射孢子，在成熟灵芝的表面，会看到一层细腻的孢子粉)，采收后进行擦洗，然后进行晒干或烘干，得到产品富硒灵芝装入塑料袋内密封保存。

根据上述的富硒灵芝的生产方法，步骤1)中所述椴木块的长度为0.8～1.2米，直径为10～15厘米。

根据上述的富硒灵芝的生产方法，步骤1)中所述接种穴的穴深为1.2～1.5厘米，直径为1～1.2厘米，穴距为6～8厘米。

根据上述的富硒灵芝的生产方法，步骤2)中所述赤灵芝菌种Ganoderma lucidum的编号为BNCC336079，该菌种由北京北纳创联生物技术研究院保存提供。

根据上述的富硒灵芝的生产方法，步骤2)中所述所用培养基全部紫外灭菌；

以重量百分含量表示，所述原种培养基中含有木屑68～72％、麸皮26～30％、石膏粉0.8～1.2％和过磷酸钙粉0.8～1.2％，另外加入占各种原料总重量0.1％的尿素；

以重量百分含量表示，所述栽培种培养基中含有预处理木屑68～72％、麸皮26～30％、石膏粉0.8～1.2％和过磷酸钙粉0.8～1.2％，另外加入占各种原料总重量0.1％的尿素。

根据上述的富硒灵芝的生产方法，所述预处理木屑的处理方法为：将有机硒L-硒-甲基硒代半胱氨酸溶解于水，配制成浓度为10mg/mL的水溶液，对栽培种培养基中所用木屑进行预先浸泡，浸泡时间为24h；硒含量以风干料计算，浸泡后按照每克栽培种培养基中250μg有机硒含量进行配制栽培料。

根据上述的富硒灵芝的生产方法，步骤4)a中所述在地面上开畦时，畦宽为1.2～1.8米，畦间距为55厘米。

根据上述的富硒灵芝的生产方法，步骤5)b中所述采收方法为：在离地面0.9～1.1厘米处剪断菌柄取下，采收后，继续喷水保湿，一般种一次，采收3～5拨灵芝。

本发明的积极有益效果：

1、本发明生产方法中使用的L-硒-甲基硒代半胱氨酸是有机硒。

2、本发明生产方法中对细胞毒性低，提高了生物量。

3、与现有生产方法制备的富硒灵芝相比，本发明生产的微生物富硒量较高。

4、本发明技术方案中有机硒被灵芝富集过程中进行一系列代谢，转化成对人体更好吸收、毒性更低的硒蛋白。

5、利用本发明技术方案生产所得的灵芝品质好，经济效益好。

四、具体实施方式：

以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明技术方案保护的范围。

实施例1：

本发明富硒灵芝的生产方法，该生产方法的详细步骤如下：

1)、椴木的处理：

选择当年11月份进行椴木砍伐(因为这段时期气温低、少雨，接种成活率高，同时经过较长一段时间发菌，菌丝积累养分多，为子实体正常生育提供了物资保证)，砍倒后带枝叶置于原地；当椴木截面木心处有小裂纹时，将椴木截断成椴木块，椴木块的长度为1.0～1.2米，直径为12～13厘米；在椴木块上用电钻钻出接种穴(接种穴的穴深为1.3～1.5厘米，直径为1～1.2厘米，穴距为6～8厘米)；

2)、接种(在当年12月份进行接种)：

在椴木上钻接种穴的同时挖取培养好的木屑菌种(盛放菌种的器具要清洁)，将挖出的菌种覆盖上塑料薄膜(以免干掉)；接种时将木屑菌种塞入接种穴，接种穴口采用相应大小的树皮块盖于穴面(以防菌种干萎、死亡)，处理后得到接种后的椴木块；

所述木屑菌种的制作方法为：首先将赤灵芝菌种(所述赤灵芝菌种Ganodermalucidum的编号为BNCC336079，该菌种由北京北纳创联生物技术研究院保存提供)在无菌条件下进行母种转管扩接，然后将母种接入原种培养基中进行扩接原种，最后将原种接入栽培种培养基中进行扩接栽培种；接种完毕后，及时将接好的盛装器皿移入经过消毒的培养箱培养中进行培养，培养过程中温度为24～26℃、湿度为60％～70％(有利于菌丝生长)；

