lncRNA在复发性流产诊治中的应用

技术领域

本发明属于生药医药和分子生物学技术领域，具体涉及lncRNA在复发性流产诊治中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

根据美国生殖医学协会的规定，复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指两次以及两次以上的连续的胚胎丢失。除了遗传因素、子宫解剖结构异常、感染等明确病因外，尚有原因不明造成的复发性流产。由于缺乏有效的临床治疗措施，目前RSA已成为不孕不育症的重要原因之一。因此探索RSA的病因和发病机制，则是预防和治疗RSA的关键。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是转录本大于200nt的非编码RNA，虽然lncRNA不参与蛋白质的编码过程，但在基因的转录以及转录后调控等发挥重要作用。近年来的研究发现lncRNA在调节机体的生理过程中发挥重要作用，如细胞增殖、细胞周期、染色体重塑和组蛋白修饰等，另外，lncRNA的异常表达与多种肿瘤、心血管疾病等紧密相关。然而，目前lncRNA在复发性流产中的作用的相关研究仍然较少，因此有必要探寻更加有效的lncRNA作为RSA临床诊断、治疗检测的标记物，为诊断、治疗RSA和研发相关药物提供依据。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供lncRNA在复发性流产诊治中的应用。本发明首次发现LINC01088的表达量与复发性流产紧密相关，且LINC01088在复发性流产中的诊断的灵敏性与特异性很高，进一步研究证明，LINC01088可以抑制滋养细胞的增殖、侵袭，抑制滋养细胞的周期并促进滋养细胞的凋亡，从而导致流产的发生。因此，LINC01088等lncRNA作为复发性流产的预测诊断标志物和潜在治疗靶点，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供lncRNA作为标志物在制备复发性流产诊断或辅助诊断产品中的应用。

其中，所述lncRNA包括LINC01088。

本发明通过研究发现，与正常妊娠者相比，LINC01088在复发性流产患者的绒毛组织中呈高表达。进一步绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC)，表明LINC01088具有诊断作用，且LINC01088在复发性流产中的诊断的灵敏性与特异性高。

本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测lncRNA的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断复发性流产。

其中，检测lncRNA的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。

所述产品包括但不限于检测待测样本中所述lncRNA表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。

所述待测样本可为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者绒毛组织。

本发明的第三个方面，提供一种用于诊断或辅助诊断复发性流产的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述lncRNA表达水平的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述lncRNA表达水平判断所述受试者是否患有复发性流产；

所述步骤ii)评估单元具体评估流程包括：

与参照相比，所述受试者的待测样品中的lncRNA表达水平上调，则所述受试者为或候选为复发性流产患者；反之，则所述受试者不为或不候选为复发性流产患者。

本发明的第四个方面，提供一种诊断或辅助诊断复发性流产的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述lncRNA表达水平，以及；

c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；

其中，与参照中的水平相比，样品中表达水平的上调，则所述受试者为或候选为复发性流产患者；反之，则所述受试者不为或不候选为复发性流产患者。

本发明的第五个方面，提供所述lncRNA作为靶点在复发性流产治疗和/或筛选复发性流产药物中的应用。

本发明的第六个方面，提供抑制所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)促进滋养细胞增殖；

(a2)促进滋养细胞细胞周期进程；

(a3)抑制滋养细胞凋亡；

(a4)促进滋养细胞迁移和/或侵袭；

(a5)抑制Arginase-1表达；

(a6)促进eNOS/NO系统；

(a7)抑制p38，JNK MAPK信号通路；

(a8)预防和/或治疗复发性流产。

本发明的第七个方面，提供一种产品，其活性成分包括抑制所述lncRNA的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)促进滋养细胞增殖；

