编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸及其应用。

背景技术

Leber遗传性视神经病变(Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。

LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中蛋白异常所致。

因此，本领域亟需开发一种治疗效果好的人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的表达体系及制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗效果好的人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的表达体系及制备方法。

本发明的第一方面，一种编码人NADH脱氢酶亚单位1(ND1)蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示；和

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1或2所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1或2完全互补的核苷酸序列。

本发明第二方面提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本发明第一方面所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述融合核酸还包含选自下组的序列：线粒体靶向肽的编码序列、UTR序列、或其组合。

在另一优选例中，所述线粒体靶向肽的编码序列包括：COX10序列、和/或OPA1序列。

在另一优选例中，所述COX10的编码序列具有如SEQ ID NO.:3或4所示的序列。

在另一优选例中，所述OPA1的编码序列如SEQ ID NO.9所示。

在另一优选例中，所述UTR序列包括3’-UTR和/或5’-UTR，较佳地为3’-UTR。

在另一优选例中，所述UTR序列具有如SEQ ID NO.:5所示的序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z0-Z1-Z2-Z3(I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无、或5’-UTR序列；

Z1为线粒体靶向肽的编码序列；

Z2为如权利要求1所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列；和

Z3为3’-UTR序列。

在另一优选例中，所述的Z1为COX10的编码序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为COX10-ND1-UTR。

在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:6所示；其中，

第1-84位为COX10的编码序列；

第85-1041位为编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列；

第1042-2466位为3’-UTR序列。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。

本发明第三方面提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-DJ、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为AAV载体质粒pAAV、pAAV-MCS、pAAV-MCS2、或pAAV-2Aneo。

在另一优选例中，所述载体用于表达重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293T-17细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合，较佳地，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞。

本发明第五方面提供了如本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力和/或治疗视网膜退化性疾病。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

本发明第六方面提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

本发明第七方面提供了一种治疗方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述治疗方法为治疗眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病为遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

本发明第八方面提供了一种重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的制备方法，包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了优化前密码子使用频次。

图2显示了优化后密码子使用频次。

图3显示了ND1优化序列与未优化ND1序列同源性比较。

图4显示了优化的COX10+ND1和未优化的COX10+ND1序列同源性比较。

图5显示了未优化的COX10+ND1和优化COX10+ND1在人HEK293细胞的蛋白表达量分析，上图为Western bolt图谱，下图为灰度分析蛋白表达量。

图6显示了ND1蛋白线粒体标记，分别显示了绿色荧光标记、MitoTracker标记和线粒体共定位。

图7显示了人源性AAV2-ND1在人HEK293细胞内的代谢动力学。

图8显示了人源性rAAV2-ND1在C57BL/6J小鼠眼内玻璃体注射后的mRNA表达量变化。

图9显示了人源性AAV2-ND1在人HEK293细胞内的蛋白表达Western blot图谱。

图10显示了兔子玻璃体注射rAAV2-ND1后细胞因子检查结果，分别为1个月细胞因子检查结果和2个月细胞因子检查结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白基因编码序列进行了针对性优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中进行高效转录和高效表达ND1蛋白的核苷酸序列和融合核酸，并构建了重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的重组表达载体。经过特殊优化后的ND1编码序列(SEQ ID NO.:1或2)的转录效率和翻译效率显著提高，重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白表达量提高了2倍以上。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

术语“人NADH脱氢酶亚单位1蛋白”、“ND1(蛋白)”、“多肽”、“本发明多肽”和“本发明蛋白”可互换使用。

腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV-DJ的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。

核酸编码序列

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中NADH脱氢酶亚单位1蛋白转染效率不高、治疗效果不佳的技术缺陷。本发明提供一种靶向性NADH脱氢酶亚单位1蛋白及其制备方法和应用。经研究发现，本发明优化的ND1基因序列(SEQ ID NO.:1或2)，使ND1蛋白表达效率更高，有更多的ND1蛋白在患者视神经节细胞发挥生理作用。

本发明所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO.:1或2所示。所述编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸，其全长为957bp。在本发明中，所述编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸又称作ND1优化基因或ND1优化核酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1或2所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达ND1蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明ND1蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择HEK细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、HEK293T-17细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。较佳地，所述宿主细胞为(视网膜)神经节细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

序列优化

本发明改变了COX10的线粒体编码序列为核酸编码序列(如SEQ ID NO：3或4所示)且进行ND1核苷酸序列优化(如SEQ ID NO：1或2所示，在本发明中简称优化ND1基因/核酸)，此序列是经过特殊优化，转录效率和翻译效率显著提高如图1和图2所示，优化的ND1和未优化的ND1序列的同源性为79％，如图3所示。

在本发明中，提供了重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白细胞核密码子偏好优化后的序列如SEQ ID NO.:1所示，以及在SEQ ID NO.:1基础上进一步优化的、转录效率和翻译效率高的重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，所述“优化的ND1编码序列”、“优化ND1编码基因”均指一种用于编码重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核苷酸序列，所述的重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:7所示:

MPMANLLLLIVPILIAMAFLMLTERKILGYMQLRKGPNVVGPYGLLQPFADAMKLFTKEPLKPATSTITLYITAPTLALTIALLLWTPLPMPNPLVNLNLGLLFILATSSLAVYSILWSGWASNSNYALIGALRAVAQTISYEVTLAIILLSTLLMSGSFNLSTLITTQEHLWLLLPSWPLAMMWFISTLAETNRTPFDLAEGESELVSGFNIEYAAGPFALFFMAEYTNIIMMNTLTTTIFLGTTYDALSPELYTTYFVTKTLLLTSLFLWIRTAYPRFRYDQLMHLLWKNFLPLTLALLMWYVSMPITISSIPPQT

(SEQ ID NO.:7)。

融合核酸

本发明还提供了一种融合核酸，其包含所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸。

如本文所用，“融合核酸”指由两个或两个以上不同来源的核苷酸序列连接而成的核酸，或者由同一来源但其天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的核酸。本发明的融合核酸所编码的蛋白称作融合蛋白，在本发明中即ND1优化蛋白。

