可介导生物大分子透皮吸收的组合剂、制备方法及应用

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，尤其涉及一种可介导生物大分子透皮吸收的组合剂、制备方法及应用。

背景技术

目前，皮肤对活性物质的吸收效率，直接决定了膏剂药物和美容产品的治疗或护肤效果。促进有效成分的皮肤吸收效率，是皮肤给药领域重点研究方向。药物通过皮肤吸收的屏障包括最外层的由死亡的表皮细胞构成的外表皮层、由半角质化的表皮细胞组成的内表皮层、表皮层下的真皮层细胞以及细胞间的紧密锚定链接。药物分子的投递，需要穿过这三层屏障才能进入真皮细胞和深层组织。

传统的膏药配方，通常会加入薄荷或辣椒油，它们有一定的改善皮肤局部微型循环的功效，但主要功能还是通过扩张毛孔和促进局部血液循环，从而提高药物分子进入皮肤效率。这种策略只是增加真皮层下物质交换速率，并未改变表皮屏障，属于增加被动扩散而促进吸收，其促吸收效果也十分有限。

目前有些膏剂的成分中会添加促进药物吸收的活性物质，被称作透皮剂。透皮剂主要作用是增加真皮层细胞的细胞膜流动性，也能起到扩张细胞间隙的作用，因此透皮剂能极大地促进真皮层吸收药物分子的效率。但是，膏剂中添加透皮剂的策略，通常只对小分子化合物的皮肤吸收具有促进作用，而对蛋白、多肽等生物大分子的皮肤吸收没有效果。即使透皮剂提高了真皮层细胞对药物的吸收效率，但是蛋白、多肽等生物大分子无法通过扩散的方式穿透表皮层(外表皮层和内表皮层)到达真皮层。

如何使蛋白、多肽等生物大分子药物穿透表皮层是亟待解决的难题。有人发明了一种微针阵列法可有效提高大分子药物的皮肤吸收，简单地将即是用均匀排布的数量众多的微针对表皮层进行物理穿透，使表皮层产生一些可以让大分子进入真皮层的孔道。

这种方法对大分子的皮肤吸收有一定的效果，但也存在缺陷。第一、促吸收效果有限：相邻微针排布的距离最多知道能达到毫米级，而皮肤细胞尺寸是微米级，物理穿透形成的药物通道数量相对于细胞数量来说远远不够，即只有孔道紧邻的真皮细胞才能接触并吸收药物，因此药物投递效果存在局限性。第二、损伤皮肤：微针破坏皮肤完整结构，这对皮肤本就是一种伤害，且在孔道愈合前众多微小的皮肤伤口直接暴露在环境中增了病原微生物感染的风险。第三、操作难度大：操作时一般是手动用微针阵列按压皮肤使产生创口，力度控制较难，力度过大微针会损伤真皮组织，可导致组织液渗出，甚至造成出血；如果按压力度过小，又会导致无法完全刺穿表皮层，而无法起到促进大分子吸收的效果。第四、制作难度大，成较高本高：微针的长度控制和精确排布工艺上有一定的难度，一方面产生较高的制造成本，另一方面因为不同人体皮肤表皮层厚度存在差异，微针长度很难做到个性化设计。微针阵列技术目前主要用于皮肤的生长因子给药，在美容行业有一定的应用。但由于存在以上缺陷，很难广泛地让使用者接受，生产和应用十分受限。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有透皮剂或相关试剂无法辅助大分子药物的吸收，导致大分子药物皮肤吸收难；同时现有大分子药物吸收试剂促吸收效果有限、损伤皮肤、操作难度大、制作难度大，成较高本高。

解决以上问题及缺陷的难度为：

皮肤的完整结构是人体维持健康的重要屏障。皮肤外表皮层的多层角质化的死细胞和内表皮层的半角质化细胞，阻隔涂抹于皮肤的生物大分子进入真皮层，而且真皮层细胞膜和致密的细胞排列进一步增加了大分子经皮肤吸收的难度，。而现有的无损伤的透皮技术仅能实现小分子和某些脂溶性分子的皮肤吸收，在不破坏皮肤的结构和屏障功能的前提下，无法实现蛋白和多肽等生物大分子的皮肤吸收。