(a2)促进滋养细胞细胞周期进程；

(a3)抑制滋养细胞凋亡；

(a4)促进滋养细胞迁移和/或侵袭；

(a5)抑制Arginase-1表达；

(a6)促进eNOS/NO系统；

(a7)抑制p38，JNK MAPK信号通路；

(a8)预防和/或治疗复发性流产。

本发明的第八个方面，提供促进所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制滋养细胞增殖；

(b2)抑制滋养细胞细胞周期进程；

(b3)促进滋养细胞凋亡；

(b4)抑制滋养细胞和/或侵袭；

(b5)促进Arginase-1表达；

(b6)抑制eNOS/NO系统；

(b7)激活p38，JNK MAPK信号通路；

(b8)构建复发性流产动物模型。

本发明的第九个方面，提供一种产品，其活性成分包括促进所述lncRNA的表达水平的物质；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制滋养细胞增殖；

(b2)抑制滋养细胞细胞周期进程；

(b3)促进滋养细胞凋亡；

(b4)抑制滋养细胞和/或侵袭；

(b5)促进Arginase-1表达；

(b6)抑制eNOS/NO系统；

(b7)激活p38，JNK MAPK信号通路；

(b8)构建复发性流产动物模型。

上述第六至第九方面中的产品可以为药物。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次发现LINC01088的表达量与复发性流产紧密相关，其中LINC01088在复发性流产中的诊断的灵敏性与特异性较高，进一步研究表明，LINC01088可以抑制滋养细胞的增殖、侵袭，抑制滋养细胞的周期并促进滋养细胞的凋亡，从而导致流产的发生。

综上，LINC01088等lncRNA作为复发性流产的预测诊断标志物和潜在治疗靶点，从而在复发性流产的诊断、治疗中发挥重要作用，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中lncRNA在复发性流产患者(RSA)与正常妊娠者(control)绒毛组织中的表达情况。*P<0.05；***P<0.001。

图2为本发明实施例中lncRNA在复发性流产中的诊断作用图。

图3是本发明实施例中LINC01088抑制滋养细胞增殖相关图。其中，A为CCK8实验证明LINC01088过表达后抑制滋养细胞的增殖；B为CCK8实验证明LINC01088敲除后促进滋养细胞的增殖；C为Edu实验证明LINC01088过表达后抑制滋养细胞的增殖；D为Edu实验证明LINC01088敲除后促进滋养细胞的增殖；E为克隆形成实验证明LINC01088过表达后抑制滋养细胞的增殖；F为克隆形成实验证明LINC01088敲除后促进滋养细胞的增殖。

图4是本发明实施例中LINC01088抑制滋养细胞的周期并促进滋养细胞凋亡相关图。其中，A为LINC01088过表达后可以抑制细胞周期G1到S期的进展；B为使用nocodazole对滋养细胞进行周期同步化处理，LINC01088过表达的滋养细胞G1期细胞明显增多；C为LINC01088过表达后抑制滋养细胞中周期相关分子CDK2，CDK4在mRNA水平的表达；D为LINC01088过表达后抑制滋养细胞中周期相关分子CDK2，CDK4，cyclin E1在蛋白水平的表达；E为LINC01088过表达促进滋养细胞的凋亡；F为LINC01088过表达后抑制Bcl2并促进Bax在mRNA水平的表达；G为LINC01088过表达后抑制Bcl2并促进Bax、cleaved caspase-3在蛋白水平的表达。

图5为本发明实施例中LINC01088抑制滋养细胞的侵袭相关图，其中，A为LINC01088过表达后抑制滋养细胞的侵袭与迁移功能；B为LINC01088敲除后促进滋养细胞的侵袭与迁移功能。

图6是本发明实施例中LINC01088结合并促进Arginase-1的表达，从而间接抑制eNOS/NO系统相关图。其中，A为核质分离实验检测LINC01088主要在滋养细胞细胞核中表达；B与C为RNA-pull down结合western-blot实验证实LINC01088可以与Arginase-1结合；D为LINC01088过表达后对Arginase-1在mRNA水平没有影响；E为LINC01088过表达后促进Arginase-1在蛋白水平的表达；F为LINC01088过表达后降低NOS蛋白水平的表达；G为复发性流产患者绒毛组织研磨液中NO含量降低；H为在过表达LINC01088的滋养细胞上清中NO含量降低。

