唾液中脱氢表雄酮含量检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种唾液中脱氢表雄酮含量检测方法及试剂盒。

背景技术

脱氢表雄酮(DHEA)是由肾上腺皮质分泌的一种甾体激素，是雄性激素和雌性激素合成的前体物质，具有广泛的生理和病理作用。DHEA被分泌至血液中大部分经过代谢形成结合型DHEA，这些结合型DHEA生理活性较弱，而剩余的DHEA称之为游离型DHEA，主要发挥生理活性的是这类DHEA。血液中游离型DHEA通过唾液腺上皮细胞被动扩散至唾液中，因此唾液中DHEA含量被认为可以用于评估人体中游离DHEA的水平。

传统的用于检测DHEA的方法主要有酶联免疫法和化学发光免疫分析法等，这些方法容易受到样本中DHEA结构类似物的干扰导致检测结果的偏离。近年来，高效液相色谱串联质谱技术被开发应用于检测人体液中DHEA的含量，然而由于DHEA分子结构原因，直接检测会发现DHEA的电离效率不佳，加之其在唾液中含量很低，因此直接检测的灵敏度达不到要求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种唾液中脱氢表雄酮含量检测方法及试剂盒，具有特异性强、灵敏度高的优点。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种唾液中脱氢表雄酮含量检测方法，包括：

标准品配制：取脱氢表雄酮标准品，用乙腈作为溶剂配制1mg/mL的脱氢表雄酮标准品母液后，用乙腈稀释得到100ng/mL脱氢表雄酮标准品溶液；取d6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈作为溶剂配制1mg/mL的内标母液后，用乙腈稀释得到1μg/mL内标溶液，再稀释配制得到2.5ng/mL的实验用内标溶液；

质控品配制：取脱氢表雄酮标准品溶液用唾液空白基质稀释定容得到20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL三个浓度梯度的质控品；

标准品处理：取所述脱氢表雄酮标准品溶液用空白唾液基质溶液定容得到10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL七个浓度梯度的脱氢表雄酮校准溶液，再分别取500μL各浓度的所述脱氢表雄酮校准溶液于2mL的离心管内，于每管中加入20μL所述内标溶液和1mL萃取液，涡旋震荡5min后，在13000r/min转速下离心10min，转移有机相至另一2mL离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2mL离心管，氮气吹干，以100μL60％乙腈水复溶，涡旋震荡1min后，以13000r/min转速离心5min，取20μL上清液采用高效液相色谱串联质谱技术进行分析检测；

唾液样品前处理：取500μL唾液样品于2mL离心管中，加入20μL所述内标溶液和1mL萃取液，涡旋震荡5min后，在13000r/min转速下离心10min，转移有机相至另一2mL离心管，氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，反应完成后向离心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2mL离心管，氮气吹干，以100μL60％乙腈水复溶，涡旋震荡1min后，以13000r/min离心5min，取20μL上清液采用高效液相色谱串联质谱技术进行分析检测；

校准曲线：采用同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴、标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算待测样本中脱氢表雄酮的含量。

作为本发明的一种优选方案，所述采用高效液相色谱串联质谱技术进行分析检测时的色谱条件为：流动相A采用体积比为0.1％甲酸水溶液、流动相B采用浓度为100％的乙腈。

作为本发明的一种优选方案，所述采用高效液相色谱串联质谱技术进行分析检测时的质谱条件为：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，喷雾电压为5500V，碰撞气为8，气帘气为30psi，离子源温度为550℃，离子源气流GS1为70psi、GS2为50psi。

作为本发明的一种优选方案，所述标准品处理步骤与所述唾液样品前处理步骤中，避光水浴反应温度为60℃，反应时长为30min。

作为本发明的一种优选方案，所述空白唾液基质溶液由3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得。

作为本发明的一种优选方案，所述萃取液为甲基叔丁基醚。

作为本发明的一种优选方案，所述衍生剂为以50％甲醇水为溶剂、浓度为50mmol/l的甲氧胺盐酸盐溶液。

作为本发明的一种优选方案，所述方法还包括精密度试验步骤，包括：

取同一唾液样本均分为5-8份作为第一测试样本组，以同位素内标定量法依次测定所述第一测试样本组中脱氢表雄酮的含量，并计算得到批内精密度；

取同一唾液样本均分为5-8份作为第二测试样本组，连续3-5日以同位素内标定量法按照相同时间间隔依次测定所述第二测试样本组中脱氢表雄酮的含量，并计算得到批间精密度。

作为本发明的一种优选方案，所述方法还包括回收率试验步骤，包括：

取一唾液样本分成4份作为第三测试样本组，每份500μl，其中1份不加入标准品，其它3份分别加入低、中、高浓度的标准品，4份测试样本经唾液样品前处理后采用高效液相色谱串联质谱技术上机测定3次后，计算加标回收率。

