一种皮肤衰老蛋白标记物-ANT3蛋白及其无创法提取方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种皮肤衰老蛋白标记物-ANT3蛋白及其无创法提取方法。

背景技术

随着人体年龄的增长，皮肤出现衰老，皮肤衰老严重就显得年龄很大，任何人都不愿意看到自己比同龄人更苍老，因此美容或者医学美容越来越受到人们的关注。正确判断皮肤的衰老程度以及判断皮肤衰老的生理年龄是否与实际年龄相符，是美容或者医学美容的前提。只有找到年龄增长导致皮肤衰老加速的内在根源，才能为美容或者医学美容提供方向。

SERPINC1基因位于1q23-25.1，跨越13.4kbp，包含7个外显子。该基因编码的抗凝血酶Ⅲ属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，ATⅢ的生理活性是能灭活凝血酶和Xa因子，同时对因子IXa、XIa、XIIa、VIIa也有一定的作用。

目前没有将SERPINC1用于辅助判断皮肤衰老程度的先例。

发明内容

本发明的目的是提供SERPINC1(ANT3蛋白)在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明提供了用于检测SERPINC1含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断衰老程度。

本发明提供了用于检测SERPINC1含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断皮肤衰老程度。

所述用于检测SERPINC1含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述用于检测SERPINC1含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。具体可为胶贴，更具体地，该胶贴可以为3M胶。

以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明还保护一种产品，包括用于检测SERPINC1含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)辅助判断衰老程度；

(b)辅助判断皮肤衰老程度。

所述产品中，所述用于检测SERPINC1含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述产品中，所述用于检测SERPINC1含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。具体可为胶贴，更具体地，该胶贴可以为3M胶。

所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者表皮皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中SERPINC1含量；

3)将步骤2)测得的SERPINC1含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的 SERPINC1含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度。

还可进一步包括4)将步骤2)测得的SERPINC1含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄，

若受试者的皮肤衰老程度较快，或受试者皮肤生理年龄大于其实际年龄，则采用相应的干预措施，延缓皮肤衰老，达到美容的效果。

本发明还提供一种辅助判断衰老程度的系统。

本发明所提供的辅助判断衰老程度的系统，可包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中 SERPINC1含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量数据或所述数据存储模块被配置为存储各年龄段正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中SERPINC1含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中SERPINC1含量数据与数据存储模块中存储的各年龄段正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否大于其实际年龄，并输出判定结果。

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括检测受试者皮肤样本中SERPINC1含量的仪器，所述仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪；

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括用于获取受试者表皮皮肤样本的物质。具体说，该物质为胶贴，更具体地，该胶贴可以为3M胶。

本发明提供的辅助判断皮肤衰老程度的方法，包括以下步骤：

1)用胶贴贴在皮肤表面，然后撕下，获得受试者表皮皮肤样本；该步骤具体为用3M胶贴在受试者前臂曲侧部位，然后轻轻撕下胶贴，保证不对受试者皮肤造成伤害，仅仅沾下受试者皮肤表面的脱落层；

2)检测所得受试者皮肤样本中SERPINC1含量；

3)将步骤2)测得的SERPINC1含量与受试者年龄相同的正常人皮肤中的 SERPINC1含量值进行比较，根据比较结果，判断受试者的皮肤衰老程度；

或4)将步骤2)测得的SERPINC1含量与各年龄段正常人皮肤中的SERPINC1 含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄；

受试者皮肤中SERPINC1含量高于正常人皮肤中SERPINC1含量的，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年老；受试者皮肤中SERPINC1含量低于正常人皮肤中 SERPINC1含量的，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年轻。

本发明提供一种无创获得皮肤中SERPINC1的方法，包括：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品。

本发明还进一步提供一种表皮皮肤样本中SERPINC1基于质谱的相对含量的测定方法，包括如下步骤：(1)受试者表皮皮肤样本取样：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴片，得到胶带状皮肤样品；

(2)干燥的肽段样品的获得：1)将胶带状皮肤样品切成小块，沉积在玻璃板上在转移到离心管；

2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟，然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜；

3)在离心力25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT 在56℃的水浴中放置1小时；

4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟，得到最终的蛋白质溶液上清液；蛋白质浓度使用Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控；每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时；随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时；水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

(3)检测

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样；通过UHPLC进行分离；样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装 C18柱串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B；纳升液相分离末端直接连接质谱仪；

DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC 设置为：一级3E6，二级1E5；

DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF模式检测；主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集；离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测；动态排除时间设定为30s；AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

本发明通过检测各年龄人皮肤中SERPINC1的含量，发现随着年龄的增长，SERPINC1表达上调，由此辅助判断皮肤衰老程度，在皮肤老化外在表现出现前提前干预皮肤衰老，有效延缓衰老。该方法简单易行，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为检测得到的SERPINC1的特征肽段(EQLQDMGLVDLFSPEK)的质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供SERPINC1在辅助判断衰老程度中的应用。