图7为本发明实施例中LINC01088通过抑制NO的产生而激活JNK、P38/MAPK信号通路相关图，其中，A为滋养细胞中LINC01088过表达后只有MAPK家族中的p38与JNK信号通路被激活；B为绒毛组织中LINC01088过表达后p38与JNK信号通路被激活；C为复发性流产患者绒毛组织中p38与JNK信号通路被激活。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

本领域中已知的有数种lncRNA的序列，应理解，以下所示的各个lncRNA的数据库登录号是人来源的mRNA。然而，这些数据库条目还提供了例如以下不同来源的各自lncRNA的数据库登录号：例如任何哺乳动物、爬行动物、或鸟类来源的lncRNA，例如选自实验室动物(例如，小鼠或大鼠)、家养动物(包括例如豚鼠、兔、马、驴、牛、绵羊、山羊、猪、鸡、骆驼、猫、狗、海龟、陆龟、蛇或蜥蜴)或灵长类(包括黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩)的lncRNA的那些。

术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。

术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。

术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。

术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。

在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定lncRNA的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。特别地，例如旨在或不旨在判断事件的方法的测试的精确度最好由其接受者操作特征(receiver-operating characteristic，ROC)来描述(尤其参见Zweig1993，Clin.Chem.39：561-577)。ROC图是由在所观察到的整个数据范围上不断改变判定阈值获得的所有灵敏度相对于特异性对的图。诊断方法的临床表现取决于其精确度，即其将对象正确地分配到某种预后或诊断的能力。ROC图通过在适于区分的完整阈值范围将灵敏度相对于1-特异性绘图来表示两个分布之间的重叠。在y轴上是灵敏度或真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性数和假阴性测试结果数之和的比率。这在疾病或病症的存在下也被称为阳性。其单独地由受影响的亚组计算。在x轴上是假阳性分数或1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性数和假阳性结果数之和的比率。其是特异性的指数，并且完全由未受影响的亚组计算。由于真和假阳性分数是完全单独地进行计算，因此通过使用来自两个不同亚组的测试结果，ROC图独立于群组中事件的普遍性。ROC图上的每个点表示对应于特定判定阈值的灵敏度/-特异性对。具有完美辨别(在两个结果分布中没有重叠)的测试具有经过左上角的ROC图，其中真阳性分数为1.0或100％(完美灵敏度)，假阳性分数为0(完美特异性)。没有辨别(两组结果的分布相同)的测试的理论图为从左下角到右上角的45°对角线。大多数图落在这两个极端之间。如果ROC图完全落在45°对角线之下，则这容易地通过将“阳性”标准从“大于”反转为“小于”来矫正，反之亦然。定性地，图越靠近左上角，测试的整体精确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线推导出阈值，允许分别用灵敏度和特异性的适当平衡诊断或预测给定事件。因此，可以优选地通过如上所述建立用于所述群组的ROC并从其推导出阈值量来生成用于本发明方法的参考。根据诊断方法的期望灵敏度和特异性，ROC图允许推导出合适的阈值。优选地，参考量位于这样的值范围内，其表示至少75％的灵敏度和至少45％的特异性、或者至少80％的灵敏度和至少40％的特异性、或者至少85％的灵敏度和至少33％的特异性、或者至少90％的灵敏度和至少25％的特异性。

如本发明所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。

如本发明所使用的术语“系统”涉及至少包含有效地互相联系以允许进行诊断的上述装置的装置系统。在上文结合本发明的方法公开了优选的用于确定基因产物之甲基化状态或量的装置和用于进行比较的装置。如何以操作方式联系装置将取决于设备中包括的装置的类型。例如，在应用用于自动化确定基因产物的甲基化状态或量的装置的情况下，可以通过例如计算机程序来处理由所述自动化操作装置获得的数据以建立诊断。优选地，在这种情况下，装置包含在单设备中。因此，所述设备可以包括用于确定样品中基因产物的甲基化状态或量的分析单元以及用于处理所得数据用于诊断的评估单元。在上文结合涉及本发明方法的实施方案公开了优选的检测装置。在这种情况下，使装置有效地连接，使得系统的使用者由于手册中给出的说明和解释将量的确定结果及其诊断值结合在一起。在这样的实施方案中装置可以呈现为单独的设备并且优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将了解如何联系装置而无需进一步的创造性技能。优选的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，优选地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或上文根据本发明方法提及的评估单元/设备。