另一方面，本发明还提供一种唾液中脱氢表雄酮含量检测试剂盒，包括：

流动相，所述流动相包括等体积的体积比为0.1％的甲酸水和100％乙腈；

脱氢表雄酮标准品溶液，所述标准品母液为浓度为100ng/ml脱氢表雄酮的乙腈溶液；

内标溶液，所述内标溶液为浓度为2.5ng/mld6-t脱氢表雄酮的乙腈溶液；

稀释液，所述稀释液包括：3g/L牛血清白蛋白的水溶液和乙腈；

萃取液，所述萃取液为甲基叔丁基醚；

质控品，所述质控品包括用唾液空白基质稀释定容得到20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL三个浓度梯度的脱氢表雄酮溶液。

综上所述，本发明具有如下有益效果：

本发明采用高效液相色谱串联质谱技术将脱氢表雄酮与干扰物分离，再结合同位素内标定量法唾液中脱氢表雄酮的含量进行测定，通过使脱氢表雄酮与甲氧胺反应生成肟酯，显著提高了检测灵敏度，通过采用反应检测模式(MRM)保证了检测方法的特异性，加之在线的色谱分离和同位素内标物的应用，使得潜在的干扰和基体效应得到很好的排除和修正；

同时，经过方法学验证，使用空白唾液基质处理后分析表明，该方法特异性较高，空白样本的谱图中脱氢表雄酮和内标d6-脱氢表雄酮出峰时间处无明显干扰；精密度试验结果表明，批内精密度和批间精密度分别为6.88％和8.92％，满足可接受标准(CV≤15％)，说明该方法稳定性良好；通过低、中、高3个浓度的标准物质的添加进行加标回收率试验，结果显示加标回收率为84.9％-105.5％，满足可接受标准(80％-120％)；

本方法特异性强、灵敏度高，前处理过程较简单，精密度和加标回收率都符合要求，可以用于检测唾液中含量很低的脱氢表雄酮，为评估人体游离脱氢表雄酮的含量提供了一种可靠的定量检测方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中脱氢表雄酮和内标d6-脱氢表雄酮的标准品的总离子色谱图。

图2为本发明实施例中唾液中脱氢表雄酮和内标d6-脱氢表雄酮的总离子色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

一种唾液中脱氢表雄酮含量检测方法，包括：

标准品配制：精确称取10mg脱氢表雄酮标准品，用乙腈作为溶剂溶解定容至10ml，配制得到1mg/mL的脱氢表雄酮标准品母液后，用乙腈稀释定容至100ml得到100ng/mL脱氢表雄酮标准品溶液；精确称取10mgd6-脱氢表雄酮标准品，用乙腈作为溶剂溶解定容至10ml，配制得到1mg/mL的内标母液后，取10μl内标母液用乙腈稀释定容至10ml，得到1μg/mL内标溶液，再取25μl内标溶液，用乙腈稀释定容至10ml，配制得到2.5ng/mL的实验用内标溶液。

质控品配制：分别取2μl、10μl、50μl的100ng/ml的脱氢表雄酮标准溶液，用空白唾液基质稀释定容至10ml，得到QC(L)、QC(M)、QC(H)三个浓度梯度的质控品，QC(L)的浓度为20pg/mL，QC(M)的浓度为100pg/mL、QC(H)的浓度为500pg/mL，其中，空白唾液基质溶液由3g牛血清白蛋白用水溶解定容至1L制得。

标准品处理：分别取1μl、2μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl的浓度为100ng/ml脱氢表雄酮标准品溶液于7个10ml容量瓶，用空白唾液基质溶液定容至刻度，得到10pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL七个浓度梯度的脱氢表雄酮校准溶液；再分别取500μL各浓度的脱氢表雄酮校准溶液于2mL的离心管内，于每管中加入20μL内标溶液和1mL萃取液，用多管涡旋振荡器涡旋震荡5min后，在控温高速离心机中于13000r/min转速下离心10min，转移有机相至另一2mL离心管，采用氮吹仪氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，在水浴锅中避光水浴反应，避光水浴反应温度为60℃，反应时长为30min；反应完成后向离心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2mL离心管，氮气吹干，以100μL60％乙腈水复溶，涡旋震荡1min后，以13000r/min转速离心5min，取20μL上清液采用高效液相色谱串联质谱技术进行分析检测。

唾液样品前处理：取500μL唾液样品于2mL离心管中，加入20μL内标溶液和1mL萃取液，用多管涡旋振荡器涡旋震荡5min后，在控温高速离心机中于13000r/min转速下离心10min，转移有机相至另一2mL离心管，采用氮吹仪氮气吹干，向吹干离心管中加入衍生剂，避光水浴反应，避光水浴反应温度为60℃，反应时长为30min；反应完成后向离心管中加入100μL水，再加入1mL萃取液，涡旋振荡5min，转移有机相至另一2mL离心管，氮气吹干，以100μL60％乙腈水复溶，涡旋震荡1min后，以13000r/min离心5min，取20μL上清液采用高效液相色谱串联质谱技术进行分析检测。

