适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片及其制备方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片及其制备方法。

背景技术

DNA传感技术在医疗诊断、病原探测、癌症治疗和个性化给药等方面具有重要应用。在2003年，人类基因组计划绘制出了一个人类完整的基因组图谱。为了充分利用这一研究成果，基因测序走进医疗诊断市场，对个人基因进行检测，降低DNA测序的成本，加快DNA检测的迅速成为大家关注的目标。开发出一种灵敏度高、价格低廉、简洁快速的DNA检测手段成为急需解决的问题。

传统的DNA传感方法主要集中于光学或电化学方法，需要用荧光或电化学标记样品，操作复杂、周期长和有害操作者健康。为了解决这些问题，DNA阵列技术、原子力显微镜技术、表面振动检测、毛细管电泳方法等相继被提出来，大大减少了实验操作步骤和难度，提高了传感器的灵敏度。另外，随着微机电加工(MEMS)技术的发展，以微机电加工为核心的微流控分析系统逐渐兴起并且发展迅速。在微流控芯片中对核酸生物分子进行检测，与上述各类检测方法相比，微流控芯片具有小型、便携、快捷、方便、安全性高等优点。在微流控芯片中进行基因检测所需样品量少，可以减少珍贵基因样品消耗，其还具有集成化的特点，能够实现了一体化的操作，有效避免了操作过程中外界环境的干扰。

然而目前的微流控芯片基因检测方法都有一个共同特点，就是需要一个固相表面装载DNA分子探针，而靶DNA分子是通过溶液中的浓度差被动扩散输运向探针。样品在固相表面的扩散速度有限，严重拖慢了DNA分子的杂交速度。同时，固相载体表面的DNA探针浓度、链长、分布等受环境条件影响大，容易引入环境误差，降低灵敏度，并严重影响了实验的稳定性和重复性。因此，需要针对现有技术中存在的微流控芯片基因检测速度慢、误差大和稳定性重复性不好的问题，开发新的核酸检测微流控芯片。

发明内容

为了解决现有技术中存在的检测速度慢、误差大和稳定性重复性不好的问题，本发明提供了一种适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片及其制备方法，该液滴型微流控芯片具有混合杂交速度快、集成度高、误差小和稳定性好的特点，从而加快了检测的速度，并提高了灵敏度和准确性。

本发明提供的一种适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，包括基片和位于所述基片上表面的微流通道片，所述微流通道片包括油相入口管道、水相入口管道、油相过滤栅、水相过滤栅、微液滴形成结构、S型核酸微液滴混合结构和样品出口；

所述微液滴形成结构为T型或者十字形，其包括油相入口端、水相入口端和出口端；

所述油相入口管道的入口端连通有油相入口，所述油相入口管道的出口端连通有所述油相过滤栅的入口端，所述油相过滤栅的出口端连通有所述微液滴形成结构的油相入口端；

所述水相入口管道的入口端连通有水相入口，所述水相入口管道的出口端连通有所述水相过滤栅的入口端，所述水相过滤栅的出口端连通有所述微液滴形成结构的水相入口端；

所述微液滴形成结构的出口端、所述S型核酸微液滴混合结构和所述样品出口之间依次连通；

所述微流通道片的所有部件均是内壁呈亲水性特性的管道结构。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，所述油相入口、所述水相入口、所述样品出口为直径0.6～1.2mm之间的圆柱形；

除所述油相入口、所述水相入口、所述样品出口外，所述微流通道片中其余的供液体流动的管道结构截面均为立方体形，所述立方体形在基片上的高度为1～200μm，宽度为1～300μm。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，所述油相入口的数量为1个，所述水相入口的数量为2个，每个所述水相入口均连通有一个所述水相过滤栅；

当所述微液滴形成结构为十字形，其包括2个油相入口端、1个水相入口端和1个出口端，2个所述油相入口端所在直线与所述水相入口端所在直线垂直，所述油相过滤栅的数量为2个，且对称分布在2个所述水相过滤栅的两侧，所述油相入口分别与两个所述油相过滤栅的入口端连通，2个所述油相过滤栅的出口端分别与所述微液滴形成结构的2个油相入口端连通，所述水相入口与所述微液滴形成结构的水相入口端连通；