本发明的一个具体实施方式中，用于lncRNA作为标志物在制备复发性流产诊断或辅助诊断产品中的应用。

其中，所述lncRNA包括LINC01088；还可以包括其他可作为复发性流产诊断或辅助诊断的ncRNA(miRNA和/或lncRNA)，通过不同ncRNA的优化组合，从而有助于提高检测的特异度和灵敏度，从而为临床医生准确诊断复发性流产，及时采取防治方案提供支持，从而降低不良妊娠结局的风险。

本发明通过研究发现，与正常妊娠者相比，LINC01088在复发性流产患者的绒毛组织中呈高表达。进一步绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC)，表明LINC01088具有诊断作用，且LINC01088在复发性流产中的诊断的灵敏性与特异性高。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测lncRNA的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断复发性流产。

其中，检测lncRNA的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。

所述产品包括但不限于检测待测样本中所述lncRNA表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。

所述待测样本可为人源样本和非人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者细胞、组织、器官和体液；

其中，所述细胞可以为滋养细胞；

所述组织可以为绒毛组织；

所述器官可以为胎盘或子宫；

所述体液可以为血液、淋巴液、尿液、胃液或唾液，优选为血液；所述血液可以为血清或血浆。采用血液作为待测样品进行检测，对受试者创伤性小，受试者顺从性更佳，同时本发明的LINC01088作为复发性流产标志物在血液中同样具有较高的特异性和灵敏度，同时，通过配合其他复发性流产标志物的联合使用，从而进一步提高检测的特异性和灵敏度。

更进一步的，所述除上述lncRNA生物标志物之外，所述产品还包括目前适于检测复发性流产的其他生物标志物及其组合的物质，所述其他生物标志物包括但不限于，遗传因素相关生物标志物(如染色体易位、嵌合体、缺失或倒位)、子宫解剖结构相关生物标志物(如子宫先天性畸形、子宫颈机能不全、宫腔粘连、子宫肌瘤、子宫腺肌病)、内分泌因素相关生物标志物(如多囊卵巢综合征(PCOS)、催乳素血症、未控制的糖尿病、甲状腺疾病)、感染因素相关生物标志物(如任何能够造成菌血症或病毒血症的严重感染)、免疫功能相关生物标志物(如抗磷脂抗体、抗核抗体、抗DNA抗体、抗精子抗体、抗甲状腺抗体、自然杀伤(NK)细胞数量及活性升高、巨噬细胞功能异常、树突状细胞功能异常、补体系统异常、封闭抗体缺乏、T、B淋巴细胞异常、辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2细胞因子异常等)、血栓前状态相关生物标志物(如Ⅴ因子和Ⅱ因子(凝血素)基因突变、蛋白S缺乏)以及受试者其他全身性疾病等。通过与其他生物标志物组合使用，从而进一步排除其他生理病理状态的干扰，进而提高检测的灵敏性和特异性。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断或辅助诊断复发性流产的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述lncRNA表达水平的检测物质，以及；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述lncRNA表达水平判断所述受试者是否患有复发性流产。

本发明的又一具体实施方式中，以上所述待测样品包括受试者细胞、组织、器官和体液；

其中，所述细胞可以为滋养细胞；

所述组织可以为绒毛组织；

所述器官可以为胎盘或子宫；

所述体液可以为血液、淋巴液、尿液、胃液或唾液，优选为血液；所述血液可以为血清或血浆。采用血液作为待测样品进行检测，对受试者创伤性小，受试者顺从性更佳，同时本发明的LINC01088作为复发性流产标志物在血液中同样具有较高的特异性和灵敏度，通过配合其他复发性流产标志物的联合使用，从而进一步提高检测的特异性和灵敏度。