解决以上问题及缺陷的意义为：

在对皮肤无创伤的前提下，实现生物大分子的皮肤吸收，使蛋白、多肽等分子穿透表皮层，进入真皮层，这是技术上的重大突破，可对皮肤药剂的研发产生重大的革新，对护肤品和美容产业带来新的发展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可介导生物大分子透皮吸收的组合剂、制备方法及应用。

本发明是这样实现的，一种可介导生物大分子透皮吸收的组合剂，所述可介导生物大分子透皮吸收的组合剂包含包含相互独立应用的表皮层变性溶解剂和透皮剂；

所述表皮层变性溶解剂按质量体积比由1％-2％的海藻酸和98％-99％的蛋白变性溶解剂组成；

所述透皮剂为月桂氮酮乳浊液。

进一步，所述蛋白变性溶解剂由海藻酸钠和高浓度的尿素的水溶液组成；所述海藻酸钠质量体积比为1％-2％；所述高浓度的尿素的水溶液浓度为6mol/L-8mol/L。

进一步，所述月桂氮酮乳浊液按体积比含有1.5％-2％的月桂氮酮。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述蛋白变性溶解剂的方法，所述蛋白变性溶解剂制备方法包括：

先用无菌纯净水配制6mol/L的尿素水溶液，后加入按量称取的海藻酸钠粉末，室温振荡至固体粉末完全溶解，密封低温储存。

本发明的另一目的在于提供一种所述可介导生物大分子透皮吸收的组合剂在介导生物大分子中的应用；所述应用方法包括：

步骤一，按剂量将待递送的蛋白、多肽或其他大分子配制成一定体积的水溶液于带盖容器中，后加入溶液总体积1.5％-2％的月桂氮酮，盖紧容器后手动剧烈振荡，使溶液呈现均一乳白色即可；

步骤二，采用蛋白变性溶解剂处理皮肤，10-15分钟后用清洁巾擦拭去除皮肤外表皮层；向皮肤涂抹含有1.5％-2％透皮剂的蛋白、多肽或其他大分子溶液，并用所述蛋白、多肽或其他大分子溶液维持皮肤湿润状态20分钟；

步骤三，利用清水清洗皮肤即可。

本发明的另一目的在于提供一种所述可介导生物大分子透皮吸收的组合剂在制备以蛋白质/多肽为有效成分的新型的皮肤膏剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述可介导生物大分子透皮吸收的组合剂在制备蛋白质/多肽为活性成分的护肤品中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述可介导生物大分子透皮吸收的组合剂在制备蛋白质/多肽为活性成分的美容产品中的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明表皮层变性溶解剂由2％的海藻酸和蛋白变性溶解剂组成，海藻酸作用是增加溶液粘度从而提高皮肤粘附性，蛋白变性溶解剂可以使表皮层部分变性溶解，通过控制变性溶解时间可以达到溶解去除皮肤外表皮层，保留少量内表皮层。透皮剂主要作用是增加细胞膜流动性扩大细胞之间的间隙，从而使蛋白和多肽分子能到达真皮层，并进入细胞。本发明通过降低表层厚度，并使内表皮层呈半溶解状态，使用透皮剂扩张细胞间隙并增加细胞膜流动性，此时给皮肤施用蛋白、多肽或其它药物大分子则可以高效地被皮肤真皮层细胞吸收。本发明所采用的蛋白变性溶解剂和透皮剂均为温和的药用化合物，在控制浓度、剂量和作用时间下无色无味无毒副作用。本发明采用的蛋白变性剂对表皮层的变性作用是可逆的，经水洗浓度降低后蛋白自动复性，内表皮层可恢复。本发明解决了蛋白和多肽分子难于被皮肤吸收的难题，在药物和美容产品开发领域具备极大的利用价值。