当微液滴形成结构为T型，其包括1个油相入口端、1个水相入口端和1个出口端，所述油相入口端所在直线与所述水相入口端所在直线垂直，所述油相过滤栅的数量为1个，且分布在2个所述水相过滤栅的侧方，所述油相入口与所述油相过滤栅的入口端连通，所述油相过滤栅的出口端与所述微液滴形成结构的油相入口端连通，所述水相入口与所述微液滴形成结构的水相入口端连通。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，所述微液滴形成结构的管道宽度在5～100μm，且该管道宽度小于其他管道结构的宽度。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，每个所述过滤栅包括3～6个栅构，每个所述栅构包含一段宽通道和一段窄通道，相邻栅构的所述宽通道、所述窄通道交错设置，多个所述栅构的一侧通过第一长通道连通，且所述第一长通道连通所述油相入口管道的出口端或者所述水相入口管道的出口端，多个所述栅构的另一侧通过第二长通道连通，且所述第二长通道连通所述微液滴形成结构的油相入口端或者水相入口端；所述宽通道、所述第一长通道、所述第二长通道的宽度相同，且所述宽通道宽度大于所述窄通道宽度。优选的，所述宽通道、所述第一长通道、所述第二长通道的宽度均为0.01～1mm，所述窄通道宽度均为0.001～0.2mm。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，所述S型核酸微液滴混合结构的通道总长度在50～100cm。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，所述样品出口直径大于所述油相入口的直径，所述油相入口直径大于所述水相入口直径。优选的，所述样品出口、水相入口和油相入口直径为0.5～1mm。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，所述基片采用玻璃、石英或者硅片，所述微流通道片采用有机聚合物材质。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，所述有机聚合物是聚二甲基硅氧烷或者聚甲基丙烯酸甲酯。

优选的，上述适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片的制备方法如下，包括以下步骤：

(1)微流通道片的制备

利用软光刻的方法在基片上光刻出微流通道片的阳模，在阳模形上浇筑聚有机聚合物液体，固化后揭下阴模，所述阴模即为所述微流通道片；

(2)将基片与所述微流通道片通过氧等离子体键合在一起，烘干24～72h，获得粗芯片；优选的烘干方式为75℃的烘箱中静置24～72h。

(3)微流通道片的管道结构内壁亲水化处理：将牛血清白蛋白溶液充满整个粗芯片，持续处理3h以上，即得到适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)利用本发明的液滴型微流控芯片进行核酸杂交检测时，微液滴体积小，表面积体积比大，且在微流通道中处于滚动涡流状态，所以微液滴内部混合速度快，避免了现有技术中固体探针表面杂交速度慢的问题，大大加快杂交速度，杂交一次所需时间仅为2～4min，大大缩短的杂化时间，提高了检测速度和效率。

(2)由于微液滴的体积非常微小，每个微液滴体积在纳升甚至皮升体积，在微液滴中对DNA分子样品进行操作，所需要的样品量大大减少，有效地节省了稀有的DNA样品。

(3)在微流控芯片内部进行检测，可以有效地避免外界环境的干扰，提高了检测的灵敏度和稳定性。

(4)微流控芯片制备过程采用工业化成熟的MEMS工艺进行加工，能够批量化的生产，大幅度地降低了生产成本。

(5)本微流控芯片具有微型化、集成化的特点，体积小，重量轻，易于携带，操作简单，有利于推广使用，其可广泛应用于人类基因疾病的预防、诊断治疗、病原探测和生命遗传科学等领域。

附图说明

图1是本发明微流控芯片的结构示意图；

图中(A)、(B)分别表示十字形和T型微液滴形成结构时的微流控芯片结构

图2是本发明微流控芯片中微液滴形成图；

图3是核酸微液滴在图1(A)S型核酸微液滴混合结构A区域中的流动混合图，标尺是0.2mm；

图4是非互补链ncDNA在S型核酸微液滴混合结构中杂交荧光图；

(1)～(2)分别对应图1(A)S型核酸微液滴混合结构A、D区；

图5是互补链cDNA在S型核酸微液滴混合结构不同区域的杂交荧光图；

A、B、C、D分别对应图1(A)S型核酸微液滴混合结构A、B、C、D区；标尺均是0.2mm；

图6不同浓度的互补链cDNA在S型核酸微液滴混合结构中杂交产生的荧光强度变化图；

图7是不同浓度的互补链cDNA在图1(A)观察点处杂交产生的荧光强度图；

图8微液滴形成模拟图；

A是水相速度大于油相速度，B是水相速度和油相速度相等，C是水相速度小于油相速度。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片，如图1所示，包括基片和位于所述基片上表面的微流通道片，所述微流通道片包括油相入口管道、水相入口管道、油相过滤栅、水相过滤栅、微液滴形成结构、S型核酸微液滴混合结构和样品出口。油相过滤栅、水相过滤栅的作用是滤样品中的杂质，比如采用食用油作为油相样品的话，就有可能含有一些大的杂质，另外油相过滤栅、水相过滤栅还可以起到初步混合的作用。