本发明的又一具体实施方式中，所述lncRNA包括LINC01088；还可以包括其他可作为复发性流产诊断或辅助诊断的ncRNA(miRNA和/或lncRNA)，通过不同ncRNA的优化组合，从而有助于提高检测的特异度和灵敏度，从而为临床医生准确诊断复发性流产，及时采取防治方案提供支持，从而降低不良妊娠结局的风险。

本发明的又一具体实施方式中，以上所述检测物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测lncRNA的表达水平的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述分析单元中，还包括检测与目前适于检测复发性流产的其他生物标志物的物质，所述其他生物标志物包括但不限于，遗传因素相关生物标志物(如染色体易位、嵌合体、缺失或倒位)、子宫解剖结构相关生物标志物(如子宫先天性畸形、子宫颈机能不全、宫腔粘连、子宫肌瘤、子宫腺肌病)、内分泌因素相关生物标志物(如多囊卵巢综合征(PCOS)、催乳素血症、未控制的糖尿病、甲状腺疾病)、感染因素相关生物标志物(如任何能够造成菌血症或病毒血症的严重感染)、免疫功能相关生物标志物(如抗磷脂抗体、抗核抗体、抗DNA抗体、抗精子抗体、抗甲状腺抗体、自然杀伤(NK)细胞数量及活性升高、巨噬细胞功能异常、树突状细胞功能异常、补体系统异常、封闭抗体缺乏、T、B淋巴细胞异常、辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2细胞因子异常等)、血栓前状态相关生物标志物(如Ⅴ因子和Ⅱ因子(凝血素)基因突变、蛋白S缺乏)以及受试者其他全身性疾病等。通过与其他生物标志物组合使用，从而进一步排除其他生理病理状态的干扰，进而提高检测的灵敏性和特异性。

本发明的又一具体实施方式中，所述评估单元具体评估流程包括：

与参照相比，所述受试者的待测样品中的lncRNA表达水平上调，则所述受试者为或候选为复发性流产患者；反之，则所述受试者不为或不候选为复发性流产患者。

其中，“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有复发性流产相关症状并且没有异常的生理及病理学发现，参照也可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出复发性流产之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自若干健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有复发性流产症状，也没有相关生理及病理学发现。

本发明的用于诊断或辅助诊断复发性流产的系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述分析单元以及评估单元的功能即可。所述的分析单元可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等；所述评估单元可以是任何可以实现对分析单元的检测结果进行分析处理而得出复发性流产患病风险评估状况的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将各种可能的检测结果与对应的患病风险情况制定相应的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出复发性流产发病风险评估结果。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诊断或辅助诊断复发性流产的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述lncRNA表达水平，以及；

c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；

与参照中的水平相比，样品中表达水平的上调，则所述受试者为或候选为复发性流产患者；反之，则所述受试者不为或不候选为复发性流产患者。

其中，“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有复发性流产相关症状并且没有异常的生理及病理学发现，参照也可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出复发性流产之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自若干健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有复发性流产症状，也没有相关生理及病理学发现。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述lncRNA作为靶点在复发性流产治疗和/或筛选复发性流产药物中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述复发性流产药物为预防和/或治疗复发性流产的药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述筛选复发性流产药物的方法包括：

1)采用候选物质处理表达和/或含有所述lncRNA的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；

2)完成步骤1)后，检测体系中所述lncRNA的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述DNA的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的复发性流产药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述体系可为细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

本发明的又一具体实施方式中，所述细胞体系中的细胞可以为滋养细胞；

本发明的又一具体实施方式中，所述组织体系中的组织可以为绒毛组织；

本发明的又一具体实施方式中，所述器官体系中的器官可以为胎盘、子宫；

本发明的又一具体实施方式中，所述动物体系中的动物可以为哺乳动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猴、人等。

本发明的又一具体实施方式中，提供抑制所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)促进滋养细胞增殖；