本发明采用安全的变性溶解剂溶解外表皮层表皮层，并使内表皮层处于半溶解状态，蛋白、多肽分子很容易到达真皮层，在透皮剂的作用下，蛋白、多肽分子被高效吸收。本发明与现有的技术相比解决多个难题。第一、开发出表皮层变性溶解技术，并首次与透皮剂联合使用，实现蛋白/多肽等生物大分子的透皮吸收；第二、本发明是在没有创伤情况下，提高蛋白、多肽分子皮肤透过吸收；第三、所采用的物质均为药用化合物，在使用浓度下生物安全性高，无毒副作用；第四、生产成本低，原料均为常用化合物，价格低廉；第五、操作简单，溶液配制方便，使用时涂抹即可。

本发明开发出皮肤表皮层变性溶解技术，并与透皮剂联合使用，实现生物大分子的透皮吸收。采用蛋白变性溶解剂处理皮肤一段时间，使外表皮层溶解，用清洁巾擦拭后脱落，而半角质化表皮细胞的因细胞外基质变性溶解，内表皮层细胞间的致密结构暂时被解开。此时，向皮肤涂抹含有本发明提供的透皮剂的蛋白/多肽溶液，并用此溶液维持皮肤湿润状态一段时间，蛋白/多肽分子可以自由扩散穿过内表皮层，与真皮细胞接触。在透皮剂作用下，真皮细胞膜流动性增强，真皮细胞间隙扩大，蛋白/多肽分子会被真皮层吸收，包括进入真皮细胞间隙和被真皮细胞摄取。本发明首次将表皮层变性溶解技术和透皮剂联合使用，使蛋白/多肽分子在不对皮肤产生创伤的条件下实现被皮肤真皮层吸收。

本发明的蛋白变性溶解剂主要成分为海藻酸钠和高浓度的尿素的水溶液，海藻酸钠作用是增加溶液粘度，提高变性剂在皮肤上的粘附性，高浓度的尿素作用是使表皮层蛋白成分发生可逆的变性溶解。

本发明的透皮剂的主要成分为一定浓度月桂氮酮乳浊液，其作用是在表皮层部分溶解够，进入真皮层，提高真皮层细胞膜流动性，并扩张真皮层细胞的细胞间隙。在介导蛋白/多肽分子皮肤吸收时，蛋白/多肽的水溶液中加入一定量的月桂氮酮，剧烈振荡后形成乳浊液。皮肤施用过表皮层变性溶解剂后，将此乳浊液涂于皮肤，蛋白/多肽可以被真皮层吸收。

本发明的透皮剂的主要成分为一定浓度月桂氮酮乳浊液，其作用是在表皮层部分溶解够，进入真皮层，提高真皮层细胞膜流动性，并扩张真皮层细胞的细胞间隙。在介导蛋白/多肽分子皮肤吸收时，蛋白/多肽的水溶液中加入一定量的月桂氮酮，剧烈振荡后形成乳浊液。皮肤施用过表皮层变性溶解剂后，将此乳浊液涂于皮肤，蛋白/多肽可以被真皮层吸收。

对比的技术效果或者实验效果。包括：

在对小鼠皮肤施用绿色荧光标签标记的多肽(18氨基酸)和绿色荧光蛋白的实验中，发明人用本发明介导上述多肽和蛋白分子的皮肤吸收，同时设置仅用表皮层溶解变性剂、仅用透皮剂和直接涂抹的对照。然后清洗皮肤表面，利用荧光特性观察皮肤对多肽和蛋白分子的吸收效果。如附图3、附图4、附图5所示，本发明引导多肽和蛋白分子吸收的皮肤内部呈现出较强的荧光信号，说明本发明实现了皮肤对多肽和蛋白分子高效吸收。直接涂抹上述多肽和蛋白分子，和仅用表皮层溶解变性技术后涂抹上述多肽和蛋白分子，这两组均未观察到皮肤的吸收；仅用透皮剂的皮肤可以看到微弱的吸收，但吸收效果大幅度低于本发明。