优选地，所述融合核酸在所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸可操作性地连接有线粒体靶向肽的编码序列和/或UTR序列。优选地，当所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸连接了线粒体靶向肽的编码序列时，所述线粒体靶向肽的编码序列为如SEQ ID NO.:3或4所示的COX10基因的线粒体靶向肽的编码序列(简称COX10序列)；当所述的编码ND1蛋白的核酸连接了UTR序列时，所述UTR序列如SEQ ID NO.:5所示。

UTR序列(SEQ ID NO.:5)：

GAGCACTGGGACGCCCACCGCCCCTTTCCCTCCGCTGCCAGGCGAGCATGTTGTGGTAATTCTGGAACACAAGAAGAGAAATTGCTGGGTTTAGAACAAGATTATAAACGAATTCGGTGCTCAGTGATCACTTGACAGTTTTTTTTTTTTTTAAATATTACCCAAAATGCTCCCCAAATAAGAAATGCATCAGCTCAGTCAGTGAATACAAAAAAGGAATTATTTTTCCCTTTGAGGGTCTTTTATACATCTCTCCTCCAACCCCACCCTCTATTCTGTTTCTTCCTCCTCACATGGGGGTACACATACACAGCTTCCTCTTTTGGTTCCATCCTTACCACCACACCACACGCACACTCCACATGCCCAGCAGAGTGGCACTTGGTGGCCAGAAAGTGTGAGCCTCATGATCTGCTGTCTGTAGTTCTGTGAGCTCAGGTCCCTCAAAGGCCTCGGAGCACCCCCTTCCTTGTGACTGAGCCAGGGCCTGCATTTTTGGTTTTCCCCACCCCACACATTCTCAACCATAGTCCTTCTAACAATACCAATAGCTAGGACCCGGCTGCTGTGCACTGGGACTGGGGATTCCACATGTTTGCCTTGGGAGTCTCAAGCTGGACTGCCAGCCCCTGTCCTCCCTTCACCCCCATTGCGTATGAGCATTTCAGAACTCCAAGGAGTCACAGGCATCTTTATAGTTCACGTTAACATATAGACACTGTTGGAAGCAGTTCCTTCTAAAAGGGTAGCCCTGGACTTAATACCAGCCGGATACCTCTGGCCCCCACCCCATTACTGTACCTCTGGAGTCACTACTGTGGGTCGCCACTCCTCTGCTACACAGCACGGCTTTTTCAAGGCTGTATTGAGAAGGGAAGTTAGGAAGAAGGGTGTGCTGGGCTAACCAGCCCACAGAGCTCACATTCCTGTCCCTTGGGTGAAAAATACATGTCCATCCTGATATCTCCTGAATTCAGAAATTAGCCTCCACATGTGCAATGGCTTTAAGAGCCAGAAGCAGGGTTCTGGGAATTTTGCAAGTTACCTGTGGCCAGGTGTGGTCTCGGTTACCAAATACGGTTACCTGCAGCTTTTTAGTCCTTTGTGCTCCCACGGGTCTACAGAGTCCCATCTGCCCAAAGGTCTTGAAGCTTGACAGGATGTTTTCGATTACTCAGTCTCCCAGGGCACTACTGGTCCGTAGGATTCGATTGGTCGGGGTAGGAGAGTTAAACAACATTTAAACAGAGTTCTCTCAAAAATGTCTAAAGGGATTGTAGGTAGATAACATCCAATCACTGTTTGCACTTATCTGAAATCTTCCCTCTTGGCTGCCCCCAGGTATTTACTGTGGAGAACATTGCATAGGAATGTCTGGAAAAAGCTTCTACAACTTGTTACAGCCTTCACATTTGTAGAAGCTTT。

在另一优选例中，在所述融合核酸中，所述COX10的编码序列、所述编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸、所述UTR序列由5’端至3’端依次排列。

在另一优选例中，所述融合核酸的序列如SEQ ID NO.:6所示。具体地，所述融合核酸的核苷酸序列其全长为2466bp，自1bp至84bp位置为优化的COX10序列(共84bp)；85bp至1041bp位置为优化ND1基因，即所述的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸(共957bp)，1042bp至2466bp位置为UTR序列(共1425bp，又称3’UTR)。COX10序列引导ND1蛋白进入到线粒体中，发挥其生理功能；3’UTR是非编码序列，设计在ND1蛋白的后面，其作用是稳定线粒体靶向肽的编码序列和ND1的表达。其中，优化的COX10+ND1和未优化的COX10+ND1序列的同源性为77.91％，如图4所示。

优化的ND1融合核酸序列：(SEQ ID NO.:6)