以重量百分含量表示，所述原种培养基的原料组成为：木屑70％、麸皮28％、石膏粉1％和过磷酸钙粉1％，另外加入占各种原料总重量0.1％的尿素；

以重量百分含量表示，所述栽培种培养基的原料组成为：预处理木屑70％、麸皮28％、石膏粉1％和过磷酸钙粉1％，另外加入占各种原料总重量0.1％的尿素；

所述预处理木屑的处理方法为：将有机硒L-硒-甲基硒代半胱氨酸溶解于水，配制成浓度为10mg/mL的水溶液，对栽培种培养基中所用木屑进行预先浸泡，浸泡时间为24h；浸泡后按照每克栽培种培养基中250μg有机硒含量进行配制栽培料(硒含量以风干料计算)；

所述所用培养基全部紫外灭菌；

3)上堆发菌：

将步骤2)接种后的椴木块进行堆拢发菌，堆拢过程中控制温度为22～25℃、湿度为60％～70％(接种后的椴木块堆于地面时预先要做好堆角，堆角的四角各垫两块砖，再在两个堆角砖上架毛竹或者木条一根即成，然后将接种好的椴木块以一层直放一层横放的方向上堆叠，堆的大小为：宽为一根椴木块长，长不限，高不超过1米；堆过高，堆的上下温差大，发菌不均匀)；堆拢后用塑料薄膜覆盖，薄膜外再盖草帘；堆温用覆盖物的启闭和加温来控制，当堆温小于22℃时，室内加温并用热水泼浇于堆基下，覆盖物密闭；堆温大于25℃时，覆盖物慢慢张开；发菌期间每隔7～10天进行翻堆(以便使上下层椴木块能同步发力)，第二、三次翻堆时(椴木块可能因为水分蒸发而变得含水量不足，树皮颜色变浅，断面裂口增大，重量变轻)向椴木块上喷水，喷到椴木块表面湿润为止(一面翻堆，一面喷水)，最后至椴木块表面无游离水时盖好塑料薄膜；椴木块堆拢发菌共45天，发菌过程中，当接种穴菌落直径达到7～8厘米时，椴木块进行埋土栽培；

4)栽培管理：

a、选择海拔600～800米的汝阳鸡冠山作为灵芝培育基地，该基地出芝时湿度为84％～86％、温度为24～26℃；

b、对灵芝培育基地的土壤进行翻耕，去掉杂物和石块，在地面上开畦，畦宽为1.5～1.8米，畦间距为55厘米；并做排水沟和工人行道(畦长度不限，因地势而异)；

c、在3月份将步骤3)处理后的椴木块进行埋土栽培，椴木块与椴木块之间相距为5～6厘米，覆盖土壤，覆土厚为2～3厘米，在畦床四周开好排水沟；

5)出芝管理与采收：

a、出芝管理：栽培灵芝的椴木块埋土后(防止土壤干燥)，每周喷雾浇水1～2次，喷水量控制覆土含水量为24～26％；病虫害管理按照GB4285-1989农药安全使用标准的规范选用农药，进行合理方法喷施(不得直接向芝体上喷施农药)；

b、当灵芝子实体长到菌盖边缘由黄色转变为褐色，菌盖下面的菌管层为淡草绿色时，停止喷水一天，然后在晴天采收(采收时，成熟一个收一个；灵芝成熟的标志是菌盖下方弹射孢子，在成熟灵芝的表面，会看到一层细腻的孢子粉)，采收后进行擦洗，然后进行烘干，得到产品富硒灵芝装入塑料袋内密封保存；

所述采收方法为：在离地面0.9～1.1厘米处剪断菌柄取下，采收后，继续喷水保湿，一般种一次，采收3～5拨灵芝。

对比实施例1：

与本发明实施例1生产方法基本相同，不同之处在于：步骤2)接种中添加相同含量的亚硒酸钠对照组作为对比实施例1。

空白组实施例：与本发明实施例1生产方法基本相同，不同之处在于：步骤2)接种中不添加硒料的处理组作为空白对照，即作为空白对照组实施例。

对本发明实施例1、对比实施例1和空白组实施例生产所得富硒灵芝进行农艺性状统计：

1、研究统计灵芝农艺性状包括：菌盖大小、菌盖厚度及菌柄长度；灵芝子实体成熟后，使用游标卡尺分别量取菌盖横径、纵径、菌盖厚度及菌柄长度(相关数据详见表1)。

表1实施例1、对比实施例1和空白组生产所得灵芝栽培质量对比

供试灵芝在不同处理培养料中生长，本发明实施例1添加有机硒培养料中生长的灵芝菌盖厚度较对比实施例1和空白对照组均变厚，菌盖大小均较肥大，菌柄长度均较短，每颗生物产量均大于对比实施例1和空白对照组。由此说明本发明有机硒处理后生产出的灵芝农艺性状较好，具有较高的经济价值。无机硒处理组和空白组变化不特别明显。