为了进一步说明本发明确实具有促进皮肤对多肽/蛋白分子的吸收作用，并排除多肽/蛋白分子在表皮层附着的可能。发明人检测了本发明介导蛋白吸收后，蛋白分子在动物体内的扩散情况。如附图6所示，本发明作用于小鼠腹部皮肤，施用干扰素α后，1小时后即可在小鼠外周血中检测到干扰素α的存在，这有力地说明了本发明确实介导了蛋白分子进入皮肤内部。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的可介导生物大分子透皮吸收的组合剂在介导生物大分子中的应用方法流程图。

图2是本发明实施例提供的皮肤组织结构图以及用于皮肤促进蛋白/多肽分子透皮吸收的机制模式图。

图3是本发明实施例提供的在小鼠鼠尾皮肤促进FITC藕联多肽的透皮吸收图。

图4是本发明实施例提供的在小鼠鼠尾皮肤促进FITC藕联多肽的透皮吸收效果示意图。

图5是本发明实施例提供的在小鼠鼠尾皮肤促进绿色荧光蛋白EGFP的透皮吸收效果。

图6是本发明实施例提供的在小鼠腹部皮肤促人干扰素α蛋白的透皮吸收后体内扩散进入血液的效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可介导生物大分子透皮吸收的组合剂，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的可介导生物大分子透皮吸收的组合剂包含表皮层变性溶解剂和透皮剂；表皮层变性溶解剂由2％的海藻酸和蛋白变性溶解剂组成。

本发明实施例提供的可介导生物大分子透皮吸收的组合剂，包含相互独立应用的表皮层变性溶解剂和透皮剂；

所述表皮层变性溶解剂按质量体积比由1％-2％的海藻酸和98％-99％的蛋白变性溶解剂组成；

所述透皮剂为月桂氮酮乳浊液。

所述蛋白变性溶解剂由海藻酸钠和高浓度的尿素的水溶液组成；所述海藻酸钠质量体积比为1％-2％；所述高浓度的尿素的水溶液浓度为6mol/L-8mol/L。

所述月桂氮酮乳浊液按体积比含有1.5％-2％的月桂氮酮。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述蛋白变性溶解剂的方法，所述蛋白变性溶解剂制备方法包括：

先用无菌纯净水配制6mol/L的尿素水溶液，后加入按量称取的海藻酸钠粉末，室温振荡至固体粉末完全溶解，密封低温储存。

如图1，本发明提供一种所述可介导生物大分子透皮吸收的组合剂在介导生物大分子中的应用；所述应用方法包括：

S101，按剂量将待递送的蛋白、多肽或其他大分子配制成一定体积的水溶液于带盖容器中，后加入溶液总体积1.5％-2％的月桂氮酮，盖紧容器后手动剧烈振荡，使溶液呈现均一乳白色即可；

S102，采用蛋白变性溶解剂处理皮肤，10-15分钟后用清洁巾擦拭去除皮肤外表皮层；向皮肤涂抹含有1.5％-2％透皮剂的蛋白、多肽或其他大分子溶液，并用所述蛋白、多肽或其他大分子溶液维持皮肤湿润状态20分钟；

S103，利用清水清洗皮肤即可。

下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。

附图2：上图：正常皮肤组织结构图，皮肤由表皮层和真皮层组成，表皮层由死亡的角质化细胞构成的外表皮层和半角质化的表皮细胞构成的内表皮层组成；含有蛋白/多肽(活性成分)的皮肤膏剂或者美容产品，涂抹于皮肤上，由于表皮层的阻隔，极少量的蛋白/多肽分子能透过表皮层，此外致密的真皮层细胞对蛋白/多肽分子的吸收能力也十分有限。下图：本发明施用于皮肤促进蛋白/多肽分子透皮吸收的机制模式图。表皮层变性溶解剂使去除外表皮层，并使内表皮层的半角质化细胞处于疏松状态；透皮剂使真皮层细胞间隙增大，细胞膜流动性增强，蛋白/多肽进入真皮层细胞间隙，并且被真皮细胞摄取。