(a2)促进滋养细胞细胞周期进程；

(a3)抑制滋养细胞凋亡；

(a4)促进滋养细胞迁移和/或侵袭；

(a5)抑制Arginase-1表达；

(a6)促进eNOS/NO系统；

(a7)抑制p38，JNK MAPK信号通路；

(a8)预防和/或治疗复发性流产。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括抑制所述lncRNA的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)促进滋养细胞增殖；

(a2)促进滋养细胞细胞周期进程；

(a3)抑制滋养细胞凋亡；

(a4)促进滋养细胞迁移和/或侵袭；

(a5)抑制Arginase-1表达；

(a6)促进eNOS/NO系统；

(a7)抑制p38，JNK MAPK信号通路；

(a8)预防和/或治疗复发性流产。

本发明的又一具体实施方式中，所述抑制所述lncRNA的表达水平的物质可以以lncRNA为靶序列且能够抑制所述lncRNA表达的干扰分子，具体可包括shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)，dsRNA、微小RNA、反义核酸，或，能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA，dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；还可以包括化合物类抑制剂。

本发明的又一具体实施方式中，提供促进所述lncRNA的表达水平的物质在制备产品中的应用。

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制滋养细胞增殖；

(b2)抑制滋养细胞细胞周期进程；

(b3)促进滋养细胞凋亡；

(b4)抑制滋养细胞和/或侵袭；

(b5)促进Arginase-1表达；

(b6)抑制eNOS/NO系统；

(b7)激活p38，JNK MAPK信号通路；

(b8)构建复发性流产动物模型。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括促进所述lncRNA的表达水平的物质；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(b1)抑制滋养细胞增殖；

(b2)抑制滋养细胞细胞周期进程；

(b3)促进滋养细胞凋亡；

(b4)抑制滋养细胞和/或侵袭；

(b5)促进Arginase-1表达；

(b6)抑制eNOS/NO系统；

(b7)激活p38，JNK MAPK信号通路；

(b8)构建复发性流产动物模型。

促进所述lncRNA的表达水平的物质包括采用基于基因特异性Mimics技术上调lncRNA表达和/或促进其活性的物质；如上调lncRNA表达的启动子或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂。

本发明的又一具体实施方式中，上述产品可以为药物。

所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。

所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肤、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

所述药物还可与其他预防和/或治疗复发性流产的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。

本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

一、实验方法

1、滋养细胞系的培养

滋养细胞系HTR-8/SVneo(HTR8)、JAR以及HEK293T细胞分别培养于含有10％FBS的DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基以及DMEM培养基中，置于37℃、5％CO

2、临床标本的收集

自2017年9月至2019年12月自山东大学第二医院收入复发性流产患者绒毛组织标本25例(6-10周)，以及正常妊娠者的绒毛组织标本23例(6-10周)。复发性流产患者纳入标准为2次或2次以上连续流产，且排除基因缺陷、感染、妇科炎症以及肿瘤等明确病因。提取新鲜组织标本的总RNA、蛋白与组织研磨液备用，用以后续实验。该研究已获得山东大学第二医院伦理委员会的批准。每个研究对象均知情同意。

3、滋养细胞转染

对生长状态良好的滋养细胞进行细胞转染，分别转染LINC01088的过表达质粒，转染24小时后，收集提取细胞的总RNA或蛋白。

4、建立LINC01088敲除的细胞系

设计合成针对LINC01088的sgRNA(single guide RNA，向导RNA)，将其分别构建入慢病毒载体pLenti CRISPR V2(Hu6-sgRNAEF1a-CAS9-puro)中。将293T细胞接种在10cm细胞培养皿中，将300μl缓冲液与10μg sgRNA、10μg psPAX2、4μg pMD2.G混匀后，再与30μljetPRIME转染试剂混匀，加入细胞中，48小时后，收集富含病毒的细胞培养上清，立即用4℃离心机8000转，20分钟离心，取上清，分装后冻存于-80℃。滋养细胞接种12-16小时后，加入7mL新鲜培养基和50μg Polybrene，以及3mL病毒液，感染24小时后，更换新鲜培养基。感染48小时后，加入8μg/mL嘌呤霉素，每隔一天更换新鲜培养基(含8μg/mL嘌呤霉素)。嘌呤霉素筛选7天后，获得LINC01088敲除的稳定表达细胞株。