所述微液滴形成结构为T型或者十字形，包括油相入口端、水相入口端和出口端；所述油相入口管道的入口端连通有油相入口，所述油相入口管道的出口端连通有所述油相过滤栅的入口端，所述油相过滤栅的出口端连通有所述微液滴形成结构的油相入口端；所述水相入口管道的入口端连通有水相入口，所述水相入口管道的出口端连通有所述水相过滤栅的入口端，所述水相过滤栅的出口端连通有所述微液滴形成结构的水相入口端；所述微液滴形成结构的出口端、所述S型核酸微液滴混合结构和所述样品出口之间依次连通；所述微流通道片的所有部件均是内壁呈亲水性特性的管道结构。

所述油相入口、所述水相入口、所述样品出口为直径0.6～1.2mm之间的圆柱形；除所述油相入口、所述水相入口、所述样品出口外，所述微流通道片中其余的供液体流动的管道截面均为立方体形，所述立方体形在基片上的高度(相当于所述立方体形横截面的一个边长长度)为1～200μm之间，宽度(相当于所述立方体形横截面的另一个边长长度)为1～300μm之间。

所述水相入口用于进含核酸的水相待检样品(作为分散相)，所述油相入口用于进大豆油(作为连续相)；所述油相入口的数量为1个，所述水相入口的数量为2个。每个所述水相入口均连通有一个所述水相过滤栅。所述微液滴形成结构的管道宽度在5～100μm之间，且该管道宽度小于其他管道结构的宽度。当微液滴形成结构为十字形，参见图1(A)，微液滴形成结构包括2个油相入口端、1个水相入口端和1个出口端，微液滴形成结构的2个所述油相入口端所在直线与所述水相入口端所在直线垂直，所述油相过滤栅的数量为2个，且对称分布在2个所述水相过滤栅的两侧，所述油相入口分别与两个所述油相过滤栅的入口端连通，2个所述油相过滤栅的出口端分别与所述微液滴形成结构的2个油相入口端连通，所述水相入口与所述微液滴形成结构的水相入口端连通。当所述微液滴形成结构为T型，参见图1(B)，微液滴形成结构包括1个油相入口端、1个水相入口端和1个出口端，微液滴形成结构的所述油相入口端所在直线与水相入口端所在直线垂直，所述油相过滤栅的数量为1个，且分布在2个所述水相过滤栅的侧方，所述油相入口与所述油相过滤栅的入口端连通，所述油相过滤栅的出口端与微液滴形成结构的油相入口端连通，所述水相入口与所述微液滴形成结构的水相入口端连通。

每个所述过滤栅包括3～6个栅构，每个所述栅构包含一段宽通道和一段窄通道，相邻栅构的所述宽通道、所述窄通道交错设置，多个所述栅构的一侧通过第一长通道连通，且所述第一长通道连通所述油相入口管道的出口端或者所述水相入口管道的出口端，多个所述栅构的另一侧通过第二长通道连通，且所述第二长通道连通所述微液滴形成结构的油相入口端或者水相入口端；所述宽通道、所述第一长通道、所述第二长通道的宽度相同，且所述宽通道宽度大于所述窄通道宽度。优选的，所述宽通道、所述第一长通道、所述第二长通道的宽度均为0.01～1mm，所述窄通道宽度均为0.001～0.2mm。

S型核酸微液滴混合结构的S型弯曲排列的通道每根长1.5cm，总长度在50～100cm，比如S型核酸微液滴混合结构的的S型弯曲排列的通道共39条，总长度为1.5cm*39＝58.5cm。所述S型核酸微液滴混合结构通道的宽度大于所述微液滴形成结构处的通道宽度，S型核酸微液滴混合结构用于观察核酸杂交情况。

所述样品出口位于微流通道片宽度中点附近，其大于所述油相入口的直径，所述油相入口直径大于所述水相入口直径。优选的，所述样品出口、水相入口和油相入口直径为0.5～1mm。