附图3：本发明在小鼠鼠尾皮肤促进FITC藕联多肽的透皮吸收效果。本发明处理的鼠尾皮肤、无表皮层变性溶解剂对照组(仅用透皮剂)、无透皮剂对照组(仅用表皮层变性溶解剂)以及双阴性对照，分别在不同小鼠个体上的实验结果。

附图4：本发明在小鼠鼠尾皮肤促进FITC藕联多肽的透皮吸收效果。本发明处理的鼠尾皮肤、无表皮层变性溶解剂对照组(仅用透皮剂)、无透皮剂对照组(仅用表皮层变性溶解剂)以及双阴性对照，分别在同一小鼠尾部皮肤不同区域上的实验结果。

附图5：本发明在小鼠鼠尾皮肤促进绿色荧光蛋白(EGFP)的透皮吸收效果。本发明处理的鼠尾皮肤、无表皮层变性溶解剂对照组(仅用透皮剂)、无透皮剂对照组(仅用表皮层变性溶解剂)以及双阴性对照，分别在不同小鼠个体上的实验结果。

附图6：用本发明介导人干扰素α蛋白在小鼠腹部皮肤吸收后，扩散进入血液的检测效果。用本发明涂抹干扰素α蛋白于皮肤，与仅用表皮层溶解剂、仅用透皮剂和直接涂抹的对照进行比较。

实施例1：

本发明的蛋白变性溶解剂配制方法为：含2％(质量体积比)的海藻酸钠，6mol/L的尿素水溶液。先用无菌纯净水配制6mol/L的尿素水溶液，后加入按量称取的海藻酸钠粉末，室温振荡至固体粉末完全溶解，可密封低温储存。

本发明的含有透皮剂的蛋白/多肽溶液配制和使用方法为：按剂量将待递送的蛋白/多肽配制成一定体积的水溶液于带盖容器中，后加入溶液总体积2％的月桂氮酮，盖紧容器后手动剧烈振荡，使溶液呈现均一乳白色即可，现配现用。

采用蛋白变性溶解剂处理皮肤，此时表皮层逐渐溶解。10-15分钟后用清洁巾擦拭，皮肤外表皮层可随之脱落。而半角质化的内表皮细胞的因细胞外基质变性溶解，内表皮层细胞间的致密结构暂时被解开。

此时，向皮肤涂抹含有2％透皮剂的蛋白/多肽溶液，并用此溶液维持皮肤湿润状态20分钟，蛋白/多肽分子可以自由扩散穿过内表皮层，与真皮细胞接触。在透皮剂的作用下，真皮细胞间隙扩大，同时细胞膜流动性增强，蛋白/多肽等生物大分子进入真皮细胞间隙，或者被真皮细胞摄取。

之后用水简单地清洗皮肤，蛋白变性溶解剂在皮肤表面的浓度被稀释，使得蛋白质复性，内表皮层自然恢复。

实施例2：

本发明介导丝胶多肽在小鼠皮肤的透过吸收(不同个体间对比)

(1)称取3.6克尿素固体粉末(例如，国药，纯度≥99.9％)放入带盖离心管，加入8毫升的无菌去离子水，振荡至完全溶解；

(2)称取2克海藻酸钠(例如，BMC公司产)放入上述(1)中装有尿素溶液的离心管中，置于摇床上室温，振荡至固体完全溶解，后定容至10毫升，即为表皮层变性溶解剂。

(3)购买带FITC标签的丝胶多肽(购于上海生工，序列为FITC-SEDSSEVDIDLGNLG，15氨基酸)固体粉末，取1mg(分装成1mg/管)加入1毫升无菌去离子水，振荡至完全溶解。

