一种用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及益生菌功能性饲料，尤其是涉及一种用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料及其制备方法。

背景技术

近年来，我国对海水鱼的需求量呈增长趋势，因此海水鱼类养殖产量也逐年增长，2017年我国海水鱼类养殖产量141.94万吨，比2016年增加11.05万吨、增长8.44％([1]农业部渔业渔政管理局.2018渔业统计年鉴[M].北京：中国农业出版社，2018)。随着对消费者海水鱼类的需求规模不断地扩大，如何提高饲料的利用效率，促进养殖动物的消化和吸收，以及应对水质恶化、疾病爆发、抗生素滥用等一系列病害成为海水鱼养殖中的主要问题。在生长与消化方面，益生菌在提高养殖动物体重增长率、饲料利用率和消化道消化酶活性起到重要的作用。益生菌释放的酶有助于提高饲料的消化利用率，或对有害微生物释放的有害代谢物进行解毒。Mahmoud利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为饲料添加剂，显著的提高真鲷的生长率、饲料利用率和消化酶活性([2]Mahmoud A.O.Dawood,Shunsuke Koshio,Manabu,Ishikawa,et al Effects ofdietary supplementation of Lactobacillus rhamnosus or/and Lactococcus lactison the growth,gut microbiota and immune responses of red sea bream,Pagrusmajor[J].Fish&Shellfish Immunology,2016,49:275-285)。在水产疾病方面，海水养殖过程中养殖动物都会受到病原菌，病毒和寄生虫的威胁，常见的如鳗弧菌(Vibrioanguillarunm)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)、刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)等。由于病原种类繁多，水体环境复杂多变，大多数药物对各类水产疾病几乎没有很好的治疗效果，而且也易导致病原产生耐药性，因此在海水鱼类养殖上较多采用加强日常管理，预防为主的方案来减少养殖过程中疾病的爆发。益生菌可以针对海水鱼类养殖过程中常见的细菌性肠胃炎，肠道菌群紊乱产生的死亡，替代抗生素引起的肠道菌群失调，病原菌耐药性的产生，在促进养殖动物生长，提高其免疫力，预防病害发生，改善水质等方面发挥至关重要的作用，对促进海水鱼类健康养殖具有重大的意义。

益生菌是活菌制剂，世界卫生组织(WTO)和联合国粮农组织(FAO)对将益生菌定义，定义为一种具有活性的微生物，当适量使用时，可以赋予宿主健康([3]HOTEL A CP.Health and nutritional properties of probiotics in food including powdermilkwith live lactic acid bacteria[M].GILLILANDSE,MORELLIL,REID G.Joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties ofprobiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria.Roma:FAO,2001:1-33)。水产益生菌是一种可以改善宿主体内和外界生活环境菌落结构的活性微生物，能够提高宿主的饲料利用率、增强抗病力([4]Verschuere L,Heang H,Criel G,etal.Selected bacterial strains protect Artemia spp.from the pathogenic effectsof Vibrio proteolyticus CW8T2[J].Applied&Environmental Microbiology,2000,66(3):1139)。水产益生菌主要通过与病原竞争营养物质和黏附点或分泌抑菌代谢产物来抑制病原菌生长，或是提高饲料转化率提高宿主生长速率和调节宿主肠道菌群，再者是调节、稳定宿主的免疫系统来对宿主产生益生作用。1896年，Kozasa([5]Kozasa M.Toyocerin(Bacillus toyoi)as growth promotor for animal feeding[J].Microbiol AlimentNutr,1986,4(2):121-135)首次利用陆源芽抱杆菌(Bacillus toyoi)处理日本鳗鲡降低了由于感染爱德华氏菌而引起的死亡后，益生菌在水产研究方面得到快速发展。Paula([6]Paula SimóMirabet,Piazzon M C,Calduchginer J A,et al.Sodium salt medium-chainfatty acids and Bacillus-based probiotic strategies to improve growth andintestinal health of gilthead sea bream(Sparus aurata)[J].Peerj,2017,5(12):1-27)使用解淀粉芽孢杆(Bacillus amyloliquefaciens)投喂金头鲷，研究表明能够显著提高养殖动物的生长性能。根据中华人民共和国农业部公告第2045号《饲料添加剂品种目录(2013)》现阶段我国农业部饲料添加剂名录中批准使用的益生菌种类包括了芽孢杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、假单胞菌等共有34种微生物。