ATGGCCGCATCTCCGCACACTCTCTCCTCACGCCTCCTGACAGGTTGCGTAGGAGGCTCTGTCTGGTATCTTGAAAGAAGAACTATGCCCATGGCCAACCTGCTGCTGCTGATCGTGCCCATCCTGATCGCCATGGCCTTCCTGATGCTGACCGAGCGCAAGATCCTGGGCTACATGCAGCTGCGCAAGGGCCCCAACGTGGTGGGCCCCTACGGCCTGCTGCAGCCCTTCGCCGACGCCATGAAGCTGTTCACCAAGGAGCCCCTGAAGCCCGCCACCAGCACCATCACCCTGTACATCACCGCCCCCACCCTGGCCCTGACCATCGCCCTGCTGCTGTGGACCCCCCTGCCCATGCCCAACCCCCTGGTGAACCTGAACCTGGGCCTGCTGTTCATCCTGGCCACCAGCAGCCTGGCCGTGTACAGCATCCTGTGGAGCGGCTGGGCCAGCAACAGCAACTACGCCCTGATCGGCGCCCTGCGCGCCGTGGCCCAGACCATCAGCTACGAGGTGACCCTGGCCATCATCCTGCTGAGCACCCTGCTGATGAGCGGCAGCTTCAACCTGAGCACCCTGATCACCACCCAGGAGCACCTGTGGCTGCTGCTGCCCAGCTGGCCCCTGGCCATGATGTGGTTCATCAGCACCCTGGCCGAGACCAACCGCACCCCCTTCGACCTGGCCGAGGGCGAGAGCGAGCTGGTGAGCGGCTTCAACATCGAGTACGCCGCCGGCCCCTTCGCCCTGTTCTTCATGGCCGAGTACACCAACATCATCATGATGAACACCCTGACCACCACCATCTTCCTGGGCACCACCTACGACGCCCTGAGCCCCGAGCTGTACACCACCTACTTCGTGACCAAGACCCTGCTGCTGACCAGCCTGTTCCTGTGGATCCGCACCGCCTACCCCCGCTTCCGCTACGACCAGCTGATGCACCTGCTGTGGAAGAACTTCCTGCCCCTGACCCTGGCCCTGCTGATGTGGTACGTGAGCATGCCCATCACCATCAGCAGCATCCCCCCCCAGACCTAAGAGCACTGGGACGCCCACCGCCCCTTTCCCTCCGCTGCCAGGCGAGCATGTTGTGGTAATTCTGGAACACAAGAAGAGAAATTGCTGGGTTTAGAACAAGATTATAAACGAATTCGGTGCTCAGTGATCACTTGACAGTTTTTTTTTTTTTTAAATATTACCCAAAATGCTCCCCAAATAAGAAATGCATCAGCTCAGTCAGTGAATACAAAAAAGGAATTATTTTTCCCTTTGAGGGTCTTTTATACATCTCTCCTCCAACCCCACCCTCTATTCTGTTTCTTCCTCCTCACATGGGGGTACACATACACAGCTTCCTCTTTTGGTTCCATCCTTACCACCACACCACACGCACACTCCACATGCCCAGCAGAGTGGCACTTGGTGGCCAGAAAGTGTGAGCCTCATGATCTGCTGTCTGTAGTTCTGTGAGCTCAGGTCCCTCAAAGGCCTCGGAGCACCCCCTTCCTTGTGACTGAGCCAGGGCCTGCATTTTTGGTTTTCCCCACCCCACACATTCTCAACCATAGTCCTTCTAACAATACCAATAGCTAGGACCCGGCTGCTGTGCACTGGGACTGGGGATTCCACATGTTTGCCTTGGGAGTCTCAAGCTGGACTGCCAGCCCCTGTCCTCCCTTCACCCCCATTGCGTATGAGCATTTCAGAACTCCAAGGAGTCACAGGCATCTTTATAGTTCACGTTAACATATAGACACTGTTGGAAGCAGTTCCTTCTAAAAGGGTAGCCCTGGACTTAATACCAGCCGGATACCTCTGGCCCCCACCCCATTACTGTACCTCTGGAGTCACTACTGTGGGTCGCCACTCCTCTGCTACACAGCACGGCTTTTTCAAGGCTGTATTGAGAAGGGAAGTTAGGAAGAAGGGTGTGCTGGGCTAACCAGCCCACAGAGCTCACATTCCTGTCCCTTGGGTGAAAAATACATGTCCATCCTGATATCTCCTGAATTCAGAAATTAGCCTCCACATGTGCAATGGCTTTAAGAGCCAGAAGCAGGGTTCTGGGAATTTTGCAAGTTACCTGTGGCCAGGTGTGGTCTCGGTTACCAAATACGGTTACCTGCAGCTTTTTAGTCCTTTGTGCTCCCACGGGTCTACAGAGTCCCATCTGCCCAAAGGTCTTGAAGCTTGACAGGATGTTTTCGATTACTCAGTCTCCCAGGGCACTACTGGTCCGTAGGATTCGATTGGTCGGGGTAGGAGAGTTAAACAACATTTAAACAGAGTTCTCTCAAAAATGTCTAAAGGGATTGTAGGTAGATAACATCCAATCACTGTTTGCACTTATCTGAAATCTTCCCTCTTGGCTGCCCCCAGGTATTTACTGTGGAGAACATTGCATAGGAATGTCTGGAAAAAGCTTCTACAACTTGTTACAGCCTTCACATTTGTAGAAGCTTT

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于ND1蛋白的表达载体，它含有本发明的优化ND1编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码ND1蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码ND1蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12、AAV-DJ)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。质粒较佳地为AAV载体质粒pAAV、pAAV-MCS、pAAV-MCS2、或pAAV-2Aneo。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

许多表达载体可应用ND1蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达ND1蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高ND1蛋白的表达量。

本发明还提供一种重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的制备方法，包括步骤：培养上述的宿主细胞，从而得到重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白。

本发明还提供了一种治疗方法，所述方法包括所述的载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述治疗方法为治疗眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病为遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗遗传性视神经病变，较佳地为Leber遗传性视神经病变(LHON)。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码ND1的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产ND1蛋白或ND1融合蛋白，所述融合蛋白或者含所述融合蛋白的制剂可应用于制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物。

经优化的编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸表达量更高，从而翻译出更多的ND1融合蛋白，而COX10序列可以准确地将ND1融合蛋白定位到线粒体内膜上，因此有更多的ND1蛋白转染到在线粒体中。将含有COX10-优化ND1融合核酸的药剂注入兔眼玻璃体腔中，该药剂在玻璃体腔内保持活力，并转染到视神经细胞。优化ND1核酸编码比现有技术更多的ND1蛋白，其转染效率更高，能较好地治疗Leber遗传性视神经病变。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1.本发明重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白(ND1)编码基因序列进行了特殊优化。与ND1的未优化的DNA编码序列相比，转录效率和翻译效率显著提高，密码子使用更加高效，并且优化后的序列ND1蛋白表达量显著提高、生物活性高。

2.本发明优化后的COX10序列可以准确地将ND1融合蛋白定位到线粒体内膜上，因此有更多的ND1蛋白转染到在线粒体中。

3.本发明优化的ND1编码基因(SEQ ID NO.:1或2)或融合核酸能够非常有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。

4.本发明的MTS-ND1-UTR组合序列或融合核酸能够在细胞和小鼠中高效表达，非常有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。

5.本发明将rAAV2-ND1注射到兔子玻璃体中抽血进行血常规和细胞因子检查，能够非常有效地治疗Leber遗传性视神经病变，并且安全性好。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非特别说明，否则实施例中的材料和试剂均为市售产品。

实验器材

凝胶成像系统：Gene Genius公司；TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)有限公司；Marker：生工生物工程(上海)有限公司；6×DNA Loading Dye：生工生物工程(上海)有限公司；PCR产物纯化回收试剂盒：生工生物工程(上海)有限公司；KpnI/SalI酶：生工生物工程(上海)有限公司；Lipofectamine 2000试剂盒：美国Invitrogen公司。