(4)上述(3)中1毫升多肽水溶液中加入20微升氮酮(阿拉丁，药用级)，剧烈振荡至溶液呈乳白色，即为溶有多肽的透皮剂乳浊液。

(5)用麻醉剂麻醉小鼠后，用清水将小鼠尾部清洗干净并用纸巾擦干，将表皮层变性溶解剂均匀涂抹于鼠尾皮肤上，室温静置15分钟，后用纸巾将涂抹过的皮肤擦拭干净。

(6)将含有多肽的透皮剂乳浊液均匀涂抹于鼠尾皮肤上，室温静置20分钟，期间补充涂抹含有多肽的透皮剂乳浊液2次。

(7)利用无菌去离子水作为表皮层变性溶解剂作为表皮层变性溶解剂对照，用含有多肽的但不含有透皮剂的溶液作为含有多肽的透皮剂乳浊液的对照，按下表设置实验对照组小鼠。

(8)多肽的透皮剂乳浊液于鼠尾皮肤孵育20分钟后，用清水将小鼠皮肤冲洗干净，将小鼠置于荧光成像仪中观察荧光并拍照。

如附图4所示，双阴性对照组在小鼠皮肤上涂抹FITC标记丝胶多肽，结果显示该组小鼠皮肤荧光信号极弱，说明在皮肤上直接涂抹多肽几乎完全不能被皮肤吸收。本发明的处理的小鼠皮肤呈现强荧光，说明本发明有效促进了多肽的皮肤吸收。仅采用透皮剂的小鼠皮肤(无表皮层变性溶解对照)呈现微弱的荧光，说明该组小鼠皮肤能少量吸收多肽，但多肽吸收效率显著低于本发明。仅用表皮层变性溶解剂处理的小鼠皮肤(无透皮剂对照)，几乎完全无荧光信号，说明经该种处理方法的小鼠皮肤吸收多肽效率很弱。综合该实验结果显示，本发明采用的去表皮层和透皮剂联合，可介导多肽的皮肤吸收，且促多肽的皮肤吸收效率显著地大幅度高于透皮剂单独使用。(见附图3)

实施例3：

本发明介导丝胶多肽在小鼠皮肤的透过吸收(同一个体对比)。

(1)称取3.6克尿素固体粉末(例如，国药，纯度≥99.9％)放入带盖离心管，加入8毫升的无菌去离子水，振荡至完全溶解；

(2)称取2克海藻酸钠(例如，BMC公司产)放入上述(1)中装有尿素溶液的离心管中，置于摇床上室温，振荡至固体完全溶解，后定容至10毫升，即为表皮层变性溶解剂。

(3)购买带FITC标签的丝胶多肽(购于上海生工，序列为FITC-SEDSSEVDIDLGNLG，15氨基酸)固体粉末，取1mg(分装成1mg/管)加入1毫升无菌去离子水，振荡至完全溶解。

(4)上述(3)中1毫升多肽水溶液中加入20微升氮酮(阿拉丁，药用级)，剧烈振荡至溶液呈乳白色，即为溶有多肽的透皮剂乳浊液。

(5)用麻醉剂麻醉小鼠后，用清水将小鼠尾部清洗干净并用纸巾擦干，用记号笔将小鼠鼠尾皮肤划分出不同的区域。

(6)选择小鼠鼠尾皮肤某一区域，将表皮层变性溶解剂均匀涂抹于鼠尾皮肤上，室温静置15分钟，后用纸巾将涂抹过的皮肤擦拭干净。

(7)将含有多肽的透皮剂乳浊液均匀涂抹于鼠尾皮肤区域上，室温静置20分钟，期间补充涂抹含有多肽的透皮剂乳浊液2次。

(8)利用无菌去离子水作为表皮层变性溶解剂作为表皮层变性溶解剂对照，用含有多肽的但不含有透皮剂的溶液作为含有多肽的透皮剂乳浊液的对照，按下表在鼠尾皮肤不同区域设置试验对照组。

