阳春砂根茎多糖及其制备方法和抗氧化的应用

技术领域

本发明涉及天然产物及其制备方法和应用，特别涉及具有抗氧化功效的阳春砂根茎多糖及其制备方法和应用。

背景技术

砂仁为姜科植物阳春砂

多糖是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，具有广泛的生物活性，如：抗氧化、免疫调节、抗肿瘤和降血糖活性等。天然多糖因具有良好的生物活性和无毒性、良好的生物降解性和生物相容性等特点，成为目前国内外研究的热点。关于砂仁多糖的研究较少，且多集中于提取方法和粗多糖的生物活性。由于阳春砂仁是主要的药用部分，一般认为阳春砂果实最具有价值。因此，关于阳春砂除果实外，其他部位多糖的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一种不足，提供一种阳春砂根茎多糖及其制备方法和应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种阳春砂根茎多糖AVRP-1，其制备方法包括：

S1)将阳春砂根茎粉末采用水提醇沉法提取多糖粗提液，分离出沉淀后复溶，采用Sevage试剂除蛋白，干燥后得阳春砂根茎粗多糖；

S2)将所述粗多糖以阴离子交换层析法纯化，经透析和干燥后得AVRPD-1；

S3)使用Sephadex G-100凝胶柱对AVRPD-1进行分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3mL/10 min，10 min/管，收集流出物经冷冻干燥后得到目标阳春砂根茎多糖AVRP-1。

在一些实例中，所述Sevage试剂为氯仿：正丁醇体积比=4:1的混合液。

在一些实例中，所述阴离子交换层析法使用DEAE-52纤维离子交换柱进行分离，依次使用浓度为0、0.1、0.3、0.5、1.0 M的NaCl溶液洗脱，洗脱流速为1 mL/min，10 min/管，收集0.1 M NaCl溶液洗脱下来的组分，浓缩后使用截留分子量为3500 Da的透析袋透析，透析留存物干燥得到阳春砂根茎多糖AVRPD-1。

在一些实例中，所述干燥为冷冻干燥。避免高温对结构的破坏。

在一些实例中，所述阳春砂根茎多糖AVRP-1由摩尔比为4.14:4.98:5.10:23.77:17.30:28.51:16.19的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖这7种单糖组成，糖醛酸含量为43.59%、相对分子质量为3372.01 kDa。

本发明的第二个方面，提供：

一种具有抗氧化功效的组合物，其添加有本发明第一个方面所述的阳春砂根茎多糖AVRP-1。

在一些实例中，所述组合物为口服制剂。

在一些实例中，所述组合物为功能性食品。

在一些实例中，还包括可接受的辅料。

本发明的第三个方面，提供：

本发明第一个方面所述的阳春砂根茎多糖AVRP-1在制备抗氧化添加剂中的应用。

在一些实例中，所述抗氧化添加剂应用于食品。

本发明的有益效果是：

本发明的一些实例，首次分离得到了阳春砂根茎多糖AVRP-1，其中糖醛酸含量为43.59%，经高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定，其相对分子质量为3372.01 kDa，经高效液相色谱法（HPLC）分析，AVRP-1主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖这7种单糖组成，摩尔比为4.14:4.98:5.10:23.77:17.30:28.51:16.19。

本发明一些实例的阳春砂根茎多糖AVRP-1具有抗氧化活性，对DPPH和羟自由基的半数有效浓度 (EC

本发明的一些实例，可以更为充分地利用阳春砂，利于变废为宝，提高阳春砂整体的经济价值，利于增收。

附图说明

图1是阳春砂根茎多糖AVRP-1的DEAE纤维柱层析洗脱图；

图2是阳春砂根茎多糖AVRP-1的Sephadex G-100分子筛洗脱图；

图3是阳春砂根茎多糖AVRP-1的HPGPC洗脱曲线（A）和葡聚糖标准品标准曲线图（B）；

图4是阳春砂根茎多糖AVRP-1的单糖组成图（A）和9种标准品的液相色谱图（B）；

图5是阳春砂根茎多糖AVRP-1的红外光谱图；

图6是阳春砂根茎多糖AVRP-1的抗氧化能力测定图，其中，A是AVRP-1对DPPH清除率的图；B是AVRP-1对羟自由基清除率的图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作特别说明的情况下，本发明所采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

阳春砂根茎多糖AVRP-1的制备

S1) 称取200 g粉碎后的阳春砂根茎粉末，加入4 L 95%乙醇，80 ℃回流提取3 h，重复操作3次，最后将粉末烘干，得阳春砂根茎脱脂粉末。200 g阳春砂根茎脱脂粉末加4 L水，95 ℃提取3 h，重复3次，再将水提液于60 ℃下减压浓缩，得浓缩液。向浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，于4 ℃静置12 h，离心收集沉淀。将沉淀复溶于蒸馏水中，得多糖溶液，向溶液中加入4倍体积的Sevage试剂（氯仿-正丁醇 4:1/v/v），剧烈震荡后离心，取上清液，重复操作，直至溶液中无变形蛋白质出现，冻干后得AVRP；