目前，针对海水鱼养殖的益生菌及其制备存在以下几个问题：

1、饲料制粒过程中由于高温易使益生菌失活。

2、由于宿主消化道酸性环境及消化酶的降解作用，大部分益生菌不能以活菌状态到达肠道，或在肠道粘膜上定植，发挥有效的益生作用。

3、水产生物养殖用的活菌制剂多为胶囊或液体或菌体干粉形式，应用方式多直接投喂，或与饲料混合进行投喂。但存在养殖动物拒食、益生菌无法与饲料粘合不能进入宿主体内发挥作用、益生菌外流至水体等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供具有效果稳定、针对性强、不污染养殖环境等优点的一种用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料。

本发明的另一目的在于提供用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料的制备方法。

所述用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料的组份按质量比为：益生菌干粉︰水︰预混料＝(0.1～1)︰(1～10)︰(10～100)。

所述益生菌为芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)A3440，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253；所述益生菌的浓度为1×10

所述预混料可采用厦门市嘉康饲料有限公司生产的海水鱼类专用预混料。

所述用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料的制备方法，包括以下步骤：

1)益生菌发酵

将益生菌经2216E固体培养基活化后，接种于种子液体发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期得种子液，再将种子液接种于发酵罐中进行发酵；

在步骤1)中，所述益生菌可为芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)A3440，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253；所述振荡培养的条件可在20～30℃下180～250rpm振荡培养；所述菌体浓度可为1×10

2)益生菌干粉的制备

菌液离心，去上清，得菌泥，在菌泥中添加保护剂混匀，得菌泥-保护剂混合物后预冷，预冷后的菌泥-保护剂混合物冷冻干燥，直至形成粉末状，得益生菌干粉；

在步骤2)中，所述菌泥可由菌液在8000rpm、10℃条件下冷冻离心10min得到；所述保护剂的加入量可为1％～10％，保护剂可为脱脂奶粉等；所述菌泥-保护剂混合物预冷可在-20℃预冷1～2h；所述冷冻干燥可在-80℃干燥4～8h。

3)益生菌功能性饲料的制备

将益生菌干粉、水和预混料混合，制粒，烘干，密封打包、存储于阴凉干燥处，即得用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料。

在步骤3)中，所述益生菌干粉︰水︰预混料的质量比为：(0.1～1)︰(1～10)︰(10～100)；所述制粒可采用TN65-Ⅲ双螺杆膨化机，调整好制粒过程的温度，喂料器的喂料速度、切刀速度、饲料口径等参数进行制粒；制粒参数为：温度90～100℃，饲料口径2.0，喂料速度9.58，切刀速度23.32；所述烘干可置于饲料烘干机中70～80℃烘干；制备好的用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料可使用平板稀释计数法测定饲料中的活菌数。

使用时，根据海水养殖鱼类不同生长阶段和数量所需饲料，按鱼体质量的3％～5％比例投喂。

本发明具有以下突出优点：

1)选自健康海水养殖动物消化道分离的微生物作为肠道益生菌的来源，具有较高的稳定性。

2)本发明中的干粉保护剂(脱脂奶粉)的添加能有效减少菌株在存储过程中数量减少，菌体流失等问题。在不同温度下菌粉存储过程中活菌量变化，在270天的保存过程中益生菌生物量下降了1个数量级。