实施例1质粒的构建和重组腺相关病毒的制备

1.1质粒制备：获取人的ND1核苷酸序列(Gene ID:4535，如SEQ ID NO.:8所示)后，本发明改变了COX10的线粒体编码序列为核酸编码序列(如SEQ ID NO：3或4所示)且进行ND1核苷酸序列优化(如SEQ ID NO：1或2所示，在本发明中简称优化ND1基因/核酸)，此序列是经过特殊优化，转录效率和翻译效率显著提高，优化的COX10+ND1和未优化的COX10+ND1序列的同源性为77.91％，密码子优化后，GC含量从49.45％到64.26％，从而提高基因转录与蛋白质翻译过程的效率。并在优化ND1基因的3’端连接UTR序列(如SEQ ID NO：5所示)，其融合基因(或称融合核酸)的序列如SEQ ID NO.:6所示，所有基因序列均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

合成全长基因，通过限制性内切酶分别酶切融合基因和腺相关病毒载体形成粘性末端，并将融合基因嵌入腺相关病毒载体pAAV，即pAAV-优化ND1(以下简称为pAAV2-优化ND1)。取37℃培养后的含卡那霉素抗生素的LB平板，其中白色菌体为重组克隆菌株。挑取白色的菌落加入到含有卡那霉素100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒。

1.2细胞转染：转染前一天，将HEK293细胞接种于225cm

1.3重组腺相关病毒的收集、浓缩与纯化：

1.3.1病毒的收集：1)准备干冰乙醇浴(或液氮)和37℃水浴；2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中；3)1000rpm/min，离心3分钟，分离细胞和上清，将上清另外存放，细胞用1ml PBS重悬；4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移，冻融四次，冻和融各10分钟，每次融解后稍加震荡。

1.3.2病毒的浓缩：1)10,000g离心去除细胞碎片，将离心上清转移到一个新离心管中；2)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖，颠倒几次以充分混合，37℃孵育30分钟；3)用0.45μm过滤头过滤，取滤出液，即为浓缩的rAAV2病毒。

1.3.3病毒的纯化：1)向病毒浓缩液中添加入终浓度为60％、50％、40％、25％的碘克沙醇；2)在50,000g下离心4小时，以形成密度梯度。收集富集50％碘克沙醇附近有rAAV2-ND1颗粒的组分；3)将病毒用透析管，洗脱10次即为纯化的重组腺相关病毒。

至此，获得浓缩和纯化的重组腺相关病毒rAAV2-ND1和rAAV2-优化ND1。

如本领域技术人员所知，除COX10以外，OPA1也可与本发明的优化ND1基因融合，线粒体靶向肽的编码序列如COX10、OPA1可将优化ND1基因表达的蛋白带入到线粒体内膜上，从而实现蛋白的线粒体靶向表达。

实施例2未优化的COX10+ND1和优化COX10+ND1在人HEK293细胞的蛋白表达

本发明人经过广泛而深入的研究，对重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白基因编码序列进行了针对性优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中进行高效转录和高效表达ND1蛋白的核苷酸序列和融合核酸，并构建了重组人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的重组表达载体。

人胚肾细胞HEK293生长在培养基(DMEM)中，培养在二氧化碳培养箱中，在37的温度下5％的二氧化碳平衡空气孵育。把HEK293细胞分成3组培养，在1组细胞加入PBS，在2组细胞转染pAAV2-未优化的COX10+ND1(MOI＝10000)，在3组细胞转染pAAV2-优化COX10+ND1(MOI＝10000)。转染48小时后，各组提取蛋白进行Western bolt。

分别提取转染未优化的COX10+ND1和优化COX10+ND1的HEK293细胞的ND1蛋白，然后进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，点转移到聚偏氟膜上(Bio-Rad,Her-cules,CA,USA)，用于免疫检测，以β-actin为内参基因，用自动图像分析仪器对薄膜上条带进行观察分析，各蛋白带的积分光密度用归一化法积分，得到相同的样本对应的光学密度值。ND1蛋白表达分析pAAV2-优化COX10+ND1组的灰度值是pAAV2-未优化的COX10+ND1组灰度值的2.1倍，即pAAV2-优化COX10+ND1组的ND1蛋白表量是pAAV2-未优化的COX10+ND1ND1蛋白表量的2.1倍，如图5所示。

实施例3人源性AAV2-ND1在人HEK293细胞的表达和线粒体定位

Leber遗传性视神经病变(LHON)是由于线粒体呼吸链上的起始复合物酶I(NADH脱氢酶)中的亚单位ND1的一个点突变(G11778A)，精氨酸被替代成组氨酸，这个关键部位的点突变导致NADH脱氢酶的活力下降50-80％，ATP生成减少，细胞能量不足，导致视神经节不能有效地传导光电信号。由于LHON是线粒体疾病，基因治疗需要将目的基因ND1导入线粒体，为此在序列N端设计了线粒体定位序列MTS。本实验通过荧光观察，目的蛋白ND1带绿色荧光，可以和线粒体共定位，说明设计的MTS起到了将ND1导入线粒体的作用。为基因治疗Leber遗传性视神经病变提供可行证据。

3.1病毒感染细胞

(1)使用400μg/ml的多聚赖氨酸包被12孔板细胞爬片。使用前用培养基润洗2遍。

(2)在T75培养瓶中分别培养293细胞和RGC-5细胞，当细胞汇合度约90％时，用胰酶消化细胞，细胞计数仪计数。

(3)取适量的细胞，用10％FBS的DMEM培养基重悬细胞至5×10

(4)取上述稀释后的细胞悬液1ml接种在12孔板，混匀后置于CO

(5)按照MOI＝10

(6)在病毒感染48h后，荧光显微镜观察绿色荧光表达情况和细胞状态，并拍照记录。

3.2线粒体染色

(1)称量50μg的线粒体染色剂MitoTracker，加入100.06μl的DMSO溶剂，混匀后分装，-20℃保存。线粒体储存液浓度为1mM。

(2)用培养基按1：3000的比例将线粒体储存液稀释成333nM的工作液。

(3)在37℃，5％CO

(4)弃去染色工作液，使用PBS缓冲液洗2遍。

3.3固定细胞

(1)使用4％多聚甲醛固定液固定细胞30min，0.5ml/孔。

(2)弃去固定液，用适量的PBS洗2遍。

3.4细胞核染色

(1)每孔加入0.3ml的DAPⅠ工作液，室温染色30min。

(2)弃去工作液，PBS洗2遍。

3.5封片

(1)在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，小心的盖上细胞爬片，注意使细胞爬片有细胞的一边接触封片剂。