5、荧光定量PCR

提取转染后的滋养细胞或新鲜绒毛组织标本中的总RNA，采用东洋纺去除基因组的试剂盒对提取的总RNA进行逆转录，逆转录得来的cDNA用来进行荧光定量PCR扩增。并用2

6、CCK8检测

滋养细胞转染24小时后，将滋养细胞以2000个细胞每孔的数量接种于96孔板中，在培养体系内加入10μL CCK8工作液。置于37℃、5％CO

7、EdU检测

滋养细胞转染24小时后，将滋养细胞以2000个细胞每孔的数量接种于96孔板中，在培养体系内加入10μM的EdU试剂，4小时后根据试剂盒步骤进行细胞染色。染色结束后用荧光显微镜观察被染色的细胞数。

8、克隆形成检测

滋养细胞转染24小时后，将滋养细胞以1000个细胞每孔的数量接种于6孔板中，每隔3天换一次液，培养7天后，用甲醇固定细胞，并用0.1％的结晶紫染液进行染色，拍照后用于后续分析。

9、细胞迁移与侵袭检测

培养基与机制胶按照8：1的比例配制，每孔50μl加入Transwell小室中，37℃孵育至少2小时，使机制胶凝固干燥备用。滋养细胞转染24小时后，将100μl含5×10

10、RNA pull-down检测

体外转录lncRNA LINC01088并对lncRNA进行生物素标记。标记好的lncRNALINC01088进行RNA-蛋白pull-down实验。裂解滋养细胞HTR8获得细胞蛋白，将新鲜获得的HTR8蛋白与生物素标记好的lncRNA LINC01088以及磁珠共同孵育，孵育结束后收集与磁珠结合的蛋白，对蛋白进行蛋白质谱分析以及western-blot检测验证。

11、统计分析

统计分析应用GraphPad Prism 5软件，数据以均数±标准差表示。组间差异采用Student’s t检验、One-way ANOVA和Two-way ANOVA的方法进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

实施例中使用sgRNA和qRT-PCR所用引物见下表1和2。

表1 sgRNA序列

表2 qRT-PCR所用引物对

二、实验结果

1、LncRNA在绒毛组织中的表达

采用荧光定量PCR的方法检测LINC01088在复发性流产患者与正常妊娠者绒毛组织中的表达。发现其在复发性流产患者的绒毛组织中呈高表达(见图1)。

2、建立复发性流产lncRNA诊断模型并评估诊断模型的诊断价值

根据以上lncRNA在绒毛组织中的表达，绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC)，判断LINC01088在复发性流产中的诊断作用(见图2)。其在复发性流产中的诊断的灵敏性与特异性非常高。同时，选择LINC01088进行体外细胞实验研究，探究其在滋养细胞中的作用与功能。

3、LINC01088抑制滋养细胞的增殖

为了明确LINC01088在滋养细胞中的作用，构建LINC01088的过表达质粒(pcDNA3.1-LINC01088)转染至滋养细胞HTR8以及JAR中。同时，构建了HTR8以及JAR中LINC01088敲除的稳转细胞系。对高表达LINC01088的滋养细胞以及LINC01088敲除的滋养细胞进行CCK8、EdU以及克隆形成实验检测。发现LINC01088可以抑制滋养细胞的增殖(见图3)。

4、LINC01088抑制滋养细胞的周期并促进滋养细胞凋亡

进一步检测LINC01088对滋养细胞周期的影响，发现过表达LINC01088的滋养细胞G1期细胞明显增多，而S期细胞减少。为了进一步检测LINC01088对滋养细胞G1/S期的影响，在滋养细胞转染质粒24小时后，使用nocodazole对滋养细胞进行周期同步化处理，转染LINC01088过表达质粒的滋养细胞G1期细胞明显增多。同时，发现LINC01088抑制周期相关分子CDK2、CDK4以及cyclinE1表达。也检测了LINC01088对滋养细胞凋亡的影响，结果显示，LINC01088可以促进滋养细胞的凋亡，抑制Bcl2并促进Bax、cleaved caspase3的表达(见图4)。

