一种快速检测文物中动物胶原蛋白粘合剂的胶体金免疫层析试纸条的制备方法

技术领域

本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种快速检测文物中动物胶原蛋白粘合剂的胶体金免疫层析试纸条的制备方法

背景技术

中国古代绘画在文化艺术发展的过程中的重要性不言而喻，因此研究绘画对于文化传播、绘画艺术鉴赏是十分有必要的，中华文化底蕴深厚，不同时期的绘画作品中所呈现的文化底蕴、时代特征、民俗风气、政治特征都为我们研究艺术中的时代信息提供了巨大的帮助。

国内考古学家从古代绘画样本中鉴定出几个有机粘合剂分别为卵清蛋白、动物胶、牛奶和鱼胶。有利于我们检测识别各朝文物以及为我们后续对古代绘画样本的修复和保存提供了有效的信息。

胶体金免疫层析技术是一种将抗原抗体免疫反应与胶体金标记示踪技术结合用于抗原、抗体含量定性定量检测的技术。该方法与常用的分析检测技术，如傅里叶红外光谱，拉曼光谱，X-衍射分析、质谱相比，对微痕迹类文物残留物进行分析时，更快速简单高效、灵敏度高、特异性强。但是目前在检测文物中粘合剂成分中还尚未有见应用报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速检测文物中动物胶原蛋白粘合剂的胶体金免疫层析试纸条的制备方法。本发明的试纸条检测方法简单快速，可以用于考古现场的快速检测。

本发明的具体技术方案为：一种快速检测文物中动物胶原蛋白粘合剂的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1）取超声后分散均匀的胶体金8-12ml，加入碳酸钾溶液调节pH为8.0~9.0；

超声分散胶体金可避免胶体金因聚集而降低与抗体的结合成功率。

2）取牛胶原蛋白抗体用PBS缓冲液稀释至浓度为10~20ug/ml；

3）将所得牛胶原蛋白抗体溶液以25-35滴/min的速度滴加至步骤1）所得胶体金溶液中，室温匀速搅拌45~60min；

将抗体逐渐滴加到胶体金溶液中可以防止蛋白质或胶体金聚集沉淀，室温匀速搅拌孵育可以提高抗体与胶体金结合的成功率。

4）向步骤3）所得溶液中加入BSA溶液至其终浓度为0.3-0.5wt%，进行蛋白的封闭，继续搅拌5-15min；

添加 BSA后能使蛋白活性大幅度提高，而且减少其非特异性吸附。

5）向步骤4）所得溶液中加入PEG-20000溶液至终浓度为0.15-0.25wt%，继续搅拌5-15min；

用PEG-20000修饰稳定BSA，具有良好的稳定性、润滑性、分散性等。

6）将步骤5）所得溶液离心处理，弃上清液；

7）沉淀物用含0.8-1.2wt%BSA、0.03-0.05wt%叠氮钠溶液的PBS缓冲液重悬进行防腐处理，冷藏备用；

BSA对沉淀物进行封闭防止其分解和非特异性吸附，沉淀物使用叠氮钠进行防腐处理。

8）用喷金划膜机将步骤7）所得胶体金标记的抗体喷涂到金标垫上，制备金标垫；

9）用喷金划膜机将牛胶原蛋白抗原和质控线抗体划到硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线；

10）组装成胶体金免疫层析试纸条。

作为优选，所述金免疫层析试纸条中，硝酸纤维素膜宽度控制在2.5~3.0cm；吸水垫的宽度为2.0~3.0cm，样品垫宽度为1.5~2.0cm，金标垫的宽度为0.5~1.0cm。

作为优选，所述检测线中牛胶原蛋白抗原的浓度为1~2mg/ml，胶体金标记的抗体浓度为15~30ug/ml，质控线中牛胶原蛋白抗体浓度为1~2mg/ml。

作为优选，：所述PBS溶液的pH为pH=8.0。

作为优选，步骤1）中，所述碳酸钾溶液的浓度为0.08-0.12mol/L。

作为优选，步骤4）中，所述BSA溶液的浓度为8-12wt%。

作为优选，步骤5）中，所述PEG-20000溶液的浓度为8-12wt%。

作为优选，步骤6）中，离心条件为12000~15000rpm，15~30min。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1）本发明的试纸条检测方法简单快速，可以用于考古现场的快速检测，检测过程中不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，5分钟左右即可出现肉眼可见的显色线。

2）胶体金免疫层析试纸标记技术成熟，应用场景广泛，成本低廉，易于进行工业化生产，在现场快速检测的应用前景广阔。

附图说明

图1为实施例1所得试纸条对阳性样本不同浓度梯度的检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

一种快速检测文物中动物胶原蛋白粘合剂的胶体金免疫层析试纸条，包括：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板，其中在PVC底板长1.5cm端下测粘贴样品垫（样品垫下方粘贴吸水垫，吸水垫和样品垫重合1mm）在PVC底板下方距离1.0cm的地方粘贴胶体金垫（胶体金结合垫与样品垫重合1mm）在PVC底板中间2.5cm处粘贴硝酸纤维素膜（上面喷涂有检测线和质控线，硝酸纤维素膜和胶体金垫重合1mm）。在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫（硝酸纤维素膜和吸水垫重合1mm）。将组装好的试纸切成宽4 mm的小条状，然后装在塑料卡里面。

其中，硝酸纤维素膜宽度控制在2.5cm；吸水垫的宽度为2.0cm，样品垫宽度为1.5cm，所述金标垫的宽度为0.5cm。检测线抗原牛胶原蛋白浓度为1mg/ml，胶体金标记的抗体浓度为15ug/ml，质控线抗体浓度为1mg/ml。