(2)使用指甲油密封细胞爬片的四周，室温条件下晾干2h。

3.6显微镜观察

实验所用激光共聚焦显微镜为Perkin Elmer的UltraVIEW VoX&IX81，地址在武汉生物技术研究院。激发光波长选择为405nm,488nm,561nm。

全程注意避光，观察完毕后，4℃避光保存。

3.7实验结果

Leber遗传性视神经病变(LHON)是由于线粒体呼吸链上的起始复合物酶I(NADH脱氢酶)中的亚单位ND1的一个点突变(G11778A)，精氨酸被替代成组氨酸，这个关键部位的点突变导致NADH脱氢酶的活力下降50-80％，ATP生成减少，细胞能量不足，导致视神经节不能有效地传导光电信号。由于LHON是线粒体疾病，基因治疗需要将目的基因ND1导入线粒体，为此在序列N端设计了线粒体定位序列MTS。本实验通过荧光观察，目的蛋白ND1带绿色荧光，可以和线粒体共定位，说明设计的MTS起到了将ND1导入线粒体的作用。为基因治疗Leber遗传性视神经病变提供可行证据。

线粒体染色剂MitoTracker标记细胞线粒体(显示红色)，绿色为病毒感染细胞表达的ND1-ZsGreen蛋白，激光共聚焦显微镜下可见，293细胞和RGC-5细胞中表达的ND1蛋白可与线粒体共定位(显示黄色)，表明AAV病毒感染细胞后目的基因ND1在MTS引领下可以进入线粒体翻译表达，如图6所示。

荧光观察的结果显示AAV2-ND1病毒感染细胞后，能够和线粒体共定位，说明包装的AAV2-ND1病毒在线粒体定位序列MTS的引领下能够将目的基因带入线粒体中表达，为基因治疗Leber遗传性视神经病变提供可行证据。

实施例4人源性AAV2-ND1在人HEK293细胞内的代谢动力学

为了研究AAV2-ND1病毒感染细胞后目的基因ND1 mRNA随时间的变化，通过收集不同时间点不同感染复数下的细胞，提取RNA，反转录为cDNA，RT-PCR检测mRNA表达量，通过相对法计算出ND1的表达量随时间的变化。

RT-PCR是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增PCR相结合的技术。AAV2-ND1病毒感染细胞后，在细胞核中进行转录成mRNA。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。通过检测不同时间点，不同感染复数(MOI)下人源性ND1的mRNA表达量，研究AAV2-ND1在细胞中代谢动力学。

4.1细胞感染

(1)293细胞在T75培养瓶中约90％汇合度时，胰酶消化细胞，细胞计数仪计数。

(2)取适量的细胞，用10％FBS的DMEM培养基重悬细胞至5×10

(3)使用12孔板接种细胞，按照1ml/孔的体积接种步骤2中的稀释后的细胞悬液，混匀后37℃、5％CO2条件下培养过夜。

(4)按照MOI＝10

(5)在病毒感染48h后，荧光显微镜观察绿色荧光表达情况和白光细胞状态，并拍照记录。

4.2RNA提取

(1)用枪吸取上清，加入1ml裂解液RZ，混匀后转移至1.5mlEP管。加裂解液RZ前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

(2)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min。

(3)4℃ 12,000rpm离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50％。把水相转移到新管中，进行下一步操作。

(4)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃ 12,000rpm离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，请分两次转入吸附柱CR3中，4℃ 12,000rpm离心30sec，弃掉收集管中的废液。

(5)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃ 12,000rpm离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中。

(6)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃ 12,000rpm离心30sec，弃废液。

(7)重复操作步骤6。

(8)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃ 12,000rpm离心2min，去除残余液体。

(9)将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加40μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃ 12,000rpm离心2min。

4.3反转录：

(1)反应体系：

(2)反应条件：

4.4RT-PCR：

(1)序列信息

(2)反应体系和混合液配制：

(3)反应条件

(4)相对表达量计算：

相对表达量＝2-

4.5结果

通过RT-PCR检测不同时间点，不同MOI条件下感染的细胞中人源性ND1的mRNA表达量，结果显示在MOI＝10

实施例5人源性rAAV2-ND1在C57BL/6J小鼠眼内玻璃体注射后的探索性代谢动力学实验

本实验的目的是AAV2-ND1病毒玻璃体腔注射小鼠后，30天内取材，通过PCR检测目的基因ND1的表达量。

5.1、野生型C57BL/6J小鼠玻璃体腔给药

小鼠随机分组，2只/笼，分为给药后1天组、5天组、10天组、30天组。给药rAAV2-ND1体积1μL，玻璃体下注射。到期后处死不同组别的小鼠，获取眼球样本，进行相关的检测分析。

5.2、总RNA的提取

(1)取组织于研钵中，加液氮研磨，加入1ml裂解液RZ，室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。

(2)4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的管子中。

(3)加入200μl氯仿，盖好盖子，剧烈振荡15sec，室温放置3min。

(4)4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

(5)缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，转移到吸附柱CR3，4℃，12000rpm离心30sec。

(6)向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液。

(7)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW,室温静置2min，4℃，12000rpm离心30sec，弃废液。

(8)重复步骤7。

(9)将吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残留液体。

(10)将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加入40μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min。