5、LINC01088抑制滋养细胞的侵袭

为了检测LINC01088对滋养细胞迁移与侵袭的影响，进行了细胞transwell迁移与侵袭实验。如图5所示，LINC01088可以抑制滋养细胞的迁移与侵袭。

6、LINC01088结合并促进Arginase-1的表达，从而间接抑制eNOS/NO系统

细胞核质分离实验证实LINC01088主要表达在细胞核中，进一步进行RNA pull-down实验，发现LINC01088可以与Arginase-1结合。继而在滋养细胞中检测Arginase-1的表达，发现在过表达LINC01088后的滋养细胞中Arginase-1只有蛋白水平明显升高，而RNA水平无明显变化。精氨酸酶与一氧化氮合酶可以竞争性结合精氨酸，其中，精氨酸酶与精氨酸结合产生尿素与鸟氨酸，一氧化氮合酶与精氨酸结合产生一氧化氮，而一氧化氮在促进滋养细胞增殖，侵袭等方面有重要作用。因此，检测了滋养细胞一氧化氮合酶的表达，发现在滋养细胞中，只表达内皮型一氧化氮合酶，且在LINC01088过表达的滋养细胞中，内皮型一氧化氮合酶的表达量下降。同时，在过表达LINC01088的滋养细胞上清中，以及复发性流产患者绒毛组织研磨液中，一氧化氮的含量也是降低的(见图6)。

7、LINC01088通过抑制NO的产生而激活JNK、P38/MAPK信号通路

为了探索LINC01088相关的信号通路，检测了与一氧化氮相关的信号通路(β-catenin，NF-kB，MAPK等通路)分子的表达情况。发现在过表达LINC01088后，只有MAPK家族中的p38与JNK被激活。

LINC01088通过与精氨酸酶1结合并促进精氨酸酶1的蛋白水平的表达，而间接抑制一氧化氮合酶/一氧化氮系统，导致母胎界面一氧化氮的含量降低，从而激活p38，JNKMAPK信号通路，进而抑制滋养细胞的增殖，迁移，侵袭等，最终导致流产的发生。

筛选出在复发性流产早期绒毛组织中高表达的LINC01088，根据以上lncRNA在绒毛组织中的表达，我们绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)并计算曲线下面积(AUC)，以此为根据判断LINC01088在复发性流产中的诊断作用。结果显示LINC01088在复发性流产中作为诊断标志物的灵敏性与特异性较高。

选择LINC01088进行体外细胞实验研究，探究其在滋养细胞中的作用与功能。发现LINC01088可以抑制滋养细胞的增殖、侵袭，抑制滋养细胞的周期并促进滋养细胞的凋亡。在机制研究中，LINC01088可以与精氨酸酶1结合，进而抑制一氧化氮合酶/一氧化氮系统，降低母胎界面中一氧化氮的含量，从而激活p38，JNK MAPK信号通路，进而抑制滋养细胞的增殖，迁移，侵袭等，最终导致流产的发生。

综上，LINC01088可以作为再次发生复发性流产的预测诊断标志物，并成为复发性流产的治疗靶点，在复发性流产的诊断、治疗中发挥重要作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> lncRNA在复发性流产诊治中的应用

<130>

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccgctctg ctgcttcaag cctt 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caccgtgtac ccccttggtg gatag 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccgactct ggctaacaat agagg 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacagggctt agctgtaagg a 21

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<211> 20

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<400> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctggctagtc caaagtctgc ta 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

actctgaagc cgaccagttg gg 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtgctcccg actcctccat ct 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccagaaggg actgaatcgg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtgatgtgga gctgggatgt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cagggccttg agcaccagtt tg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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ttgacttccg caaggacctc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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ctccaaatgt aggggcaggg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

catcatcaag cccgaccctc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

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<211> 21

<212> DNA

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<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 31

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

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<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

tggtgaagac gccagtgga 19