(9)多肽的透皮剂乳浊液于鼠尾皮肤孵育20分钟后，用清水将小鼠皮肤冲洗干净，将小鼠置于荧光成像仪中观察荧光并拍照。

如附图4所示，双阴性对照组在小鼠皮肤上涂抹FITC标记丝胶多肽，结果显示该组小鼠皮肤区域荧光信号极弱，说明在皮肤上直接涂抹多肽几乎完全不能被皮肤吸收。本发明的处理的鼠尾皮肤区域呈现强荧光，说明本发明有效促进了多肽的皮肤吸收。仅采用透皮剂的小鼠皮肤区域(无表皮层变性溶解对照)呈现微弱的荧光，说明该组小鼠皮肤能少量吸收多肽，但多肽吸收效率显著低于本发明。仅用表皮层变性溶解剂处理的小鼠皮肤(无透皮剂对照)区域，几乎完全无荧光信号，说明经该种处理方法的小鼠皮肤吸收多肽效率很弱。综合来说，本发明采用的去表皮层和透皮剂联合，可介导多肽的皮肤吸收，且促多肽的皮肤吸收效率显著地大幅度高于透皮剂单独使用。(见附图4)

此外附图4结果中，本发明施用于鼠尾根部的效果显著高于鼠尾远端，因鼠尾根部的温度和血流显著高于鼠尾远端，说明温度和血流丰富的皮肤上施用本发明效果更好。(见附图4)

实施例4：

本发明介导蛋白大分子在小鼠皮肤的透过吸收

(1)称取3.6克尿素固体粉末(例如，国药，纯度≥99.9％)放入带盖离心管，加入8毫升的无菌去离子水，振荡至完全溶解；

(2)称取2克海藻酸钠(例如，BMC公司产)放入上述(1)中装有尿素溶液的离心管中，置于摇床上室温，振荡至固体完全溶解，后定容至10毫升，即为表皮层变性溶解剂。

(3)取绿色荧光蛋白EGFP，用无菌去离子水配制成1毫克每毫升。

(4)上述(3)中1毫升EGFP水溶液中加入20微升氮酮(阿拉丁，药用级)，剧烈振荡至溶液呈乳白色，即为溶有多肽的透皮剂乳浊液。

(5)用麻醉剂麻醉小鼠后，用清水将小鼠尾部清洗干净并用纸巾擦干，将表皮层变性溶解剂均匀涂抹于鼠尾皮肤上，室温静置15分钟，后用纸巾将涂抹过的皮肤擦拭干净。

(6)将含有多肽的透皮剂乳浊液均匀涂抹于鼠尾皮肤上，室温静置20分钟，期间补充涂抹含有多肽的透皮剂乳浊液2次。

(7)利用无菌去离子水作为表皮层变性溶解剂作为表皮层变性溶解剂对照，用含有EGFP但不含有透皮剂的溶液作为含有EGFP的透皮剂乳浊液的对照，按下表设置实验对照组小鼠。

(8)多肽的透皮剂乳浊液于鼠尾皮肤孵育20分钟后，用清水将小鼠皮肤冲洗干净，将小鼠置于荧光成像仪中观察荧光并拍照。

如附图5所示，双阴性对照组在小鼠皮肤上涂抹绿色荧光蛋白，结果显示该组小鼠皮肤荧光信号极弱，说明在皮肤上直接涂抹蛋白几乎完全不能被皮肤吸收。本发明的处理的小鼠皮肤呈现强荧光，说明本发明有效促进了绿色荧光蛋白的皮肤吸收。仅采用透皮剂的小鼠皮肤(无表皮层变性溶解对照)呈现微弱的荧光，说明该组小鼠皮肤能少量吸收绿色荧光蛋白，但绿色荧光蛋白吸收效率显著低于本发明。仅用表皮层变性溶解剂处理的小鼠皮肤(无透皮剂对照)，几乎完全无荧光信号，说明经该种处理方法的小鼠皮肤吸收蛋白效率很弱。综合该实验结果显示，本发明采用的去表皮层和透皮剂联合，可介导蛋白的皮肤吸收，且促蛋白的皮肤吸收效率显著地大幅度高于透皮剂单独使用。(见附图5)