5.3、RNA浓度测定及电泳鉴定

取2μl样品于TECAN酶标仪上进行浓度测定。并取3μl跑电泳鉴定。

5.4、反转录体系

反应体系：

5.5、RT-PCR：

反应体系：

5.6结果

结果显示给药1个月的小鼠给药眼检测到ND1基因的从7天开始到30天，持续提高表达，说明AAV-ND1病毒可在小鼠眼球中表达，如图8所示。

实施例6人源性AAV2-ND1在人HEK293细胞内的蛋白表达

研究AAV2-ND1病毒感染细胞后目的ND1蛋白表达情况。

6.1细胞感染

(1)293细胞在T75培养瓶中约90％汇合度时，胰酶消化细胞，细胞计数仪计数。

(2)取适量的细胞，用10％FBS的DMEM培养基重悬细胞至5×10

(3)使用12孔板接种细胞，按照1ml/孔的体积接种步骤2中的稀释后的细胞悬液，混匀后37℃、5％CO

(4)按照MOI＝10

(5)在病毒感染48h后，提取总蛋白。

6.2、Western blot检测ND1蛋白：

1、用RIPA和PBS配置不同浓度的裂解液，并加入蛋白酶抑制剂保护蛋白，摸索蛋白裂解条件。细胞样品选用30％的裂解液冰上裂解15min，；

2、4℃ 12,000rpm离心5min，将上清转移到新的试管中；

3、BCA法测定蛋白浓度；

4、按总蛋白10ug计算蛋白上样量，加入5*蛋白上样缓冲液，100℃金属浴10min，冷却后上样；

5、10％的SDS蛋白胶的制备及电泳缓冲液和转膜液的配置；

6、蛋白上样后，80V 30min，110V 90min；

7、电泳结束后，转膜，恒流200mA 60min；

8、转膜结束后，用5％的牛奶封闭1h；

9、1:1000孵育一抗(ND1兔一抗)，4℃度过夜；

10、用TBST洗3次后，1：5000孵育二抗(山羊抗兔二抗)，室温2h；

11、TBST洗3次后，加入ECL显色液，用化学发光成像仪进行曝光。

12、IMAGE J软件分析条带强度，统计表达差异。

6.3结果

通过RT-PCR检测48h ND1蛋白表达，说明AAV2-ND1病毒感染细胞有效，如图9所示。

实施例7兔子玻璃体注射rAAV2-ND1安全性研究

7.1兔眼玻璃体腔注射

取8只兔子分为2组，在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射，分为实验组(注射10

7.2血常规检查和细胞因子检查

家兔于给药后1个月，2个月后采取血液，血液样本进行血常规检测和细胞因子检查。

7.3结果

7.3.1血常规检查

兔子玻璃体注射rAAV2-ND1后1个月，2个月后采取血液，血液样本进行血常规检测，结果如表1和表2所示，结果显示，1月和2月正常组与实验组血常规检查(白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积、血小板平均血小板积、血小板压积、红细胞平均体积、平均血红蛋白量、平均血红蛋白浓度、中性粒细胞比率)无明显差异，说明注射rAAV2-ND1是安全的。

表1

表2

7.3.2细胞因子检查

兔子玻璃体注射rAAV2-ND1后1个月，2个月后采取血液，血液样本进行细胞因子检查，结果显示，1月和2月正常组与实验组细胞因子(TNF-α,IFN-γ,IL-6)无明显差异，说明注射rAAV2-ND1兔子没有产生免疫原性，是安全的，如图10所示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 编码人NADH脱氢酶亚单位1蛋白的核酸及其应用

<130> P2019-1966

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgcccatgg ccaacctcct actcctcatt gtacccattc taatcgcaat ggcattccta 60

atgcttaccg aacgaaaaat tctaggctat atgcaactac gcaaaggccc caacgttgta 120

ggcccctacg ggctactaca acccttcgct gacgccatga aactcttcac caaagagccc 180

ctaaaacccg ccacatctac catcaccctc tacatcaccg ccccgacctt agctctcacc 240

atcgctcttc tactatggac ccccctcccc atgcccaacc ccctggtcaa cctcaaccta 300

ggcctcctat ttattctagc cacctctagc ctagccgttt actcaatcct ctggtcaggg 360

tgggcatcaa actcaaacta cgccctgatc ggcgcactgc gagcagtagc ccaaacaatc 420

tcatatgaag tcaccctagc catcattcta ctatcaacat tactaatgag tggctccttt 480

aacctctcca cccttatcac aacacaagaa cacctctggt tactcctgcc atcatggccc 540

ttggccatga tgtggtttat ctccacacta gcagagacca accgaacccc cttcgacctt 600

gccgaagggg agtccgaact agtctcaggc ttcaacatcg aatacgccgc aggccccttc 660

gccctattct tcatggccga atacacaaac attattatga tgaacaccct caccactaca 720

atcttcctag gaacaacata tgacgcactc tcccctgaac tctacacaac atattttgtc 780

accaagaccc tacttctaac ctccctgttc ttatggattc gaacagcata cccccgattc 840

cgctacgacc aactcatgca cctcctatgg aaaaacttcc taccactcac cctagcatta 900

cttatgtggt atgtctccat gcccattaca atctccagca ttccccctca aacctaa 957

<210> 2

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atgcccatgg ccaacctgct gctgctgatc gtgcccatcc tgatcgccat ggccttcctg 60