2、灵芝有机硒含量测定：

A、总硒测定方法：参照GB5009.93-2010食品安全国家标准中荧光法测定灵芝总硒含量，取样品0.5g(精确到0.001g)，加入混合酸(所述混合酸为硝酸和高氯酸的混合，二者混合体积比为9:1)10mL进行消解至溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余液体为2mL，静置冷却；然后向其中加入5mL、50％的盐酸，使其挥发至溶液剩2mL，冷却后加入5mL浓盐酸，超纯水定容至50mL，同时做样品空白。

B、无机硒测定方法：称取样品0.5g(精确到0.001g)于具塞试管中，精确加入50％盐酸溶液20mL，振荡摇匀，常温超声波处理45min，沸水浴30min，冷却后经脱脂棉过滤，收集滤液；精确移取5mL滤液于消解管中，加入混合酸(所述混合酸为硝酸和高氯酸的混合，二者混合体积比为9:1)10mL进行消解至溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余液体为2mL，静置冷却；加5mL、50％盐酸，使其挥发至溶液剩2mL，冷却后加入浓盐酸5mL，超纯水定容至50mL。参考食品中总硒的测定方法(GB5009.93-2010)，选用硒元素标准溶液制作标准曲线，测定样品中总硒含量，即为无机硒含量，为了保证实验的可比性，同时做样品空白。

C、有机硒含量通过差减法取得，公式为：

C0＝C-C1

式中：C0为样品中有机硒含量，mg/kg；

C为样品中总硒含量，mg/kg；

C1为样品中无机硒含量，mg/kg。

3、灵芝粗多糖测定：

根据《中国人民共和国药典》中规定采用蒽酮-硫酸法测定：称取烘干(60℃烘干至恒重)并粉碎的灵芝子实体1.00g，加入30mL超纯水，90℃水浴3h后，4000rpm离心10min，将上清液转入清洁的三角瓶；滤渣加入20mL超纯水，继续90℃水浴2h后，4000rpm离心10min，再将上清液转入清洁的三角瓶，把两次上清液进行混合。采用旋转蒸发仪60℃浓缩至10mL，将滤液加入3倍体积的95％乙醇，过夜沉淀后4000rpm离心，去上清，将沉淀以10mL超纯水溶解。随后将溶解液进行稀释，吸取2mL稀释液与1mL、5％蒽酮、5mL浓硫酸反应，振荡5min后室温静置显色20min，最后于紫外–可见分光光度计490nm波长处比色测定。按标准曲线计算样品溶液中灵芝粗多糖的含量。灵芝粗多糖含量计算公式为：

灵芝粗多糖含量(％)＝(读取浓度×稀释倍数)/称取样品干重×100％

4、灵芝三萜测定：

参照农业部检测灵芝及其相关产品中总三萜含量的备案标准(NY/SJ339-2001)进行。

称取干燥灵芝子实体粉末1.000g(65℃烘箱干燥12h)，置于50mL容量瓶，加入70％(V/V)乙醇溶液20mL，超声处理(40℃，功率250W，30min)，随后以70％乙醇定容至50mL，摇匀后过滤，将粗滤液去除后收集滤液。吸取滤液1mL于试管中，以1mL无水乙醇为对照，按标准曲线法测定吸光值(560nm)。

灵芝总三萜酸含量计算公式为：

灵芝总三萜含量(％)＝(Y/1000)/[(m/50)×V]×100％

该公式以齐墩果酸为标准，折算为干物质含量，同一样品做三次平行实验，取平均值±标准偏差(n＝3)。式中m为样品质量(mg)，V为吸取滤液体积(mL)，Y为灵芝三萜酸含量(μg)。

本发明实施例1、对比实施例1和空白对照组所生产灵芝栽培中有效成分详见表2。

表2实施例1、对比实施例1和空白组生产所得灵芝栽培有效成分对比

通过上述实验检测结果可知，硒元素能够在一定程度上促进灵芝子实体产生三萜酸和多糖，有机硒促进作用更明显。本发明灵芝子实体实施例1有机硒含量平均值为300mg/kg，均显著高于对比实施例1和空白对照组；对比实施例1添加亚硒酸钠硒盐培养料栽培的灵芝子体硒含量也高于对照组；由此可见灵芝子实体对硒元素具有较好的生物吸附。