构成微流控芯片的材料可以是玻璃、石英、硅片或者有机聚合物。所述的有机聚合物可以是聚二甲基硅氧烷和聚甲基丙烯酸甲酯。

需要说明说明的是，在本发明中，所有管道结构的作用是供液体流动，采用现有技术的软光刻方法制备，管道结构的外周为PDMS，底面是基片，微流通道片和基片之间是通过等离子体键合的。

实施例2

一种实施例1中适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

(1)微流通道片的制备

按照图1(A)所示结构，采用绘图软件CorelDRAW设计出微流控芯片，菲林打印输出模板，利用软光刻的方法在硅片上光刻出微流通道片的阳模，光刻胶采用SU8-2100。本实施例中，采用微液滴形成结构产生微液滴，S形的微液滴混合通道的总长度为2.02cm×31＝62.62cm，共计31个分支沟道，单个分支沟道宽度0.1mm，每个过滤栅含有5个栅构，栅构中宽通道宽度0.1mm，窄通道宽度0.04mm。在阳模形上浇筑聚二甲基硅氧烷(PDMS：Polydimethylsiloxane)液体，固化后得到PDMS阴模，揭下PDMS阴模，所述PDMS阴模的一侧具有微流通道；再利用打孔器打孔制备出水相入口、油相入口以及样品出口，即可得到微流通道片。

(2)以硅片或者玻璃载玻片作为微流通道片基片，将基片与微流通道片通过氧等离子体键合在一起，放在75℃的烘箱中静置24～72h。

(3)微流通道壁亲水化处理：将体积分数0.5％的牛血清白蛋白溶液充满整个微流控芯片，持续浸润处理3h，晾干，即得到适用于核酸杂交检测的液滴型微流控芯片。

实施例3

一种利用液滴型微流控芯片检测核酸杂交的方法，包括以下步骤：

(1)包裹样品微液滴的形成

本实施例所用液滴型微流控芯片按照实施例2的方法制备，且所用基片为硅片。本实施例为了描述方面，将“核酸”简写为DNA。本实施例所用单链的DNA探针(DNA probe)序列为5'-/5ThioMC6-D/GTA AAACGACGGCCAG-3'，与之相对应的互补链的序列cDNA为5'-CTGGCCGTCGTTTTAC-3'。为了做对比实验，采用的非互补链ncDNA的序列是5'-CAGGAAACAGCTTGAC-3'。

为了观察双链DNA分子的形成过程，采用YBR@Green对双链DNA分子进行荧光标记，它与DNA双链作用时插入双螺旋小沟区域，在蓝色激发光作用下，发出异常强烈的绿荧光，可以通过观察荧光强度记录DNA双链分子的形成过程。在S型核酸微液滴混合结构中的A、B、C、D四个区域分别记录荧光强度，观察DNA杂交过程。将大豆油作为油相液体，DNA分子探针溶液和待检测的DNA样品作为两种水相液体。

如图1所示，从油相入口通入油相液体，将含DNA分子探针PBS溶液从水相入口1注入微流控芯片，将目标样品cDNA和DNA分子染料SYBR@Green的混合液(SYBR@Green:cDNA＝1:400)从水相入口2注射入微流控芯片。保持两路水相液体注射流速相同为10μL/h，调节油相的速度，使水相液体在微液滴形成结构被两侧的油相液体剪切成分散的微量液滴，如图2所示。统计形成的微液滴的大小和均一性，如表1所示。在两路水相流速都是10μL/h情况下，油相流体速度是80μL/h时，得到大小基本一致，单分散性好的微液滴。

表1油相流动速度与液滴大小

(2)DNA检测

为了证明本发明微流控芯片只对互补链DNA分子有传感特性，而对其他非互补链ncDNA分子没有传感特性，先做一组对照实验。

非互补链ncDNA分子检测：如图1所示，将大豆食用油作为油相液体从油相入口以50μL/h的流速注射入微流控芯片，将1μM浓度的DNA分子探针PBS溶液以10μL/h的速度从水相入口1注入微流控芯片，将1μM的ncDNA和DNA分子染料SYBR@Green的混合液(SYBR@Green:cDNA＝1:400)以10μL/h的速度从水相入口2注射入微流控芯片。水相液体在流聚焦处形成微液体后，继续向下流动，到达S型核酸微液滴混合结构，如图3所示。采用激光诱导荧光的方法观察杂交的进程，如果产生DNA分子双链，就会出现绿色荧光。如果没有DNA分子双链产生，就不会出现绿色荧光。S型核酸微液滴混合结构的A区域和D区域观察DNA分子杂化产生的荧光强度，发现基本没有荧光产生，如图4所示，可以看出本发明的微流控芯片对高浓度的非互补链DNA分子片段基本没有响应，说明对非互补链ncDNA分子没有传感特性。