其中，萃取液为甲基叔丁基醚，衍生剂为以50％甲醇水为溶剂、浓度为50mmol/l的甲氧胺盐酸盐溶液，氮气吹干温度为50℃，本实施例中高效液相色谱串联质谱技术采用API5500三重四极杆质谱仪和LC-20ADXR液相色谱系统。

具体色谱条件为：

流动相A：体积比为0.1％的甲酸水；

流动相B：乙腈，纯度为色谱纯；浓度为100％；

色谱柱型号：WatersXBridgeBEHC18，3.5μm,2.1mm*150mm；

采用梯度洗脱方式，如表1所示；

流速为0.2ml/min，柱温为40℃，进样体积为20μl。

表1流动相梯度洗脱参数

具体质谱条件为：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式，喷雾电压为5500V，碰撞气为8，气帘气为30psi，离子源温度为550℃，离子源气流GS1为70psi、GS2为50psi，目标物脱氢表雄酮m/z318.1→286.1，同位素内标d6-脱氢表雄酮m/z324.1→292.1；脱氢表雄酮及内标的去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)、碰撞室射出电压(CXP)如表2所示。

表2脱氢表雄酮及内标的质谱参数

校准曲线：采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标物的浓度比为X轴、标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立标准曲线，计算待测样本中脱氢表雄酮的含量；具体检测结果如图1和图2所示，在10-1000pg/ml范围内，拟合得到的线性方程线性良好，线性相关系数大于0.999，满足定量要求。

本方法还包括精密度试验步骤，包括：

批内精密度计算：取同一唾液样本均分为5-8份作为第一测试样本组，以同位素内标定量法依次测定第一测试样本组中脱氢表雄酮的含量，并计算得到批内精密度，本实施例中唾液样本均分为7份，具体计算结果如表3所示。

表3批内精密度(单位：pg/ml)

批间精密度计算：取同一唾液样本均分为5-8份作为第二测试样本组，连续3-5日以同位素内标定量法按照相同时间间隔依次测定第二测试样本组中脱氢表雄酮的含量，并计算得到批间精密度，本实施例中唾液样本均分为7份，连续测试3日，具体计算结果如表4所示。

表4批间精密度(单位：pg/ml)

本方法还包括回收率试验步骤，包括：

取一唾液样本分成4份作为第三测试样本组，每份500μl，其中1份不加入标准品，其它3份分别加入低、中、高浓度的标准品，4份测试样本经唾液样品前处理后采用高效液相色谱串联质谱技术上机测定3次后，计算加标回收率，根据计算结果，加标回收率在84.9％-105.5％之间，具体结果如表5所示。

表5加标回收率(单位：pg/ml)

综上，本发明具有如下有益效果：

本发明采用高效液相色谱串联质谱技术将脱氢表雄酮与干扰物分离，再结合同位素内标定量法唾液中脱氢表雄酮的含量进行测定，通过使脱氢表雄酮与甲氧胺反应生成肟酯，显著提高了检测灵敏度，通过采用反应检测模式(MRM)保证了检测方法的特异性，加之在线的色谱分离和同位素内标物的应用，使得潜在的干扰和基体效应得到很好的排除和修正；

同时，经过方法学验证，使用空白基质溶液处理后分析表明，该方法特异性较高，空白样本的谱图中脱氢表雄酮和内标d6-脱氢表雄酮出峰时间处无明显干扰；精密度试验结果表明，批内精密度和批间精密度分别为6.88％和8.92％，满足可接受标准(CV≤15％)，说明该方法稳定性良好；通过低、中、高3个浓度的标准物质的添加进行加标回收率试验，结果显示加标回收率为84.9％-105.5％，满足可接受标准(80％-120％)；

本方法特异性强、灵敏度高，前处理过程较简单，精密度和加标回收率都符合要求，可以用于检测唾液中含量很低的脱氢表雄酮，为评估人体游离脱氢表雄酮的含量提供了一种可靠的定量检测方法。

实施例二

一种唾液中脱氢表雄酮含量检测试剂盒，包括：

流动相，流动相包括等体积的体积比为0.1％的甲酸水和100％乙腈；

脱氢表雄酮标准品溶液，标准品母液为浓度为100ng/ml脱氢表雄酮的乙腈溶液；

内标溶液，内标溶液为浓度为2.5ng/ml d6-t脱氢表雄酮的乙腈溶液；

稀释液，稀释液包括：3g/L牛血清白蛋白的水溶液和乙腈；

萃取液，萃取液为甲基叔丁基醚；

质控品，质控品包括用唾液空白基质稀释定容得到20pg/mL、100pg/mL、500pg/mL三个浓度梯度的脱氢表雄酮溶液。

试剂盒具体组成如表6所示：

表6试剂盒组成

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。