atgctgaccg agcgcaagat cctgggctac atgcagctgc gcaagggccc caacgtggtg 120

ggcccctacg gcctgctgca gcccttcgcc gacgccatga agctgttcac caaggagccc 180

ctgaagcccg ccaccagcac catcaccctg tacatcaccg cccccaccct ggccctgacc 240

atcgccctgc tgctgtggac ccccctgccc atgcccaacc ccctggtgaa cctgaacctg 300

ggcctgctgt tcatcctggc caccagcagc ctggccgtgt acagcatcct gtggagcggc 360

tgggccagca acagcaacta cgccctgatc ggcgccctgc gcgccgtggc ccagaccatc 420

agctacgagg tgaccctggc catcatcctg ctgagcaccc tgctgatgag cggcagcttc 480

aacctgagca ccctgatcac cacccaggag cacctgtggc tgctgctgcc cagctggccc 540

ctggccatga tgtggttcat cagcaccctg gccgagacca accgcacccc cttcgacctg 600

gccgagggcg agagcgagct ggtgagcggc ttcaacatcg agtacgccgc cggccccttc 660

gccctgttct tcatggccga gtacaccaac atcatcatga tgaacaccct gaccaccacc 720

atcttcctgg gcaccaccta cgacgccctg agccccgagc tgtacaccac ctacttcgtg 780

accaagaccc tgctgctgac cagcctgttc ctgtggatcc gcaccgccta cccccgcttc 840

cgctacgacc agctgatgca cctgctgtgg aagaacttcc tgcccctgac cctggccctg 900

ctgatgtggt acgtgagcat gcccatcacc atcagcagca tcccccccca gacctaa 957

<210> 3

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60

gtctggtatc ttgaaagaag aact 84

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

atggccgcca gcccccacac cctgagcagc cgcctgctga ccggctgcgt gggcggcagc 60

gtgtggtacc tggagcgccg cacc 84

<210> 5

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

gagcactggg acgcccaccg cccctttccc tccgctgcca ggcgagcatg ttgtggtaat 60

tctggaacac aagaagagaa attgctgggt ttagaacaag attataaacg aattcggtgc 120

tcagtgatca cttgacagtt tttttttttt ttaaatatta cccaaaatgc tccccaaata 180

agaaatgcat cagctcagtc agtgaataca aaaaaggaat tatttttccc tttgagggtc 240

ttttatacat ctctcctcca accccaccct ctattctgtt tcttcctcct cacatggggg 300

tacacataca cagcttcctc ttttggttcc atccttacca ccacaccaca cgcacactcc 360

acatgcccag cagagtggca cttggtggcc agaaagtgtg agcctcatga tctgctgtct 420

gtagttctgt gagctcaggt ccctcaaagg cctcggagca cccccttcct tgtgactgag 480

ccagggcctg catttttggt tttccccacc ccacacattc tcaaccatag tccttctaac 540

aataccaata gctaggaccc ggctgctgtg cactgggact ggggattcca catgtttgcc 600

ttgggagtct caagctggac tgccagcccc tgtcctccct tcacccccat tgcgtatgag 660

catttcagaa ctccaaggag tcacaggcat ctttatagtt cacgttaaca tatagacact 720

gttggaagca gttccttcta aaagggtagc cctggactta ataccagccg gatacctctg 780

gcccccaccc cattactgta cctctggagt cactactgtg ggtcgccact cctctgctac 840

acagcacggc tttttcaagg ctgtattgag aagggaagtt aggaagaagg gtgtgctggg 900

ctaaccagcc cacagagctc acattcctgt cccttgggtg aaaaatacat gtccatcctg 960

atatctcctg aattcagaaa ttagcctcca catgtgcaat ggctttaaga gccagaagca 1020

gggttctggg aattttgcaa gttacctgtg gccaggtgtg gtctcggtta ccaaatacgg 1080

ttacctgcag ctttttagtc ctttgtgctc ccacgggtct acagagtccc atctgcccaa 1140

aggtcttgaa gcttgacagg atgttttcga ttactcagtc tcccagggca ctactggtcc 1200

gtaggattcg attggtcggg gtaggagagt taaacaacat ttaaacagag ttctctcaaa 1260

aatgtctaaa gggattgtag gtagataaca tccaatcact gtttgcactt atctgaaatc 1320

ttccctcttg gctgccccca ggtatttact gtggagaaca ttgcatagga atgtctggaa 1380

aaagcttcta caacttgtta cagccttcac atttgtagaa gcttt 1425

<210> 6

<211> 2466

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

atggccgcat ctccgcacac tctctcctca cgcctcctga caggttgcgt aggaggctct 60

gtctggtatc ttgaaagaag aactatgccc atggccaacc tgctgctgct gatcgtgccc 120

atcctgatcg ccatggcctt cctgatgctg accgagcgca agatcctggg ctacatgcag 180

ctgcgcaagg gccccaacgt ggtgggcccc tacggcctgc tgcagccctt cgccgacgcc 240

atgaagctgt tcaccaagga gcccctgaag cccgccacca gcaccatcac cctgtacatc 300

accgccccca ccctggccct gaccatcgcc ctgctgctgt ggacccccct gcccatgccc 360

aaccccctgg tgaacctgaa cctgggcctg ctgttcatcc tggccaccag cagcctggcc 420

gtgtacagca tcctgtggag cggctgggcc agcaacagca actacgccct gatcggcgcc 480

ctgcgcgccg tggcccagac catcagctac gaggtgaccc tggccatcat cctgctgagc 540

accctgctga tgagcggcag cttcaacctg agcaccctga tcaccaccca ggagcacctg 600

tggctgctgc tgcccagctg gcccctggcc atgatgtggt tcatcagcac cctggccgag 660

accaaccgca cccccttcga cctggccgag ggcgagagcg agctggtgag cggcttcaac 720

atcgagtacg ccgccggccc cttcgccctg ttcttcatgg ccgagtacac caacatcatc 780

atgatgaaca ccctgaccac caccatcttc ctgggcacca cctacgacgc cctgagcccc 840

gagctgtaca ccacctactt cgtgaccaag accctgctgc tgaccagcct gttcctgtgg 900

atccgcaccg cctacccccg cttccgctac gaccagctga tgcacctgct gtggaagaac 960

ttcctgcccc tgaccctggc cctgctgatg tggtacgtga gcatgcccat caccatcagc 1020

agcatccccc cccagaccta agagcactgg gacgcccacc gcccctttcc ctccgctgcc 1080

aggcgagcat gttgtggtaa ttctggaaca caagaagaga aattgctggg tttagaacaa 1140

gattataaac gaattcggtg ctcagtgatc acttgacagt tttttttttt tttaaatatt 1200

acccaaaatg ctccccaaat aagaaatgca tcagctcagt cagtgaatac aaaaaaggaa 1260

ttatttttcc ctttgagggt cttttataca tctctcctcc aaccccaccc tctattctgt 1320

ttcttcctcc tcacatgggg gtacacatac acagcttcct cttttggttc catccttacc 1380

accacaccac acgcacactc cacatgccca gcagagtggc acttggtggc cagaaagtgt 1440