对互补链cDNA分子杂交的检测：将大豆食用油作为油相液体从油相入口以50μL/h的流速注射入微流控芯片，将1μM的DNA分子探针PBS溶液以10μL/h的速度从水相入口1注射入微流控芯片，将不同浓度的互补链cDNA与SYBR@Green的混合液以10μL/h的速度从水相入口2注射入微流控芯片，当两种液体在流聚焦处交汇后，被两边的油相液体剪切成各自独立的微液滴，微液滴的体积小、比表面积大，样品混合迅速。当微液滴流动到下游S型核酸微液滴混合结构中时，DNA杂交过程不断进行，形成的双链DNA越来越多，这样荧光染料插入双链产生的荧光就会越来越强。如图5所示，在微流控芯片的A、B、C、D四个区域分别记录DNA分子杂交产生的荧光强度。通过观察微沟道中荧光强度的变化，从而观察DNA的杂交进程。从图5中可以发现A处基本没有荧光，DNA还没有开始杂交。在B处，荧光开始出现，说明DNA已经开始杂交了，在C中，荧光已经较亮；D区域，荧光图很亮，DNA杂交的量已经很多了。统计S型核酸微液滴混合结构的不同长度处，不同浓度的互补链cDNA荧光强度的变化值，如图6所示，图6中图例从上到下分别对应从下到上的曲线排列。从图6中可以看到，在S型核酸微液滴混合结构的末尾处(S形通道长度50cm)，荧光强度基本不变，达到饱和状态。在S形混合通道的末尾处设一观察点，记录不同浓度的cDNA分子杂交产生的荧光强度。图7即为不同浓度的cDNA在观察点处的杂交荧光强度。可以看到本发明微流控芯片可以检测到1pM的cDNA目标分子浓度。由于微液滴的体积小、表面积大，且在S型核酸微液滴混合结构中处在滚动涡流的状态，所以内部混合速度快，DNA分子杂交所需要的时间很短，通过计算和实验发现，DNA分子所需要的杂交时间，即在S形微通道中的驻留时间仅在2～4min左右，大大加快了DNA分子杂交进程。并且对每种浓度的目标cDNA样品，从待检cDNA分子进样到系统稳定(荧光强度稳定)下来，只需要不到10min，大大加快了实验速度，节省了时间。经120例核酸杂交检测，仅有1例没有达到预期检测效果，准确率高达99.2％，说明本发明的微流控芯片可以广泛应用于核酸检测和基因测序，是核酸杂交检测上的一大创新，经济和社会效益巨大。

实施例4

一种实施例1微流控芯片的包裹有核酸样品的微液滴形成过程的软件模拟分析过程。

为了证明本发明基于微液滴的微流控芯片在理论上的可行性，利用有限元分析软件COMSOL对微液滴的形成过程进行仿真。并根据仿真结果，优化实验参数。仿真实验条件设置如下：水相液体密度是1005Kg/m

油相和水相之间的界面张力系数由KRUSS界面张力测试仪(DSA 100Drop ShapeAnalyzer，KRUSS GmbH，Hamburg，Germany)测试得到。液体的粘度由美国TA仪器公司生产的ARES流变测试仪测定。微流通道壁是亲水性的，水相的接触角是80°。

仿真结果如图8所示。在图8A情况下，水相速度大于油相速度，很难形成微液滴，且数值不稳定，在计算的过程中，液体的界面不稳定，液体耗散严重，最后，数值溢出，不能计算出最后结果；在图8B情况下，水相速度和油相速度相等，两相流体在微通道中形成层流，水相不能被油相剪切断开。在图8C情况下，水相速度小于油相的速度，可以形成微液滴。根据仿真结果，可以得出结论：总的水相流量(两个水相入口流量之和)小于油相流量时，可以形成大小均匀的微液滴，这给实施例1～3提供了理论支撑，同时证明了本发明微流控芯片结构的合理性。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。