实施例5本发明介导丝胶蛋白在人皮肤的透过吸收

(1)称取3.6克尿素固体粉末(例如，国药，纯度≥99.9％)放入带盖离心管，加入8毫升的无菌去离子水，振荡至完全溶解；

(2)称取2克海藻酸钠(例如，BMC公司产)放入上述(1)中装有尿素溶液的离心管中，置于摇床上室温，振荡至固体完全溶解，后定容至10毫升，即为表皮层变性溶解剂。

(3)取提取好的丝胶蛋白，用无菌去离子水配制成1毫克每毫升。

(4)上述(3)中10毫升丝胶蛋白水溶液中加入20微升氮酮(阿拉丁，药用级)，剧烈振荡至溶液呈乳白色，即为溶有多肽的透皮剂乳浊液。

(5)洁面乳或香皂清洗人手背或面部皮肤并用纸巾擦干，将表皮层变性溶解剂均匀涂抹于人皮肤上，室温静置15分钟，后用纸巾将涂抹过的皮肤擦拭干净。

(6)将含有丝胶蛋白的透皮剂乳浊液均匀涂抹于人皮肤上，室温静置20分钟，期间补充涂抹含有多肽的透皮剂乳浊液2次。

(7)丝胶蛋白的透皮剂乳浊液于鼠尾皮肤孵育20分钟后，用清水将皮肤冲洗干净。

实施例6本发明介导重组人干扰素α蛋白在皮肤吸收后进入血液

(1)称取3.6克尿素固体粉末(例如，国药，纯度≥99.9％)放入带盖离心管，加入8毫升的无菌去离子水，振荡至完全溶解；

(2)称取2克海藻酸钠(例如，BMC公司产)放入上述(1)中装有尿素溶液的离心管中，置于摇床上室温，振荡至固体完全溶解，后定容至10毫升，即为表皮层变性溶解剂。

(3)购买重组人干扰素α蛋白(安福隆，天津未名生物医药有限公司)，取适量药剂用无菌去离子水稀释至干扰素α蛋白浓度为100ug/mL。

(4)上述(3)中每1毫升蛋白溶液中加入20微升氮酮(阿拉丁，药用级)，剧烈振荡至溶液呈乳白色，即为溶有蛋白的透皮剂乳浊液。

(5)用麻醉剂麻醉小鼠后，用剪刀尽量剪除腹部的鼠毛，用清水和棉球将小鼠腹部清洗干净，并用纸巾擦干。

(6)将表皮层变性溶解剂均匀涂抹于鼠腹部皮肤上，室温静置15分钟，后用纸巾将涂抹过的皮肤擦拭干净。

(7)取含有蛋白的透皮剂乳浊液均匀涂抹于鼠腹部皮肤上，室温静置20分钟，期间补充涂抹含有多肽的透皮剂乳浊液2次，总共涂抹约100微升。

(8)利用无菌去离子水作为表皮层变性溶解剂作为表皮层变性溶解剂对照，用含有多肽的但不含有透皮剂的溶液作为含有多肽的透皮剂乳浊液的对照，按下表在鼠尾皮肤不同区域设置试验对照组。

(9)用清水将小鼠皮肤冲洗干净后，0.5，1，2，4小时对小鼠眼眶采血约0.1毫升。

(10)4摄氏度静置过夜，3000rpm离心取血清，用人干扰素αELISA检测试剂盒检测小鼠血清中干扰素α含量。

如附图6所示，用本发明涂抹干扰素α蛋白于皮肤，1小时内可以在血清中检测到低浓度的干扰素α蛋白，说明本发明确实可以使蛋白分子进入皮肤内部组织，而且可以在体内扩散。与仅用表皮层溶解剂、仅用透皮剂和直接涂抹的对照相比，本发明优势明显。(见附图6)

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。