3)本发明所制备的用于海水鱼类养殖投喂不会因菌体的流失造成对养殖环境二次污染，同时也保证养殖动物进食过程中，益生菌能以饲料为媒介有效进入宿主肠道发挥作用。

4)本发明使用方法简单，对操作者的经验要求不高，便于海水鱼养殖中的应用。

5)本发明针对海水鱼类养殖，利用肠道益生菌，添加保护剂后制成干粉，制成适口性良好的颗粒饲料，具有方便快捷、效果稳定、经济实用的特点。

附图说明

图1为本发明实施例各组存活率比较图。在图1中，不同字母表示差异性显著。

图2为本发明实施例各组体长增长率比较图。在图2中，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图3为本发明实施例各组体长特定增长率比较图。在图3中，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图4为本发明实施例各组饵料系数比较图。在图4中，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图5为本发明实施例各组胃蛋白酶活性比较图。在图5中，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图6为本发明实施例各组攻毒后存活率比较图。在图6中，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图7为本发明实施例不同存储条件下菌粉活菌量变化。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明所述用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料实施例的组份按质量比为：益生菌干粉︰水︰预混料＝(0.1～1)︰(1～10)︰(10～100)。

所述益生菌为芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)A3440，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253；所述益生菌的浓度为1×10

所述预混料的成分如表1。

表1

所述预混料可选择厦门市嘉康饲料有限公司生产的海水鱼类专用预混料。

所述用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料的制备方法包括以下步骤：

1)益生菌发酵

将益生菌经2216E固体培养基活化后，接种于种子液体发酵培养基中，振荡培养，使菌体浓度达到对数生长期得种子液，再将种子液接种于发酵罐中进行发酵；所述益生菌可为芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)A3440，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5253；所述振荡培养的条件是在20～30℃下180～250rpm振荡培养；所述菌体浓度为1×10

2)益生菌干粉的制备

菌液离心，去上清，得菌泥，在菌泥中添加保护剂混匀，得菌泥-保护剂混合物后预冷，预冷后的菌泥-保护剂混合物冷冻干燥，直至混合物形成粉末状，得益生菌干粉，采用平板稀释计数法，计算菌粉活菌量；所述菌泥由菌液在8000rpm、10℃条件下冷冻离心10min得到；所述保护剂的加入量为1％～10％，保护剂为脱脂奶粉；所述菌泥-保护剂混合物预冷是在-20℃预冷1～2h；所述冷冻干燥是在-80℃干燥4～8h。

3)益生菌功能性饲料的制备

将益生菌干粉、水和预混料混合，制粒，得用于海水养殖鱼用益生菌功能性饲料；所述益生菌干粉︰水︰预混料的质量比为：(0.1～1)︰(1～10)︰(10～100)；所述制粒可采用TN65-Ⅲ双螺杆膨化机，调整好制粒过程的温度，喂料器的喂料速度、切刀速度、饲料口径等参数进行制粒；制粒参数为：温度90～100℃，饲料口径2.0，喂料速度9.58，切刀速度23.32。

4)将制粒好的饲料放于饲料烘干机70～80℃烘干，密封打包、存储于阴凉干燥处，使用平板稀释计数法测定饲料中的活菌数。

以下给出具体实施例。

1)试验用斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)购自福建漳州市漳浦县某养殖场，规格为体重(7.84±0.55)g、体长(6.70±0.18)cm。

2)同温层芽孢杆菌按照不同的浓度添加，根据所述益生菌功能性饲料的制备方法制成不同活菌浓度的益生菌功能性饲料，试验一共分为5个组，见表2。

表2

3)试验分组与日常管理

试验一共4组，A组为对照组，B、C、D为试验组，E组为商品化益生菌丁酸梭菌组。每组3个平行，每个平行放入30尾斜带石斑鱼。将各组斜带石斑鱼放置于半径0.5m，高1m的圆桶进行为期110d的养殖试验。试验前使用漂白粉浸泡养殖桶24h，刷洗干净，晾晒48h后，放养幼鱼。暂养时间7d，暂养期间投喂基础配合饲料。7d后开始投喂添加了益生菌的饲料。24h保持充气。实验采用循环室内海水养殖，每天中午清洗残饵与粪便，更换1/3的海水，每天等量投喂2次(8：30和17：00)，日投喂量为养殖桶中石斑鱼体质量的5％，根据每天摄食情况进行调整。实验过程中发现死鱼，及时清出并记录。