一种快速检测文物粘合剂的动物胶原蛋白的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

取超声后分散均匀的胶体金约10ml，加入0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH为8.2。

取牛胶原蛋白抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液（pH8.0）稀释至浓度为15ug/ml。

将牛胶原蛋白抗体以30滴/min的速度滴加进调节好pH的胶体金溶液中，室温匀速搅拌45~60min。

加入浓度10%的BSA溶液至其终浓度为0.4%，此步骤进行蛋白的封闭。继续搅拌10min。

加入浓度10%的PEG-20000溶液至终浓度为0.2%，继续搅拌10min。

将标记好的胶体金在12000rpm下离心30min，弃上清液。

沉淀物用0.01mol/L的PBS（1%BSA，0.04%叠氮钠）重悬，做防腐处理，保存在4℃备用。使用时用原缓冲液复溶。

用喷金划膜机将胶体金标记的抗体喷涂到金标垫上，制备金标垫。

用喷金划膜机将牛胶原蛋白抗原和质控线抗体划到硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线。

按照上述方法组装成试纸条。

采用本实施例所得的试纸条对阳性样本浓度梯度测试，操作简便，结果如图1所示，显示具有出色的灵敏度和较低的检出限。

实施例2

一种快速检测文物中动物胶原蛋白粘合剂的胶体金免疫层析试纸条，包括：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板，其中在PVC底板长1.5cm端下测粘贴样品垫（样品垫下方粘贴吸水垫，吸水垫和样品垫重合1mm）在PVC底板下方距离1.0cm的地方粘贴胶体金垫（胶体金结合垫与样品垫重合1mm）在PVC底板中间2.5cm处粘贴硝酸纤维素膜（上面喷涂有检测线和质控线，硝酸纤维素膜和胶体金垫重合1mm）。在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫（硝酸纤维素膜和吸水垫重合1mm）。将组装好的试纸切成宽4 mm的小条状，然后装在塑料卡里面。

其中，硝酸纤维素膜宽度控制在3.0cm；吸水垫的宽度为2.0cm，样品垫宽度为2.0cm，所述金标垫的宽度为0.5cm。检测线抗原牛胶原蛋白浓度为2mg/ml，胶体金标记的抗体浓度为30ug/ml，质控线抗体浓度为2mg/ml。

一种快速检测文物粘合剂的动物胶原蛋白的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

取超声后分散均匀的胶体金约10ml，加入0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH为8.5。

取牛胶原蛋白抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液（pH8.0）稀释至浓度为30ug/ml。

将牛胶原蛋白抗体以30滴/min的速度滴加进调节好pH的胶体金溶液中，室温匀速搅拌60min。

加入浓度10%的BSA溶液至其终浓度为0.4%，此步骤进行蛋白的封闭。继续搅拌10min。

加入浓度10%的PEG-20000溶液至终浓度为0.2%，继续搅拌10min。

将标记好的胶体金在15000rpm下离心30min，弃上清液。

沉淀物用0.01mol/L的PBS（1%BSA，0.04%叠氮钠）重悬，做防腐处理，保存在4℃备用。使用时用原缓冲液复溶。

用喷金划膜机将胶体金标记的抗体喷涂到金标垫上，制备金标垫。

用喷金划膜机将牛胶原蛋白抗原和质控线抗体划到硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线。

按照上述方法组装成试纸条。

实施例3

一种快速检测文物中动物胶原蛋白粘合剂的胶体金免疫层析试纸条，包括：样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板，其中在PVC底板长1.5cm端下测粘贴样品垫（样品垫下方粘贴吸水垫，吸水垫和样品垫重合1mm）在PVC底板下方距离1.0cm的地方粘贴胶体金垫（胶体金结合垫与样品垫重合1mm）在PVC底板中间2.5cm处粘贴硝酸纤维素膜（上面喷涂有检测线和质控线，硝酸纤维素膜和胶体金垫重合1mm）。在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫（硝酸纤维素膜和吸水垫重合1mm）。将组装好的试纸切成宽4 mm的小条状，然后装在塑料卡里面。

其中，硝酸纤维素膜宽度控制在2.5cm；吸水垫的宽度为2.0cm，样品垫宽度为1.5cm，金标垫的宽度为0.5cm。检测线抗原牛胶原蛋白浓度为2mg/ml，胶体金标记的抗体浓度为20ug/ml，质控线抗体浓度为2mg/ml。

一种快速检测文物粘合剂的动物胶原蛋白的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

取超声后分散均匀的胶体金约10ml，加入0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH为8.0。

取牛胶原蛋白抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液（pH8.0）稀释至浓度为20ug/ml。

将牛胶原蛋白抗体以30滴/min的速度滴加进调节好pH的胶体金溶液中，室温匀速搅拌60min。

加入浓度10%的BSA溶液至其终浓度为0.4%，此步骤进行蛋白的封闭。继续搅拌10min。

加入浓度10%的PEG-20000溶液至终浓度为0.2%，继续搅拌10min。

将标记好的胶体金在12000~15000rpm下离心15~30min，弃上清液。

沉淀物用0.01mol/L的PBS（1%BSA，0.04%叠氮钠）重悬，做防腐处理，保存在4℃备用。使用时用原缓冲液复溶。

用喷金划膜机将胶体金标记的抗体喷涂到金标垫上，制备金标垫。

用喷金划膜机将牛胶原蛋白抗原和质控线抗体划到硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线。

按照上述方法组装成试纸条。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。