gagcctcatg atctgctgtc tgtagttctg tgagctcagg tccctcaaag gcctcggagc 1500

acccccttcc ttgtgactga gccagggcct gcatttttgg ttttccccac cccacacatt 1560

ctcaaccata gtccttctaa caataccaat agctaggacc cggctgctgt gcactgggac 1620

tggggattcc acatgtttgc cttgggagtc tcaagctgga ctgccagccc ctgtcctccc 1680

ttcaccccca ttgcgtatga gcatttcaga actccaagga gtcacaggca tctttatagt 1740

tcacgttaac atatagacac tgttggaagc agttccttct aaaagggtag ccctggactt 1800

aataccagcc ggatacctct ggcccccacc ccattactgt acctctggag tcactactgt 1860

gggtcgccac tcctctgcta cacagcacgg ctttttcaag gctgtattga gaagggaagt 1920

taggaagaag ggtgtgctgg gctaaccagc ccacagagct cacattcctg tcccttgggt 1980

gaaaaataca tgtccatcct gatatctcct gaattcagaa attagcctcc acatgtgcaa 2040

tggctttaag agccagaagc agggttctgg gaattttgca agttacctgt ggccaggtgt 2100

ggtctcggtt accaaatacg gttacctgca gctttttagt cctttgtgct cccacgggtc 2160

tacagagtcc catctgccca aaggtcttga agcttgacag gatgttttcg attactcagt 2220

ctcccagggc actactggtc cgtaggattc gattggtcgg ggtaggagag ttaaacaaca 2280

tttaaacaga gttctctcaa aaatgtctaa agggattgta ggtagataac atccaatcac 2340

tgtttgcact tatctgaaat cttccctctt ggctgccccc aggtatttac tgtggagaac 2400

attgcatagg aatgtctgga aaaagcttct acaacttgtt acagccttca catttgtaga 2460

agcttt 2466

<210> 7

<211> 318

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Met Pro Met Ala Asn Leu Leu Leu Leu Ile Val Pro Ile Leu Ile Ala

1 5 10 15

Met Ala Phe Leu Met Leu Thr Glu Arg Lys Ile Leu Gly Tyr Met Gln

20 25 30

Leu Arg Lys Gly Pro Asn Val Val Gly Pro Tyr Gly Leu Leu Gln Pro

35 40 45

Phe Ala Asp Ala Met Lys Leu Phe Thr Lys Glu Pro Leu Lys Pro Ala

50 55 60

Thr Ser Thr Ile Thr Leu Tyr Ile Thr Ala Pro Thr Leu Ala Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ala Leu Leu Leu Trp Thr Pro Leu Pro Met Pro Asn Pro Leu Val

85 90 95

Asn Leu Asn Leu Gly Leu Leu Phe Ile Leu Ala Thr Ser Ser Leu Ala

100 105 110

Val Tyr Ser Ile Leu Trp Ser Gly Trp Ala Ser Asn Ser Asn Tyr Ala

115 120 125

Leu Ile Gly Ala Leu Arg Ala Val Ala Gln Thr Ile Ser Tyr Glu Val

130 135 140

Thr Leu Ala Ile Ile Leu Leu Ser Thr Leu Leu Met Ser Gly Ser Phe

145 150 155 160

Asn Leu Ser Thr Leu Ile Thr Thr Gln Glu His Leu Trp Leu Leu Leu

165 170 175

Pro Ser Trp Pro Leu Ala Met Met Trp Phe Ile Ser Thr Leu Ala Glu

180 185 190

Thr Asn Arg Thr Pro Phe Asp Leu Ala Glu Gly Glu Ser Glu Leu Val

195 200 205

Ser Gly Phe Asn Ile Glu Tyr Ala Ala Gly Pro Phe Ala Leu Phe Phe

210 215 220

Met Ala Glu Tyr Thr Asn Ile Ile Met Met Asn Thr Leu Thr Thr Thr

225 230 235 240

Ile Phe Leu Gly Thr Thr Tyr Asp Ala Leu Ser Pro Glu Leu Tyr Thr

245 250 255

Thr Tyr Phe Val Thr Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ser Leu Phe Leu Trp

260 265 270

Ile Arg Thr Ala Tyr Pro Arg Phe Arg Tyr Asp Gln Leu Met His Leu

275 280 285

Leu Trp Lys Asn Phe Leu Pro Leu Thr Leu Ala Leu Leu Met Trp Tyr

290 295 300

Val Ser Met Pro Ile Thr Ile Ser Ser Ile Pro Pro Gln Thr

305 310 315

<210> 8

<211> 957

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

atacccatgg ccaacctcct actcctcatt gtacccattc taatcgcaat ggcattccta 60

atgcttaccg aacgaaaaat tctaggctat atacaactac gcaaaggccc caacgttgta 120

ggcccctacg ggctactaca acccttcgct gacgccataa aactcttcac caaagagccc 180

ctaaaacccg ccacatctac catcaccctc tacatcaccg ccccgacctt agctctcacc 240

atcgctcttc tactatgaac ccccctcccc atacccaacc ccctggtcaa cctcaaccta 300

ggcctcctat ttattctagc cacctctagc ctagccgttt actcaatcct ctgatcaggg 360

tgagcatcaa actcaaacta cgccctgatc ggcgcactgc gagcagtagc ccaaacaatc 420

tcatatgaag tcaccctagc catcattcta ctatcaacat tactaataag tggctccttt 480

aacctctcca cccttatcac aacacaagaa cacctctgat tactcctgcc atcatgaccc 540

ttggccataa tatgatttat ctccacacta gcagagacca accgaacccc cttcgacctt 600

gccgaagggg agtccgaact agtctcaggc ttcaacatcg aatacgccgc aggccccttc 660

gccctattct tcatagccga atacacaaac attattataa taaacaccct caccactaca 720

atcttcctag gaacaacata tgacgcactc tcccctgaac tctacacaac atattttgtc 780

accaagaccc tacttctaac ctccctgttc ttatgaattc gaacagcata cccccgattc 840

cgctacgacc aactcataca cctcctatga aaaaacttcc taccactcac cctagcatta 900

cttatatgat atgtctccat acccattaca atctccagca ttccccctca aacctaa 957

<210> 9

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

gtgctgcccg cctagaaagg gtgaagtggt tgtttccgtg acggactgag tacgggtgcc 60

tgtcaggctc ttgcggaagt ccatgcgcca ttgggagggc ctcggccgcg gctctgtgcc 120

cttgctgctg agggccactt cctgggtcat tcctggaccg ggagccgggc tggggctcac 180

acgggggctc ccgcgtggcc gtctcggcgc ctgcgtgacc tccccgccgg cgggatgtgg 240

cgactacgtc gggccgctgt ggcctg 266

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gaggctctgt ctggtatctt gaa 23

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

gtcggggcgg tgatgtag 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

cctgtacgcc aacacagtgc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

atactcctgc ttgctgatcc 20