本发明提供了用于检测SERPINC1含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断衰老程度。

本发明提供了用于检测SERPINC1含量的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为辅助判断皮肤衰老程度。

所述用于检测SERPINC1含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述用于检测SERPINC1含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒或芯片。

本发明还保护一种产品，包括用于检测SERPINC1含量的物质；所述产品的功能为如下(a)或(b)：

(a)辅助判断衰老程度；

(b)辅助判断皮肤衰老程度。

所述产品中，所述用于检测SERPINC1含量的物质具体可为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；更具体可为轨道阱高分辨率质谱仪。

所述产品中，所述用于检测SERPINC1含量的物质还包括从皮肤表面取样所用的物质。

所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：

1)取受试者皮肤样本；

2)检测所得受试者皮肤样本中SERPINC1含量；

3)将步骤2)测得的SERPINC1含量与该年龄段正常衰老的人员皮肤中的 SERPINC1含量值进行比较，根据比较结果，辅助判断受试者的皮肤衰老程度。

还可进一步包括4)将步骤2)测得的SERPINC1含量与各年龄段正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量标准曲线进行比较，根据比较结果，判断受试者皮肤的生理年龄，

若受试者的皮肤衰老程度较快，或受试者皮肤生理年龄大于其实际年龄，则采用相应的干预措施，延缓皮肤衰老，达到美容的效果。

本发明还提供一种辅助判断衰老程度的系统。

本发明所提供的辅助判断衰老程度的系统，可包括如下模块：

(1)数据接收模块；所述数据接收模块被配置为接收受试者皮肤样本中 SERPINC1含量数据；

(2)数据存储模块：所述数据存储模块被配置为存储与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量数据或所述数据存储模块被配置为存储各年龄段正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量标准曲线；

(3)数据比较模块：所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中SERPINC1含量数据与数据存储模块中存储的与受试者年龄段一致的正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量数据进行比较；或所述数据比较模块被配置为将数据接收模块接受到的受试者皮肤样本中SERPINC1含量数据与数据存储模块中存储的各年龄段正常衰老的人员皮肤中的SERPINC1含量标准曲线进行比较；

(4)判断模块；所述判断模块被配置为接收由所述数据比较模块发送的比较结果，并对比较结果进行判定，判定受试者的皮肤衰老程度，或判定受试者皮肤生理年龄是否大于其实际年龄，并输出判定结果。

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括检测受试者皮肤样本中SERPINC1含量的仪器，所述仪器具体可为轨道阱高分辨率质谱仪；

上述辅助判断衰老程度的系统还进一步包括用于获取受试者皮肤样本的物质。

实施例

以生活环境比较接近、身体健康的人群为样本，无创法进行前臂曲侧部位皮肤样本取样(用3M胶粘皮取样)。

本发明对受试者皮肤样本中不同蛋白质含量的测定方法，按照如下步骤：

(1)高效液相

样品的获得：将3M医用胶贴贴于前臂曲侧部位，排除光老化因素。(3M医用胶贴为2.4cm，生产厂家：3M Health Care 3M Brookings.)，1分钟后，轻轻揭下3M胶贴，保证受试者的皮肤没有损伤，得到胶带状皮肤样品；

(1)将胶带状皮肤样品切成小块(0.5x 0.5厘米)用无菌刀片并沉积在玻璃板上再转移到1.5毫升离心管之前；(2)添加不含SDS的适量裂解缓冲液样品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分钟。然后，添加10mM DTT，将样品浸泡过夜。 (3)以下在25,000g，4℃下离心15分钟，回收上清液并用10mM处理DTT在56 ℃的水浴中放置1小时；(4)然后用55mM IAM处理，在室温黑暗中孵育45分钟，并在25,000g，4℃下离心15分钟以得到最终的蛋白质溶液上清液。蛋白质浓度使用 Bradford方法进行测量，提取的蛋白质通过12％的SDS-PAGE进行质控(包括蛋白提取是否充分，有无降解及定量预估)。为了进行蛋白水解，每份样品取100μg蛋白质，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小时(蛋白质：酶之比＝40：1)。随后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小时。水解产物使用Strata X色谱柱对多肽进行脱盐并在真空下干燥，即得到干燥的肽段样品；

将干燥的肽段样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20,000g离心10分钟后，取上清进样。通过Thermo公司UltiMate 3000UHPLC进行分离。样品首先进入trap 柱富集并除盐，随后与自装C18柱(150μm内径，1.8μm柱料粒径，25cm柱长)串联，以500nl/min流速通过如下有效梯度进行：

分离：0-5min，5％流动相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流动相B从5％线性升至35％；160-170min，流动相B从35％升至80％；170-175min，80％流动相B； 176-180min，5％流动相B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪。