4)攻毒试验

养殖实验结束后，对A、D、E三组采用胸腔注射变形假单胞菌(4×10

表3

5)生长指标的测量

斜带石斑鱼的体长使用游标卡尺测量，大小从吻部至尾鳍基部；体重使用掌上电子天平测量，测量湿重。

各项指标的计算方法如下所示：

WG(增重率)＝100％×(终体重-初体重)/初湿重

SGR(特定生长率)＝100％×[(Ln终体重-Ln初体重)/实验天数]

FCR(饵料系数)＝100％×饲料重/(终体重-初体重)

6)斜带石斑鱼生长结果

①各处理组的存活率比较

通过试验，各组的存活率均在98％以上，基本无死亡情况，各组间无显性差异(P>0.05),如图1所示。

②体重增长率、体重特定生长率与体长增长率、体长特定生长率比较

从试验开始到实验结束的增重率、体重特定增长与体长增长率、体长特定生长率以mean±SD表示，如表4、图2和3所示。结果表明，试验组的幼鱼体重增长率显著高于对照组(P<0.05)，其中D组的幼鱼体重增长率比对照组提高了30.04％，但各试验组间的幼鱼体重增长率差异不显著(P>0.05)；试验组的幼鱼体重特定增长率显著高于对照组(P<0.05)，其中D组的幼鱼体重特定增长率比对照组提高了11.61％；D组的体长增长率、体长特定生长率显著高于各组。说明益生菌能够提高养殖动物的体重增长率。

表4

注：同一行中不同字母表示差异显著(P<0.05)

③饵料系数比较

各组饵料系数如图4所示，从饵料系数分析，添加益生菌组的饵料系数高于对照组单从饵料系数，结合增重率来综合来看，添加的益生菌可提高饲料中的蛋白消化，被吸收的蛋白一部分用于宿主生长和用于合成与消化、免疫相关的酶，提高鱼的消化、免疫相关酶量和活性，另一部分用于菌体自身的生长，因此饵料系数会高于对照组，用长远考虑来看，此菌可以被作为饲料益生菌被使用。

④胃蛋白酶比较

各组间的幼鱼消化酶如图5所示，D组的幼鱼胃组织中胃蛋白酶活性显著高于其余各组(P<0.05)，D组幼鱼胃蛋白酶活性比对照组提高了175.95％。结果表明益生菌能够显著的提高幼鱼的蛋白酶消化酶活性，增强消化能力。

⑤攻毒试验结果

攻毒试验结果表明(如图6所示)，益生菌组(D、E组)的存活率显著高于未投喂益生菌A组(P<0.05),存活率D组比A组提高了88.90％。

综上所述，本发明能够很好的提高养殖动物的生长，增强养殖动物胃蛋白酶活性，已经攻毒条件下的存活率，具有方便快捷、效果稳定、经济实用的特点。本发明选自健康海水养殖动物消化道分离的微生物作为肠道益生菌的来源，具有较高的稳定性。本发明中的干粉保护剂(脱脂奶粉)的添加能有效减少菌株在存储过程中数量减少，菌体流失等问题。在不同温度下菌粉存储过程中活菌量变化实验结果见图7，在270天的保存过程中益生菌生物量下降了1个数量级。本发明所制备的用于海水鱼类养殖投喂不会因菌体的流失造成对养殖环境二次污染，同时也保证养殖动物进食过程中，益生菌能以饲料为媒介有效进入宿主肠道发挥作用。