S2) 称取AVRP 100 mg，配制成浓度为20 mg/mL 的溶液，经DEAE-52纤维素离子交换柱分离，依次用浓度为0、0.1、0.3、0.5、1.0 M NaCl溶液进行洗脱，洗脱流速为1 mL/min，10 min/管，洗脱曲线如图1所示；使用全自动馏分收集器收集，采用苯酚-硫酸法进行监测，得到0和0.1 M NaCl洗脱下的2个组分，收集含量更多的0.1 M NaCl溶液洗脱下来的组分，60 ℃减压浓缩，用截留分子量为3500 Da的透析袋透析，冷冻干燥得AVRPD-1；

S3) 取AVRPD-1 20 mg，配制成5 mg/mL的溶液，经葡聚糖凝胶Sephadex G-100柱分离，蒸馏水洗脱，洗脱流速为3 mL/10 min，洗脱时间为10 min/管，洗脱曲线如图2所示；使用全自动馏分收集器收集，采用硫酸-苯酚法测多糖含量，合并同一组份，经浓缩、冷冻干燥后得到阳春砂根茎多糖AVRP-1。

阳春砂根茎多糖AVRP-1的组分测定

采用硫酸苯酚法测定AVRP-1的总糖含量，Bradford法测定AVRP-1的蛋白质含量，

阳春砂根茎多糖AVRP-1的分子量测定

利用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定样品纯度及相对分子质量。

取已知相对分子量（

结果如图3所示，由结果可知，AVRP-1只有单一的洗脱峰，且峰型对称，可以证明AVRP-1为纯多糖。线性回归方程为y=-0.7494x+10.332，R

阳春砂根茎多糖AVRP-1的单糖组成分析

采用PMP柱前衍生化-高效液相色谱法（HPLC）测定AVRP的单糖组成。

混合标准单糖的PMP衍生化：分别取0.05 mL 2 mM的单糖标准品（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖）溶液于耐压管中混合，加入配制好的0.5 M PMP甲醇溶液和0.3 M NaOH溶液各0.45 mL，混匀后于70 ℃反应30min，冷却后加入0.46 mL 0.3 M的HCl溶液中和，然后加入1 mL三氯甲烷溶液，振摇，离心，弃三氯甲烷层，重复3次以去除过量的PMP，水层过0.45 μm滤膜后于HPLC检测。HPLC条件：Shimadzu高效液相色谱仪，Agilent ZORBAX XDB-C

AVRP-1样品的衍生化：称取AVRP-1样品5.0 mg于耐压管中，加入配制好的3 M TFA溶液 2mL，油浴锅内120 ℃水解6 h，冷却后加入甲醇减压浓缩至干，重复3次以除去多余的TFA，加入0.8 mL蒸馏水溶解。取0.1 mL完全水解的AVRP-1样品于反应管中，加入0.5 M PMP甲醇溶液和0.3 M NaOH溶液各0.1 mL，混匀后70 ℃水浴反应30 min，冷却后加入0.105 mL0.3M HCl溶液中和，加入0.2 mL蒸馏水稀释，然后加入0.6 mL三氯甲烷溶液，振摇，离心，弃三氯甲烷层，重复3次以除去过量的PMP，水层过0.45 μm滤膜后于HPLC检测。结果如图4所示，AVRP-1是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖这7种单糖组成，摩尔比为4.14:4.98:5.10:23.77:17.30:28.51:16.19。

阳春砂根茎多糖AVRP-1的红外光谱分析

取AVRP-1干燥粉末，使用傅里叶红外光谱仪（UATR Two, PerkinElmer, theNetherlands）在4000-450 cm

结果如图5所示，AVRP-1在3303.17 cm

阳春砂根茎多糖AVRP-1对DPPH自由基清除能力测定

吸取50 μL 0.1 mM DPPH乙醇溶液于96孔板中，加入50 μL不同浓度（1.0-5.0 mg/mL）的多糖样品溶液，该组设置为样品测定组；以无水乙醇代替DPPH乙醇溶液作样品对照组；以去离子水代替多糖样品溶液作空白对照组；以Vc代替多糖样品溶液作阳性对照。以上各组混合均匀后，避光反应30min，于517 nm处测定吸光值。清除率通过下式计算：

式中，A

结果如图6 A所示，当多糖浓度从1.0增加到5.0 mg/mL时，AVRP-1对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，但随着多糖浓度增加，增长趋势逐渐减小。AVRP-1对DPPH的半数有效浓度（EC

阳春砂根茎多糖AVRP-1对羟自由基清除能力测定

于96孔板的检测孔中依次加入8 μL 18 mM FeSO

式中，A

结果如图6 B所示，当多糖浓度从1.0增加到5.0 mg/mL时，AVRP-1对羟自由基的清除能力逐渐增强，但随着多糖浓度增加，增长趋势逐渐减小，之后趋于平稳。AVRP-1对羟自由基的EC

实验结果表明阳春砂根茎多糖AVRP-1具有良好的抗氧化能力和自由基清除能力。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。