(2)DDA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific，San Jose,CA)进行DDA(data-dependent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为60,000；二级质谱起始m/z固定为100；分辨率15,000。二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2+到7+，峰强度超过10,000的强度排在前20的母离子。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

(3)DIA质谱检测

经过液相分离的肽段通过nanoESI源离子化后进口到串联质谱仪Q-Exactive HF(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DIA(data-independent acquisition)模式检测。主要参数设置：离子源电压设置为1.6kV；一级质谱扫描范围350～1500m/z；分辨率设置为120,000；将350-1500Da均分为40个窗口进行碎裂及信号采集。离子碎裂模式为HCD，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为30s。AGC设置为：一级3E6，二级1E5。

图1为检测得到的SERPINC1的特征肽段(EQLQDMGLVDLFSPEK)的质谱图。

受试者皮肤样本中SERPINC1相对含量数据如下：

由上表中数据可以看出，随着年龄的增长，受试者皮肤样本中SERPINC1相对含量增加。

在实际应用中，首先采集数量上有统计学意义的各个年龄正常人的皮肤为样本，分别测定各皮肤样本中SERPINC1相对含量，绘制年龄-SERPINC1相对含量标准曲线，再测定受试者皮肤样本中的SERPINC1相对含量，与标准曲线比较，判定受试者的皮肤衰老程度，即可。也可以是对某个特定年龄的人群进行操作。比如要为某个城市中40岁的人群进行服务，那么首先采集数量上有统计学意义的这个城市生活的40 岁正常人的皮肤样本，测定各皮肤样本中SERPINC1相对含量，并且取得平均值。这个平均值，就是一个衡量受试者皮肤衰老程度的阈值，当有受试者来进行评估的时候，采用与获得阈值相同的方法测量去皮肤中SERPINC1的含量，当SERPINC1的含量低于阈值的时候，说明该受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年轻；受试者皮肤中 SERPINC1含量高于阈值的时候，判定受试者皮肤的生理年龄比实际年龄年老。

至于说怎样测量皮肤中SERPINC1的含量，除了本实施例中质谱的方法以外，其余的任何能够测定蛋白的绝对和相对含量的方法，比如抗原抗体结合法等，都是可以的，并且应受到本发明的保护。

除了皮肤以外，SERPINC1的含量，也可作为辅助判断人整体衰老程度的指标。

Gene:SERPINC1

Protein:Antithrombin-III

MYSNVIGTVTSGKRKVYLLSLLLIGFWDCVTCHGSPVDICTAKPRDIPMNPMCIYRSPEK KATEDEGSEQKIPEATNRRVWELSKANSRFATTFYQHLADSKNDNDNIFLSPLSISTAFA MTKLGACNDTLQQLMEVFKFDTISEKTSDQIHFFFAKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFG DKSLTFNETYQDISELVYGAKLQPLDFKENAEQSRAAINKWVSNKTEGRITDVIPSEAIN ELTVLVLVNTIYFKGLWKSKFSPENTRKELFYKADGESCSASMMYQEGKFRYRRVAEGTQ VLELPFKGDDITMVLILPKPEKSLAKVEKELTPEVLQEWLDELEEMMLVVHMPRFRIEDG FSLKEQLQDMGLVDLFSPEKSKLPGIVAEGRDDLYVSDAFHKAFLEVNEEGSEAAASTAV VIAGRSLNPNRVTFKANRPFLVFIREVPLNTIIFMGRVANPCVK 。

SEQUENCE LISTING

<110> 杨森

<120> 一种皮肤衰老蛋白标记物—ANT3蛋白及其无创法提取方法

<130> GNCAQ211032

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Tyr Ser Asn Val Ile Gly Thr Val Thr Ser Gly Lys Arg Lys Val

1 5 10 15

Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Leu Ile Gly Phe Trp Asp Cys Val Thr Cys

20 25 30

His Gly Ser Pro Val Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp Ile Pro

35 40 45

Met Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu

50 55 60

Asp Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val

65 70 75 80

Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gln

85 90 95

His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser Pro

100 105 110

Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn

115 120 125

Asp Thr Leu Gln Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile Ser

130 135 140

Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys

145 150 155 160

Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn

165 170 175

Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gln Asp

180 185 190

Ile Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe Lys

195 200 205

Glu Asn Ala Glu Gln Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn

210 215 220

Lys Thr Glu Gly Arg Ile Thr Asp Val Ile Pro Ser Glu Ala Ile Asn

225 230 235 240

Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly Leu

245 250 255

Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr

260 265 270

Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gln Glu Gly

275 280 285

Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu Leu

290 295 300

Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys Pro

305 310 315 320

Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu

325 330 335

Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met

340 345 350

Pro Arg Phe Arg Ile Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu Gln

355 360 365

Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro

370 375 380

Gly Ile Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe

385 390 395 400

His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala

405 410 415

Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val

420 425 430

Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile Arg Glu Val Pro

435 440 445

Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys

450 455 460